СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА CHLAMYDIACEAE Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/68 G01N33/569 C12Q1/68 C12R1/01 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для диагностики и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

Известен способ диагностики хламидийных инфекций на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-time ПЦР), включающий выделение ДНК возбудителя, амплификацию мишени с использованием семейственно-специфических праймеров и анализ кривых плавления ПЦР-продуктов в присутствии неспецифического ДНК-лиганда - SYBR Green I. В одном из существующих на данный момент методов диагностики хламидиозов, основанных на Real-time ПЦР с SYBR Green I, детектирование отдельных видов хламидий осуществляется с помощью праймеров к центральному фрагменту гена omp1 (Huang, J., DeGraves, F.J., Gao, D., Feng, P., Schlapp, Т. and Kaltenboeck, B. 2001. Quantitative Detection of Chlamydia spp. by fluorescent PCR in the LightCycler. BioTechniques. 30; 150-157).

Основные недостатки этого способа:

1. С его помощью были детектированы лишь следующие виды семейства Chlamydiaceae: Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pecorum и Chlamydia trachomatis, т.е. не показана возможность выявления Chlamydophila felis, Chlamydophila abortus, Chlamydia muridarum, Chlamydophila caviae, Chlamydia suis.

2. He позволяет дифференцировать виды хламидий между собой, поскольку амплификационные продукты характеризуются идентичной температурой плавления.

3. Не предусматривает возможности использования внутреннего стандарта для контроля качества ПНР-диагностики.

Сущность предлагаемого способа состоит в том, что осуществляют выделение ДНК возбудителя, ПЦР-амплификацию 5’-концевого фрагмента гена omp1 любого вида хламидий в режиме реального времени с использованием семейственно-специфических праймеров СМ1: 5’-CAG-GAC-ATC-TTG-TCT-GGC-TT-3’ и СМ2: 5’-CAA-GGA-TCG-CAA-GGA-TCT-CC-3’ (H. Yoshida и др., 1998) в присутствии SYBR Green I с последующей дифференциацией видов на основании различной температуры плавления (Т_m) ПЦР-продуктов: 84,1°С и 86,1°С - для С.trachomatis, Chlamydia suis, Chlamydia muridarum; 82,6°C и 85,1°С - для C.pneumoniae, C.pecorum; 84,4°C и 85,5°С (не полностью разделенные пики) - для возбудителей зоонозов: C.psittaci, С. abortus и C.felis.

Положительный результат ПЦР регистрируется по нарастанию флуоресцентного сигнала SYBR Green I в результате накопления специфических продуктов амплификации в последовательных циклах ПЦР. Амплификационные фрагменты omp1 различных видов хламидий отличаются по длине (245-259 пн) и А/Т-насыщенности и характеризуются специфическими двухэтапным профилями плавления, позволяющими дифференцировать Chlamydia spp., C.pneumoniae и возбудителей зоонозных инфекций (C.psittaci, С.abortus, C.felis). Для контроля ингибирования ПЦР применяется гетерогенный внутренний стандарт (ВС), фланкированный участками связывания праймеров СМ1 и СМ2 и отличающийся от амплификационных фрагменты omp1 по длине (341 пн) и температуре плавления.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из клинического материала (моча, кровь, урогенитальные и респираторные мазки, образцы тканей) осуществляют с помощью набора “ДНК-сорб-В-30” (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) в соответствии с рекомендациями производителя.

Этап амплификации и одновременного детектирования флуоресцентного сигнала, а также последующий анализ кривых плавления ПЦР-продуктов проводят с помощью ДНК-амплификатора, работающего в режиме реального времени. ПЦР смесь объемом 25 мкл содержит: 0,5 мкМ каждого праймера, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 единицы Taq-полимеразы, 10 мМ Трис-НСl (рН 9,0), 50 мМ КСl, 1,5 мМ MgCl₂, 0,5 мкл флуорофора SYBR Green I (BioGene, Англия) в концентрации 1:1000, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 5 мкл исследуемого образца. Для контроля ингибирования ПЦР в реакционную смесь также вносят 600 копий внутреннего стандарта (ВС). Горячий старт ПЦР обеспечивается благодаря механическому разделению компонентов смеси. Амплификацию проводят с использованием системы Rotor-Gene 2000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: 83°С - 6 мин, 95°С - 20 сек, затем 50 циклов: 95°С - 25 сек, 68°С - 30 сек, 82°С - 15 сек. Накопление амплификационных продуктов регистрируют по нарастанию флуоресценции на канале SYBR (470/585hp nm; коэффициент усиления - 5) в конце каждого цикла при 82°С. По окончании процедуры амплификации проводят завершающий этап элонгации при 72°С в течение 2 мин и плавление ПЦР-продуктов при температуре от 72°С до 94°С с увеличением на 1°С через каждые 10 сек. Анализ результирующих кривых плавления позволяет четко дифференцировать амплификационные продукты, соответствующие фрагменту omp1 различных видов Chlamydiaceae и ДНК ВС, которая имеет более высокую температуру плавления (88°С). При этом кривые плавления всех хламидийных ампликонов характеризуются наличием двух пиков, отражающих двухэтапную диссоциацию цепей ДНК в участках с разной А/Т-насыщенностью, а их видовая принадлежность может быть установлена путем сравнения пиков плавления: 84,1°С и 86,1°С - для C.trachomatis, Chlamydia suis, Chlamydia muridarum; 82,6°C и 85,1°C - для С.pneumoniae, C.pecorum; 84,4°C и 85,5°С (не полностью разделенные пики) - для возбудителей зоонозов: C.psittaci, C.abortus и С.fells.

Пример 1. Пациентка В., 25 лет, поступила в кожно-венерический диспансер с жалобами на выделения из влагалища и тянущую боль внизу живота. Общее состояние пациентки оценивалось как удовлетворительное. При осмотре вокруг наружного отверстия шеечного канала были отмечены эрозии, а из канала вытекали слизисто-гнойные выделения. У пациентки был взят соскоб из цервикального канала. Окрашивание мазка флуоресцентно-мечеными антителами к C.trachomatis выявило специфические антигены. ПЦР в режиме реального времени с семейственно-специфическими праймерами СМ1 и СМ2 к omp1 и анализ кривых плавления подтвердили наличие в исследуемом образце ДНК C.trachomatis. Специфичность амплификации была подтверждена путем электрофоретического разделения продуктов ПЦР.

Пример 2. С целью определения видовой принадлежности и паспортизации в лабораторию предоставлены частично очищенные элементарные тельца хламидийных изолятов "ПП-87" и "КС-93", выделенные из плаценты песца и паренхиматозных органов абортированного плода собаки соответственно. Согласно литературным данным два вида хламидий: C.abortus и С.pecorum, являются патогенными для животных сем. Canidae. Для идентификации хламидийных изолятов использовался метод ПЦР в режиме реального времени с семейственно-специфическими праймерами СМ1 и СМ2 и флуоресцентными зондами. На основании проведенного анализа был сделан вывод о принадлежности штаммов "ПП-87" и "КС-93" к виду C.abortus. Идентификация подтверждена результатами прямого секвенирования ПЦР-продуктов.

Применение технологии горячего старта и детектирование флуоресценции при повышенной температуре (82°С) позволяет избежать образования и детектирования неспецифических продуктов реакции. В модельных экспериментах по оценке аналитической чувствительности метода с использованием разведении хламидийной ДНК показано, что нижний предел обнаружения любого из перечисленных видов хламидий в присутствии избыточного количества ДНК человека (200 нг) и 600 копий ДНК ВС составляет от 2 до 10 геном-эквивалентов на реакцию. При этом неспецифическая амплификация отсутствует.

Для оценки клинической чувствительности и специфичности проведен параллельный анализ 219 урогенитальных образцов с помощью предложенного метода и коммерческой ПЦР-тест-системы "Амплисенс Chlamydia trachomatis" (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) с праймерами к криптической плазмиде. Четыре образца не могли быть проанализированы с помощью предложенного метода в связи с наличием в них компонентов, ингибирующих ПЦР. Для оставшихся 215 образцов результаты тестирования с применением обоих вышеуказанных методов совпали: ДНК C.trachomatis выявлена в 41 образце, 174 - оказались отрицательными.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики возбудителей семейства Chlamydiaceae с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления обеспечивает следующие преимущества:

1. Позволяет осуществлять одновременное детектирование и дифференциацию всех патогенных для человека видов хламидий: C.trachomatis, C.pneumoniae и возбудителей зоонозных инфекций (C.psittaci, C.abortus, C.felis).

2. Может использоваться для дифференциальной диагностики видов Chlamydiaceae, вызывающих заболевания животных.

3. Благодаря высокой чувствительности и специфичности может использоваться не только для анализа культивированных штаммов, но и для прямой диагностики в образцах клинического материала, полученного от человека и животных.

4. Позволяет снизить риск контаминации продуктами ПЦР и получения ложноположительных результатов за счет отсутствия этапа электрофоретического анализа ПЦР-продуктов.

5. Экономичен.

6. Позволяет снизить трудозатраты и время анализа.

Изобретение относится к области медицины и биологии. Предложен новый способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae. Способ предусматривает выделение ДНК возбудителя, амплификацию с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров СМ1 и СМ2, специфичных к 5’-концевому фрагменту гена omp1, и постамплификационного анализа кривых плавления ПЦР-продуктов в присутствии неспецифического флуоресцентного красителя SYBR Green I для разделения видов хламидий, электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов. Идентификацию видов осуществляют на основании различий температуры плавления ПЦР-продуктов, при этом кривые плавления всех фрагментов omp1 характеризуются наличием двух пиков, отражающих двухэтапную диссоциацию цепей ДНК в участках с разной А/Т-насыщенностью. Предложенный способ позволяет дифференцировать все патогенные для человека виды хламидий. Кроме того, позволяет дифференцировать Chlamydiaceae, вызывающие заболевания животных, а также прост, быстр и может быть использован для прямой диагностики образцов клинических материалов. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и вирусологии для дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae.

Способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae, включающий выделение ДНК возбудителя, амплификацию с помощью ПЦР в режиме реального времени с семейственно-специфическими праймерами СМ1: 5’-CAG-GAC-ATC-TTG-ТСТ-GGC-ТТ-3’ и СМ2: 5’-САА-GGA-TCG-САА-GGA-ТСТ-СС-3’ к 5’-концевому фрагменту гена omp1, отличающийся тем, что используют постамплификационный анализ кривых плавления ПЦР-продуктов в присутствии неспецифического флуоресцентного красителя SYBR Green I для разделения видов хламидий, а идентификацию видов осуществляют на основании различий температуры плавления ПЦР-продуктов, при этом кривые плавления всех фрагментов omp1 характеризуются наличием двух пиков, отражающих двухэтапную диссоциацию цепей ДНК в участках с разной А/Т-насыщенностью: 84,1°С и 86,1°С – для Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis, Chlamydia muridarum, 82,6°С и 85,1°С – для Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pecorum, 84,4°С и 85,5°С (не полностью разделенные пики) – для возбудителей зоонозов; Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus и Chlamudophila felis.