СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ CHLAMYDIA SPP., CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE И ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗООНОЗНЫХ ХЛАМИДИОЗОВ Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/68 G01N33/569 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae.

Известен способ диагностики видов семейства Chlamydiaceae, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-time ПЦР), включающий: выделение ДНК возбудителя, амплификацию и одновременное детектирование хламидийной ДНК с использованием семейственно-специфических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов. В одном из существующих на данный момент методов диагностики хламидиозов, основанных на Real-time ПЦР, детектирование хламидийной ДНК осуществляется с помощью праймеров к гену 23S рРНК и универсального для всех видов Chlamydiaceae TaqMan зонда, который содержит флуорофор на 5’-конце и гаситель на 3’-конце; связывание этого зонда с ампликоном и последующее расщепление за счет 5’-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы сопровождается нарастанием флуоресценции (5’-экзонуклеазный метод) (Everett, К.D.Е., Hornung, L.J. and Andersen, A.A. 1999. Rapid Detection of the Chlamydiaceae and Other Families in the Order Chlamydiales: Three PCR Tests. J. Clin. Microbiol. 37; 575-580).

Основные недостатки этого способа

1. Не позволяет дифференцировать виды внутри семейства Chlamydiaceae.

2. Не предусматривает возможность использования внутреннего стандарта для выявления ложноотрицательных результатов ПЦР вследствие ингибирования.

Сущность предлагаемого способа состоит в том, что осуществляют выделение ДНК возбудителя, и мультиплексную ПЦР в режиме реального времени с единой парой праймеров СМ1: 5’-CAG-GAC-ATC-TTG-TCT-GGC-TT-3’ и СМ2: 5’-CAA-GGA-TCG-CAA-GGA-TCT-CC-3’ к 5’-концевому фрагменту гена отр1 и четырьмя зондами, содержащими различные флуоресцентные метки для дифференциального детектирования Chlamydia spp. (JOE-меченный зонд), Chlamydophila pneumoniae (ROX-меченный зонд), возбудителей зоонозных инфекций: Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis (Су5-меченный зонд) и внутреннего стандарта ПЦР (FAM-меченный зонд); при этом о наличии в исследуемом образце ДНК одного или нескольких из перечисленных возбудителей судят по нарастанию флуоресценции соответствующих флуорофоров в последовательных циклах амплификации.

Внутренний стандарт (ВС), применяемый для контроля ингибирования ПЦР, представляет собой фрагмент ДНК фага λ, фланкированный участками связывания праймеров СМ1 и СМ2 и клонированный в плазмидный вектор pCR2.1. Используемые зонды удовлетворяют следующим требованиям:

1) 100% консервативность участков связывания во всех известных последовательностях отр1 внутри каждой группы детектируемых видов;

2) специфичность последовательностей для детектируемых видов;

3) G/C-насыщенность от 35 до 48%;

4) длина от 23 до 29 нуклеотидов;

5) отсутствие G на 5’-конце;

6) большее содержание С по сравнению с G;

7) отсутствие 4 последовательно расположенных G;

8) не более двух G/C на 3’-конце;

9) температура плавления зондов на 7-8°С выше температуры плавления праймеров;

10) отсутствие участков, формирующих нежелательные вторичные структуры или допускающих комплиментарное связывание зондов друг с другом и с праймерами.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из клинического материала (моча, кровь, урогенитальные и респираторные мазки, образцы тканей) осуществляют с помощью набора “ДНК-сорб-В-30” (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводят амплификацию фрагмента гена отр1.

Для амплификации используют системы ПЦР в режиме реального времени, позволяющие осуществлять мультиплексное детектирование следующих флуорофоров: FAM; JOE; ROX и Су-5. ПЦР смесь объемом 25 мкл содержит: 0,5 мкМ каждого праймера, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 единицы Taq-полимеразы, 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0), 50 мМ КСl, 6,0 мМ MgCl₂, 0,2 мкМ каждого зонда (Таб.), 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 5 мкл исследуемого образца. Для контроля ингибирования в реакционную смесь также вносят 600 копий внутреннего стандарта (ВС). Горячий старт ПЦР обеспечивается благодаря механическому разделению компонентов смеси. Амплификацию проводят с использованием системы Rotor-Gene 2000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: 83°С - 6 мин, 95°С - 20 с, затем 50 циклов: 95°С - 25 с, 68°С - 40 с. Флуоресцентный сигнал регистрируется на каналах FAM (коэффициент усиления 6), JOE (коэффициент усиления 7), ROX (коэффициент усиления 7) и Су-5 (коэффициент усиления 7) в конце каждого цикла. Экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала на одном из каналов выше установленного порогового уровня связано с расщеплением соответствующего зонда за счет 5’-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы и свидетельствует о накоплении целевого фрагмента ПЦР. Соотношение полученного значения С_T (пороговый цикл) и С_T внутреннего стандарта позволяет рассчитать начальную концентрацию хламидийной ДНК в исследуемом образце с помощью стандартной кривой разведении. Специфическое связывание каждого из зондов с ДНК-мишенью и отсутствие перекрывания флуоресцентных сигналов на каждом из каналов детектирования обеспечивают возможность дифференциальной диагностики Chlamydia spp., C.pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов (C.psittaci, C.abortus, С.fells).

Пример 1. Пациентка В., 25 лет, поступила в кожно-венерический диспансер с жалобами на выделения из влагалища и тянущую боль внизу живота. Общее состояние пациентки оценивалось как удовлетворительное. При осмотре вокруг наружного отверстия шеечного канала были отмечены эрозии, а из канала вытекали слизисто-гнойные выделения. У пациентки был взят соскоб из цервикального канала. Окрашивание мазка флуоресцентно-мечеными антителами к С.trachomatis выявило специфические антигены. При исследовании образца с помощью ПЦР в режиме реального времени с семейственно-специфическими праймерами СМ1 и СМ2 к отр1 и флуоресцентными зондами обнаружено нарастание флуоресценции JOE (λem 548 нм), свидетельствующее о наличии ДНК С. trachomatis.

Пример 2. С целью определения видовой принадлежности и паспортизации в лабораторию предоставлены частично очищенные элементарные тельца хламидийных изолятов "ПП-87" и "КС-93", выделенные из плаценты песца и паренхиматозных органов абортированного плода собаки, соответственно. Согласно литературным данным два вида хламидий: C.abortus и С.ресоrum, являются патогенными для животных сем. Canidae. Для идентификации хламидийных изолятов использовали метод ПЦР в режиме реального времени с семейственно-специфическими праймерами СМ1 и СМ2 и флуоресцентными зондами. На основании проведенного анализа был сделан вывод о принадлежности штаммов "ПП-87" и "КС-93" к виду C.abortus. Идентификация подтверждена результатами прямого секвенирования ПЦР-продуктов.

В модельных экспериментах по оценке аналитической чувствительности метода с использованием разведений хламидийной ДНК показано, что нижний предел обнаружения любого из перечисленных видов хламидий в присутствии избыточного количества ДНК человека (200 нг) и 600 копий ДНК ВС составляет не менее 2 геном-эквивалентов на реакцию. При этом неспецифическая амплификация отсутствует.

Для оценки клинической чувствительности и специфичности проведен параллельный анализ 219 урогенитальных образцов с помощью предложенного метода и коммерческой ПЦР-тест-системы "Амплисенс Chlamydia trachomatis" (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) с праймерами к криптической плазмиде. Четыре образца не могли быть проанализированы с помощью предложенного метода в связи с наличием в них компонентов, ингибирующих ПЦР. Для оставшихся 215 образцов результаты тестирования с применением обоих вышеуказанных методов совпали: ДНК С.trachomatis выявлена в 41 образце, 174 - оказались отрицательными.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики возбудителей семейства Chlamydiaceae с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени обеспечивает следующие преимущества.

1. Позволяет осуществлять одновременное детектирование и дифференциацию всех патогенных для человека видов хламидий: С.trachomatis, С.рnеumоniае и возбудителей зоонозных инфекций (C.psittaci, C.abortus, C.felis).

2. Может использоваться для дифференциальной диагностики видов Chlamydiaceae, вызывающих заболевания животных, за исключением Chlamydophila pecorum и Chlamydophila caviae.

3. Благодаря высокой чувствительности и специфичности может использоваться не только для анализа культивированных штаммов, но и для прямой диагностики в образцах клинического материала, полученного от человека и животных.

4. Позволяет снизить риск контаминации продуктами ПЦР и получения ложноположительных результатов за счет отсутствия этапа электрофоретического анализа ПЦР-продуктов.

5. Дает возможность полуколичественной оценки хламидийной ДНК в исследуемых образцах.

6. Позволяет снизить трудозатраты и время анализа.

Изобретение относится к области медицины и биологии. Предложен способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae. Способ предусматривает выделение ДНК возбудителя из клинического материала. Далее проводят амплификацию ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. При этом проводят мультиплексную ПЦР с единой парой праймеров СМ1: 5’-CAG-GAC-ATC-TTG-TCT-GGC-TT-3’ и СМ2: 5’-CAA-GGA-TCG-CAA-GGA-TCT-CC-3’ к 5’-концевому фрагменту гена ompl и четырьмя зондами: 5’-JOE-ATCCTGCTGAACCAAGCCTTATGAT-3’-BHQ1 для Chlamydia spp., 5’-ROX-ACCCTTCTGATCCAAGCTTATTAATTGAT-3’-BHQ2 для C.pneumoniae, 5’-Cy5-CCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATG-3’-BHQ3 для C.psittaci, C.abortus, C.felis и 5’-FAM-CGGAACGATGCCATTCTGCTTAT-3’-BHQ1 для внутреннего стандарта ПЦР. О наличии в исследуемом образце ДНК одного или нескольких из перечисленных возбудителей судят по нарастанию флуоресценции соответствующих флуорофоров в последовательных циклах амплификации. Предложенный способ позволяет осуществлять одновременное детектирование и дифференциацию всех патогенных для человека видов хламидий С. trachomatis, C.pneumoniae и возбудителей зоонозных инфекций C.psittaci, C.abortus и С.felis, а также снизить риск контаминации продуктами ПЦР и получения ложноположительных результатов за счет отсутствия этапа электрофоретического анализа ПЦР-продуктов, что позволяет снизить трудозатраты и время анализа. 1 табл.

Способ дифференциальной диагностики Chlamydia spp., Chlamydophila pneumoniae и возбудителей зоонозных хламидиозов Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus и Chlamydophila felis, включающий выделение и амплификацию ДНК возбудителя с помощью ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем, что проводят мультиплексную ПЦР с единой парой праймеров СМ1: 5’-CAG-GAC-ATC-TTG-TCT-GGC-TT-3’ и СМ2: 5’-CAA-GGA-TCG-CAA-GGA-TCT-CC-3’ к 5’-концевому фрагменту гена оmpl и четырьмя зондами: 5’-JOE-ATCCTGCTGAACCAAGCCTTATGAT-3’-BHQ1 для Chlamydia spp., 5’-ROX-ACCCTTCTGATCCAAGCTTATTAATTGAT-3’-BHQ2 для C.pneumoniae, 5’-Cy5-CCAGCTGAACCAAGTTTATTAATCGATG-3’-BHQ3 для C.psittaci, C.abortus, C.felis и 5’-FAM-CGGAACGATGCCATTCTGCTTAT-3’-BHQ1 для внутреннего стандарта ПЦР, при этом о наличии в исследуемом образце ДНК одного или нескольких из перечисленных возбудителей судят по нарастанию флуоресценции соответствующих флуорофоров в последовательных циклах амплификации.