СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ CHLAMYDIA PSITTACI СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1999 года по МПК C07K14/295 G01N33/569 A61K39/118 

Изобретение относится к области вирусологии, молекулярной биологии, ветеринарии и может быть использовано в ветеринарных и научно-исследовательских лабораториях для обнаружения и идентификации C.psittaci в организме инфицированных сельскохозяйственных животных, а также в продуктах и сырье животного происхождения.

В настоящее время род Сhlamydia, представленный облигатными внутриклеточными паразитами, размножающимися во внутрицитоплазматической вакуоли клетки-хозяина, включает три вида: trachomatis, psittaci и pneumoniae, состоящие в свою очередь из множества штаммов и серовариантов. Часть из них вызывает генерализованную инфекцию у различных хозяев, другие преимущественно локальные поражения отдельных органов и систем организма. Вид psittaci обуславливает заболевания сельскохозяйственных животных хламидиозами.

Для хламидий весьма характерна длительная персистенция в организме хозяина, потенциально опасная в плане возникновения неконтролируемых реактиваций инфекции. Кроме того, в период персистенции хламидии представлены в основном Л-формами /Прозоровский С.В, Бескина С.Р. и др., 1979; Beatty W.L. Morrison R.P., Byrne G.S., 1994/. Последние не обнаруживаются иммунохимическими методами, вследствие чего диагностика и контроль за ходом лечения больного животного весьма затруднены. В связи с этим разработка способов своевременной и точной верификации возбудителя хламидиозов в биологическим материале представляется крайне необходимой.

На сегодняшний день известно множество способов выявления хламидий в биологическом материале. Однако ни один из них полностью не удовлетворяет потребности практической ветеринарии. Поскольку хламидии способны находиться долгое время внутри клетки в состоянии персистирующей инфекции, а также из-за антигенного родства хламидий с другими микроорганизмами и тканевыми элементами макроорганизмов, велика вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Среди предложенных методов наиболее перспективными считаются методы молекулярной биологии с использованием рекомбинантных молекул ДНК и в последующем создание на их основе диагностических праймеров для полимеразной цепной реакции /ПЦР/, а также гибридизации ДНК на капроновых и нитроцеллюлозных фильтрах.

Ряд авторов /Тагиева Н.Е., Ломоносов М.Ю., и др., 1993/ метод локальной амплификации нуклеиновых кислот /ПЦР/ применили для выявления ДНК вируса гепатита у человека. Обухов И.Л. и др., /1994/ сообщили о получении олигонуклеотидного праймера, выбранного на основании последовательности гена, кодирующего основной белок наружной мембраны /МОМР/ возбудителя орнитоза. Однако, этот метод не может находить широкое применение, тем более универсальное с целью выявления хламидий в организме сельскохозяйственных животных, из-за низкой степени точности обнаружения хламидийных заражений вследствие генетической неоднородности геномной ДНК у различных представителей рода Chlamydia /Шаткин А.А., 1979; Campbell D.et al., 1987/.

Недавно Sayada G. , Denamur E., Orfill G./1991/.Frost et al., /1993/, Pecharatana S., Pichetm., Watt R./ 1993/ предложили применение синтетических олигонуклеотидных праймеров гомологичных фрагменту ДНК C.trachomatis. Однако реакция с указанными праймерами специфична только для выявления хладимий, относящихся к виду trachomatis. К недостаткам вышеприведенных в качестве аналогов методов также следует отнести и то, что ПЦР требует дорогостоящих качественных реактивов, оборудования, высокой квалификации и опыта персонала. Хотя реакция обладает высокой чувствительностью, интерпретация результатов часто бывает затруднена из-за повышенной требовательности к качеству реактивов и тщательности проведения исследований. Кроме того, с помощью ПЦР не удается получить информацию о множественности инфекции, что особенно важно в начальных стадиях развития заболевания и латентном его течении.

Целью предлагаемого изобретения является повышение специфичности, чувствительности способа диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных и определение множественности инфекции.

Поставленная цель достигается применением метода ДНК-ДНК гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах для обнаружения C.psittacic использованием высокочувствительного, специфичного ДНК-зонда на основе рекомбинантной плазмиды pCP-III.

Сущность изобретения состоит в том, что получена рекомбинантная плазмида pCP-III путем рестрикции ферментами Bam HI и Hind III хромосомной ДНК C. psittaci и лигирования полученных фрагментов с вектором pBR 322, линеаризованным по сайту Bam HI, которая была использована в качестве специфичного ДНК-зонда в реакции ДНК-ДНК гибридизации для обнаружения хламидий у инфицированных животных.

Доказательством критерия "новизны и существенных отличий" могут служить следующие доводы:
1/ в литературе отсутствует информация, предсказывающая получение эффекта с помощью данного признака, а именно плазмиды pCP-III, содержащей Bam HI - фрагмент хромосомной ДНК C.psittaci размером 3,1 тыс.п.н., и, следовательно, решение дает неожиданный эффект;
2/ сопоставительный анализ с аналогами позволяет заключить, что существующие методы выявления C.psittaci у инфицированных животных уступают предложенному по специфичности и не дают информации о множественности инфекции.

Способ заключается в выделении тотальной ДНК из исследуемого биологического материала, нанесении и иммобилизации ее на органический фильтр с последующей гибридизацией с меченой ДНК плазмиды-зонда pCP-III. О проведении реакции судят по радиоавтографу на рентгеновской пленке. Все манипуляции проводятся по стандартной методике /Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. - В кн. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984/.

Новым компонентом предлагаемого способа является рекомбинантная плазмида pCP-III.

Получение рекомбинантной плазмиды pCP-III.

1. Выделение и очистка хромосомной ДНК c.psittaci штамма "250". После 8-10 дней инкубации куриных эмбрионов, инфицированных частицами хламидий штамма "250", выделенного при хламидиозном аборте у коровы, при температуре 36^oC из яиц извлекали желточные мешки, промывали в физрастворе и измельчали в фарфоровой ступке с порошком кварцевого песка с добавлением равного объема TES-буфера /Трис pH 8,0 50 мМ, ЭДТА-Na 20 мМ, NaCl 150 мМ/. В гомогенат добавляли еще 4 объема TES-буфера, перемешивали и центрифугировали на холоду при 1000 об. 2 минуты. Супернатан собирали и подвергали повторному центрифугированию для удаления желточной пленки, наплывающей на поверхность супернатана. Частицы хламидий собирали центрифугированием /100 об. 15 мин при 4^oC/, осадок тщательно суспендировали в TES-буфере и процедуру дифференцированного центрифугирования повторили. Полученный осадок суспендировали в TES-буфере /0,5 мл/, добавляли лизоцим /5-10 мин/ и 1-2 капли ДЕПК. Затем добавляли 1% трихлорацетат /TXУ-Na/ с 0,01 М этилендиаминтетроацетатом натрия /ЭДТА-Na/, pH 8,0, добавляли равный объем 12% TXУ-Na с 0,01 М ЭДТА-Na, pH 8,0 и додецилсульфат натрия /SDS/ до 0,5%. ДНК экстрагировали равным объемом смеси водонасыщенного фенола pH 8,0 с хлороформом /1/1/, интенсивно встряхивали в течение 10 минут на холоду. Водную фазу отделяли центрифугированием /6000 об. 15 мин при 0^oC/, обрабатывали смесью хлороформ-изоамиловый спирт /24/1/ 10 мин на холоду и центрифугировали /6000 об. 15 мин при 0^oC/. ДНК осаждали 2,5 объемами 96^o этанола, промывали 70^o этанолом, растворяли в буфере /10 мМ трис HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА-Na 0,14 мМ NaCl/ и обрабатывали РНК-зой фирмы "Serva", ФРГ 60 минут при 37^oC, добавляли SDS до 0,5% и протеиназу K фирмы "Sigma", США инкубировали 60 мин при 37^oC. Рабочая концентрация ферментов составляла 50 мкг/мл. После очистки ферментами, ДНК экстрагировали смесью хлороформ-изоамиловый спирт /24/1/, центрифугировали /6000 об. 15 мин при 0^oC/ и осаждали 2,5 объемами этанола. О нативности препаратов ДНК судили по величине гиперхромного эффекта и по электрофоретической подвижности в 0,8% агарозном геле. Концентрацию ДНК в растворе определяли спектрофотометрически и по интенсивности свечения комплексом ДНК с бромистым этидием после электрофореза в агарозном геле.

2. Рестрикция ДНК c.psittaci реатриктазой Bam HI осуществлялась в течение 2-4 часов по стандартной методике /Маниатис Т. и др., 1984/. Реакцию останавливали прогреванием смеси при 65^oC в течение 10 мин.

3. Лигирование Bam HI фрагментов ДНК C.psittaci с ДНК pBR 322, линеаризованной по сайту Bam.HI, проводили по общепринятой методике /Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., 1984/.

4. Трансформация реципиентного штамма HB 101 E.coli продуктом реакции лигирования и селекция трансформатных клонов, несущих рекомбинантную плазмиду проводились по стандартной методике /Маниатис Т. и др., 1984/ при ампициллиновой селекции.

5. Идентификация рекомбинантных плазмид осуществлялась методом блот-гибридизации с ДНК C.psittaci, иммобилизованной на нитроцеллюлозных фильтрах после рестрикции ферментом Bam HI и электрофореза в агарозном геле /по методике Маниатис Т. и др., 1984/.

6. Выделение и очистка ДНК рекомбинантной плазмиды pCP-III проводились по методу Биренбойма /Маниатис Т. и др., 1984/.

7. Введение радиоактивной метки в ДНК плазмиды pCP-III выполняли с помощью реакции ник-трансляции в 30-60 мкл смеси, содержащей 0,1 мМ дитиотритол /ДТТ/, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ трис HCl, pH 7,6; 4,2 ед ДНК полимеразы 1, 40 мкМ холодных трифосфатов /дНТФ "Sigma" США/, 40-60 мкКю P³² /производства ХОП - радиопрепарат/ и 300-500 нг ДНК. Смесь инкубировали 30 минут при 4^oC. Для определения процента включения брали по 2 мкл пробы и наносили на стеклобумагу /Watman, Англия/: контроль измеряли без отмывки в 5% ТХУ на счетчике "ДЕЛТА" в толуоловом сцинтилляторе, опыт - с отмывкой в 5% ТХУ. Ник-транслированную ДНК отделяли от невключившихся дезоксинуклотидтрифосфатов на микроколонке /пастеровская пипетка со стеклянным шариком/, наполненной сефадексом G-50 /Farmacia, Швеция/. Перед нанесением на колонку пробу подкрашивали до голубого цвета раствором декстрана-голубого /Loba-Chemie, Австрия/, за миграцией высокомолекулярного ДНК следили по передвижению декстрана на колонке. Первые 5-7 капель собирали в пробирку. Удельную активность зонда определяли на сцинтилляционном счетчике, которая составляла 10⁷ имп/мин/мкг ДНК.

Плазмида pCP-III имеет размер 7,46 тыс. п.н. и состоит из следующих элементов: плазмидная ДНК вектора pBR 322, размер которой 4,36 тыс.п.н., Bam HI, фрагмент ДНК C.psittaci, размер которого 3,1 тыс.п.н. Препараты очищенной плазмиды являются исходным материалом для получения радиоактивных зондов с целью обнаружения инфицированности хламидиями биологических объектов методом ДНК-ДНК гибридизации.

На фиг. 1 представлена схема плазмиды pCP-III c рестрикционной и генетическими картами.

Специфичность рекомбинантного плазмидного ДНК-зонда проверялась и подтверждена методами гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах и в опытах блотт-гибридизации по Саузерну.

На фиг. 2 представлена рентгенограмма фильтра со смесью высокомолекулярной ДНК C.psittaci после гибридизации с плазмидой pCP-III. Положительный сигнал на спектре ДНК C.psittaci и отсутствие перекрестной реакции с ДНК курицы служит доказательством специфичности зонда на основе ДНК рекомбинантной плазмиды.

Определение чувствительности отобранных специфических ДНК-зондов проводили методом ДНК гибридизации на точках. Для этого на фильтр наносились 2 мг ДНК курицы с добавлением хромосомной ДНК хламидий в количествах 20,5,1,0 нг. Радиоавтограф такого фильтра, гибридизованного с плазмидой pCP-III, представлен на фиг. 3. Как видно на фиг.3, использование рекомбинантной плазмиды pCP-III и P³² - дезоксинуклеотидов в качестве радиоактивного зонда при ДНК-ДНК гибридизации позволяет обнаружить менее 1 нг ДНК патогена на 2 мкг ДНК куриных клеток. Известно, что размер генома птиц и млекопитающих составляет в среднем 2•10⁹ п.н. Поскольку размер генома C.psittaci не превышает 1 млн. п.н., данное соотношение сигнала фону позволяет обнаружить хламидии при множественности инфекции не более 1 клетки патогена на клетку хозяина.

Таким образом, предложенный способ с использованием рекомбинантной плазмиды pCP-III в качестве радиоактивного зонда при ДНК-ДНК гибридизации дает возможность гарантированно обнаружить и идентифицировать частиц хламидий, относящихся к виду psittaci в исследуемых объектах, и тем самым повысить точность и чувствительность метода обнаружения хламидийных заражений сельскохозяйственных животных, в отличие от аналогов, где не удается достичь однозначного ответа. Использование шкалы положительного контроля /фиг.3/ позволяет оценить множественность инфекции в биологическом материале.

Перечень представленных материалов
1. Фиг. 1. Схема плазмиды pCP-III с рестрикционной и генетическими картами.

2. Фиг. 2. ДНК-рестрикционные спектры и результаты блотт-ДНК-ДНК гибридизации. А. 1/ Hind III - фрагменты ДНК фага λ в качестве маркера молекулярной массы. 2/ Линейная форма плазмиды pBR 322 /положительный контроль/. 3/ Bam HI - фрагменты ДНК C.psittaci. 4/ Тотальная ДНК курицы, обработанная рестриктазой Bam HI /отрицательный контроль/. Б. То же, после переноса на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизации с плазмидой pCP-III, меченой P³² в реакции ник-трансляции.

3. Фиг. 3. Результаты дот-гибридизации ДНК C.psittaci с плазмидой pCP-III. A. 20 нг ДНК pBR 322.

B-E. 2 мкг ДНК курицы с добавлением ДНК C.psittaci в количествах 0,20,5,1 нг соответственно.

Источники информации, принятые во внимание:
1. Обухов И.Л., Шинулин Г.А., Шинулина О.Ю., Хламидиоз кошек. Приложение к журналу "Новости звероводства". -М.: 1994, N 1.

2. Прозоровский С.В., Бескина С.Р., Попов В.А., Бархатова О.Н. Гальпровиозы /хламидиозы/ человека и животных. Сб.трудов.-М.:1979, с.22-25.

3. Тагиева Н.Э., Ломоносов М.Ю., Игнатова Т.М., Апросина З.Г., Дроздова А.С. Архив патологии. - 1993, N 5, N 55, т. 55, с. 71-74.

4. Шаткин А.А. Гальпровиозы /хламидиозы/ человека и животных. -М.: 1979, с. 5-11.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.Молекулярное клонирование. -М.:Мир, 1984. 480 с.

6. Beatty W.L., Morrison R.P., Byrne G.S. Microbiol.Rew., 1994, 58, N 4, p. 686-699.

7. Malter J.S., Gerber M.M.Hepatology, 1991, v 2, p. 188-190.

8. Campbell L.A., Cuo C.C., Grayston J.T. Abstc. Annu. Mut. Amer. Microbiol, 1987, 87 th, Washington, d.c., p.99.

9. Frost E., Deslandes S., Bourgaux-Ramoisy d.Genitourin Med., 1993, 69, N 4, p. 250-294.

10. Pecharatana S., Pichet M., Watt P. Meth. and Appl., 1993, 3 N 3, p. 200-204.

11. Sayada C., Denamnr J. FEMS Microbiol. Lett., 1991, 83, N 1, p. 73-78.

Способ основан на конструировании рекомбинантной плазмиды рСР-111, содержащей специфичный Ваm HI-фрагмент хромосомной ДНК Chlamydia psittaci. Рекомбинантная плазмида может быть использована для обнаружения инфицированных хламидиями сельскохозяйственных животных методом ДНК-ДНК гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах. Чувствительность метода составляет менее 1 нг ДНК патогена. Способ применим для диагностики хламидиоза в ветеринарной медицине. 3 ил.

Способ обнаружения инфицированных Chlamydia psittaci сельскохозяйственных животных, включающий конструирование плазмиды, содержащей фрагмент хромосомной ДНК Chlamydia с последующей гибридизацией сконструированной плазмиды с ДНК исследуемого образца и оценкой результатов, отличающийся тем, что конструируют рекомбинантную плазмиду рСР-III, содержащую специфичный Bam HI-фрагмент хромосомной ДНК Chlamydia psittaci, размером 3,1 тыс.п.н.