СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБОВ И УСТАНОВКА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/04 C12M1/34 C12M1/22 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу исследования микробов и установке для его осуществления, то есть к детектированию и/или идентификации бактерий и других микробов.

Предпосылки создания изобретения

В отношении продовольствия, включающего мясо, морепродукты, такие как рыба, и тому подобное, предназначенного для поставки на рынок, является обычным, чтобы материал для такого продовольствия предварительно обрабатывался в заданных условиях на фабрике, а затем поставлялся на рынок. На фабрике обрабатываемое продовольствие исследуют на предмет того, не является ли оно загрязненным патогенными бактериями и другими микробами. В повсеместно используемом способе детектирования микробов, содержащихся в продовольствии, исследуемые микробы собирают с образца и культивируют в термостате в течение предписанного времени таким образом, что становится возможным визуальное измерение и детектирование культивированных микробов. Однако, чтобы выполнить это точно, требуется специальная методика в сочетании с длительным опытом работы.

Недавно предложен способ, использующий компьютер. В этом способе изображение исследуемой среды, введенное в компьютер, переводят в бинарный код для вычисления определяющего уровня для исследования. Однако этот способ сталкивается с проблемой, что даже небольшие различия в угле освещения и направлении источника света по отношению к среде могут непосредственно отрицательно влиять на правильное определение среды, поскольку изображение переводят в бинарный код, когда непосредственно его вводят в компьютер. Как следствие возникает разброс результатов исследования, тем самым приводя к ошибке.

Таким образом, очень трудно производить точное исследование при конкретных обстоятельствах. Далее обычный способ имеет дополнительную проблему, заключающуюся в том, что если продовольствие тем или иным образом загрязнено микробами (то есть имеется единичное соприкосновение с продовольствием, возможное присутствие микробов в продовольствии, их размножение в продовольствии), которые в будущем могут быть опасными для людей, большинство таких патогенных микробов не обнаруживают их реальной формы до тех пор, пока не пройдет определенное время. По этой причине часто случается так, что после доставки для продажи обработанного на фабрике продовольствия патогенные микробы размножаются, и при использовании такого продовольствия потребители страдают от пищевого отравления.

Далее, обычные методики исследования микробов требуют длительного времени для получения результатов исследования. Однако в последнее время, имея такие усовершенствованные методики исследования, как способ непосредственного наблюдения в микроскоп, способ мембранного окрашивания, способ электрического импеданса, способ флуоресцентного окрашивания, способ флуоресцентной метки, способ измерения биолюминисценции, используемые для исследования микробов, присутствующих в обрабатываемом продовольствии, частично обработанном продовольствии, обработанном продовольствии, иногда можно осуществлять быстрое исследование. Однако даже эти усовершенствованные методики исследования имеют множество преимуществ и недостатков в отношении скорости, диапазона исследования, экономической эффективности и все еще далеки от полного совершенства. В некоторых из способов исследования может быть идентифицирован конкретный микроб, но в большинстве из них идентификация микробов является сложной.

В документе JP 09-187280 от 22.07.97 при описании способа анализа бактерий и устройства для анализа бактерий указано, что “осуществляют точный подсчет количества колоний бактерий, образованных в культуральном слое после культивирования”, и сказано, что предложены “способ анализа бактерий и устройство для анализа бактерий, которое считывает исходное состояние культурального слоя пробы посредством сканера изображений после формирования этого слоя путем впрыскивания раствора агросодержащей культуры и пробы и отверждения культуры в чашке Петри и запоминания данных изображения в запоминающем устройстве, считывания состояния после культивирования, являющегося следствием культивирования, посредством сканера изображений после культивирования в чашке Петри в блоке культивирования, и запоминания данных изображения, и анализирует состояние размножения бактерий путем сравнения данных изображения в вышеупомянутом состоянии и данных изображения после культивирования”.

Здесь объектом сравнения являются данные изображения исходного состояния культурального слоя пробы перед культивированием и состояния, являющегося следствием культивирования, с явно видимыми бактериями (при этом требуется долгосрочный период культивирования - 24, 48, и т.д. часов), причем без идентификации бактерий, и это явно не короткий период времени по сравнению с 5-6 часами, как заявлено в настоящем изобретении.

По поводу способа обработки, присущего упомянутому способу анализа, следует отметить следующее.

1) Исходное состояние считывают перед культивированием с помощью сканера изображения (это делается для обнаружения количества примесей, инородных веществ, а не для обнаружения присутствия бактерий).

2) Изображение этого исходного состояния, получаемое сканером, запоминают в памяти.

3) Состояние, являющееся следствием после культивирования, сканируют (эта операция обычно требует периода культивирования 24-48 часов и неэффективна).

4) Вышеупомянутые данные изображения исходного состояния и данные после культивирования сравнивают и вычисляют количество примесей и количество колоний бактерий.

Другими словами, в упомянутом документе речь идет о способе и устройстве для анализа количества примесей и количества колоний бактерий путем запоминания количества примесей в исходном состоянии в памяти и вычитания его из изображения после культивирования.

Как указано во введении документов JP 02-269951 от 5 ноября 1990 г. и US 4885697 A, здесь речь идет о “Способе идентификации спектра”.

Это изобретение относится к способу классификации спектра и к использованию такой классификации для идентификации неизвестных по их спектру. Более конкретно это изобретение относится к способу классификации проб известных микроорганизмов из спектральных картин, полученных на основе их ДНК, и к использованию такой классификации для идентификации проб неизвестных микроорганизмов.

Предусматривается анализ спектральных картин, полученных из ДНК, то есть последовательностей оснований ДНК, и идентификация их с помощью данных обработки изображений, получаемых из результатов анализа.

Следовательно, микроорганизмы идентифицируют по оптическим спектрам, и даже если заявлена идентификация бактерий, это все же способ, который полностью отличается от способа, заявленного согласно настоящему изобретению.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание способа и установки для исследования среды, такой как микробы, в котором изображения среды, культивируемой в течение короткого времени (от около 5 до 6 часов) разделяют, например, на три первичных цвета, а затем вычисляют гистограмму, колориметрическую характеристику и оттенок цвета таким образом, что устанавливают эффективность роста для ожидаемого роста колонии микробов и определяют эффективные признаки, специфичные для каждого микроба, затем данные, предварительно рассчитанные с помощью той же процедуры, что и выше, и накопленные, просматривают и сравнивают для идентификации, а затем прогнозируют состояние размножения этих микробов после прохождения времени (например, 24 часа, 48 часов), как правило необходимого для культивирования этих микробов, используя эффективность роста, тем самым состояние размножения микробов после прохождения заданного времени может быть легко установлено на будущее, несмотря на короткое время.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа и установки для исследования среды, такой как микробы, причем степень точности идентификации микробов увеличивается, изображение таких микробов точно определяют и фотографируют и установки для исследования среды размещают в корпусе как одну группу, тем самым можно осуществлять автоматически не только определение среды и накопление результатов исследования, но также можно уменьшать количество бактерий в среде и легко стерилизовать бактерии.

Сущность изобретения

Согласно настоящему изобретению предлагается способ исследования микробов, предусматривающий получение изображения исследуемой среды, содержащей микробы, подвергнутой воздействию освещением, обработке красителем до или после культивирования в чашке Петри, разделение полученного изображения на три первичных цвета, вычисление хроматических данных гистограммы, колориметрической характеристики и определение оттенка цвета для каждого первичного цвета, сравнение полученных данных с предварительно накопленными данными с помощью аналогичной процедуры разделения изображения на три первичных цвета, и выделение признаков, специфических для идентификации вида микробов, и затем прогнозирование состояния размножения исследуемых микробов после культивирования в течение заданного времени, причем прогнозирование размножения микробов осуществляют с учетом фактического состояния исследуемых микробов после окончания культивирования микробов в течение заданного времени.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается установка для осуществления способа исследования микробов, содержащая корпус, имеющий входное отверстие для загрузки чашек Петри с помощью механизма загрузки, расположенные в корпусе круглый столик, установленный с возможностью вращения и служащий для складирования подаваемой по одной из чашек Петри в вертикальную стопку, механизм выгрузки чашек Петри, устройства освещения и обработки красителем среды, устройство для получения изображения, компьютер с монитором и механизм подачи заданного количества чашек Петри в кассету, причем устройство освещения содержит, по меньшей мере, один источник света.

Кроме того, установка снабжена устройством для стерилизации исследуемой среды, сигнальной лампой, звонком для сигнализации о том, что превышен заданный уровень размножения конкретных микробов.

Кроме того, корпус размещен в камере, содержащей устройство, выполненное с возможностью измерения температуры, влажности и запыленности в пространстве указанной камеры и с возможностью ввода полученных данных в указанный компьютер для управления параметрами в указанном пространстве.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой блок-схему установки и способа исследования микробов согласно настоящему изобретению;

фиг.2 представляет собой блок-схему процедуры отбора, выделения и прогнозирования роста микробов согласно настоящему изобретению;

фиг.3 представляет собой общий вид главной части установки согласно настоящему изобретению и ее составных частей;

фиг.4 представляет собой вид, поясняющий последовательность преобразования изображения исследуемой среды согласно настоящему изобретению;

фиг.5 представляет собой вид, поясняющий состояние для выделения и измерения контура колонии в среде согласно настоящему изобретению;

фиг.6 представляет собой вид, поясняющий культивирование и прогнозирование роста среды согласно настоящему изобретению;

фиг.7 представляет собой вид конструкции установки для исследования микробов согласно настоящему изобретению;

фиг.8 представляет собой общий наружный вид одного из воплощений установки для исследования микробов согласно настоящему изобретению;

фиг.9 представляет собой вид главной части внутренней конструкции установки для исследования микробов согласно настоящему изобретению;

фиг.10 представляет собой блок-схему, поясняющую этапы способа, начиная от загрузки среды и заканчивая выгрузкой среды, согласно настоящему изобретению;

фиг.11 представляет собой вид, поясняющий получение изображения колонии в среде и состояние освещения трещины;

фиг.12 представляет собой вид, показывающий расположение источника света и воспринимающей свет части среды и управляющего устройства согласно настоящему изобретению;

фиг.13 представляет собой общий вид фотографирующего устройства для среды согласно настоящему изобретению;

фиг.14 представляет собой блок-схему способа от начала операции получения изображения среды и до конца согласно настоящему изобретению.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение далее будет описано со ссылками на прилагаемые чертежи.

Фиг. 1 представляет собой блок-схему установки и способа исследования микробов согласно настоящему изобретению. На фиг.1 стадии (1)-(12) поясняют конструкцию и работу устройства для культивирования (термостата) (A₁). Конструкция и работа устройства для культивирования далее будет описываться последовательно. На стадии (1) культуральную среду (агар) инокулируют бактериями (культуральная среда, инокулированная бактериями, далее упоминается, как “среда”). В случае если эта среда находится в ожиженном состоянии, для сбора бактерий используют фильтр. Среда может принимать множество других форм. Среду размещают в чашку (1а) Петри, и затем помещают в термостат (A₁). На стадии (2) устанавливают температуру культивирования на требуемом уровне путем соответствующей операции на рабочей панели термостата (A₁). На стадии (3) устанавливают время культивирования. Также и в этом случае необходимое время устанавливают путем соответствующих операций на рабочей панели. На стадии (4) рабочая панель термостата (A₁) работает, реализуя автоматический режим работы (он при работе соединяется с конечным оборудованием (B₁) и процессором (C₁), как описывается далее).

Затем, на стадии (5), об автоматическом режиме работы информируют конечное оборудование (B₁). Ручной режим работы может быть используют, если это необходимо, когда желательно культивировать бактерии в течение, например, 24 часов, 48 часов. На стадии (6) проверки установки времени культивирования определяют настройку времени культивирования в автоматическом режиме на стадии (3). На стадии (7) проверки установки температуры определяют, является ли температура настройкой температуры культивирования на стадии (2). При регулировке температуры на стадии (8), если температура не находится в диапазоне настроек температуры, осуществляют контроль для предотвращения перегрева. Если отмечается завершение культивирования на стадии (9), о завершении культивирования информируют как конечное оборудование (B₁), так и процессор (C₁). На стадии (10) определяют, имеется ли запрос на подачу содержащей среду чашки Петри (1а), сделанный конечным оборудованием (B₁). Если отмечается отсутствие содержащей среду чашки Петри (стадия 11), об отсутствии содержащей среду чашки Петри (1а) информируют конечное оборудование (B₁) и автоматический режим останавливается. На стадии (12) считывают штриховой код содержащей среду чашки Петри и содержащую среду чашки Петри (1а) подают в конечное оборудование (B1).

Стадии (I)-(Х) демонстрируют конструкцию и работу конечного оборудования (B1). Его конструкция и работа будет описана далее. При настройке автоматического режима на стадии (I) рабочая панель конечного оборудования (B₁) работает, реализуя автоматический режим (при работе оно соединяется с термостатом (A₁) и процессором (C₁), как описано далее). На стадии (II) об автоматическом режиме работы сообщается как термостату (A₁), так и процессору (C₁). При информации о завершении культивирования на стадии (III) конечное оборудование (B₁) переходит в режим ожидания до тех пор, пока не поступит сигнал о завершении культивирования от термостата (A₁). На стадии (IV) запрос на подачу содержащей среду чашки Петри посылают термостату (A₁). При определении штрихового кода содержащей среду чашки Петри на стадии (V) определяют, установлена ли содержащая среду чашка (1а) Петри в заданной позиции и считан ли штриховой код. На стадии (VI) удаляют верхнюю крышку содержащей среду чашки (1а) Петри. При определении заданной позиции содержащей среду чашки Петри на стадии (VII) определяют, установлена ли содержащая среду чашка (1а) Петри на заданной позиции в конечном оборудовании (B1). При передаче данных на стадии (VIII) определяют, принимается ли в нормальных условиях изображение среды, установленной в заданной позиции, или нет. При операции разгрузки содержащей среду чашки Петри на стадии (IX) содержащую среду чашку (1а) Петри разгружают или складируют вне конечного оборудования (B1). При определении завершения на стадии (X) определяют, поступила ли информация об отсутствии содержащей среду чашки (1а) Петри от термостата (A₁), или нет, и, если результат определения является положительным, в процессор (C₁) поступает сигнал завершения работы.

Стадии [1]-[5] демонстрируют конструкцию и работу процессора (C₁), которые будут описаны далее. На стадии [1] задают автоматический режим работы. Рабочая панель процессора (C₁) работает, реализуя автоматический режим работы (она при работе соединяется с термостатом (A₁) и процессором (C₁), как описано далее). Стадия [2] демонстрирует автоматическое определение состояния каждого устройства. Здесь определяют, настроены ли термостат (A₁) и конечное оборудование (B₁) на автоматический режим работы или нет. Стадия [3] демонстрирует прием данных. Здесь процессор (C₁) принимает изображения среды, передаваемые от конечного оборудования (B₁), и накапливает их внутри себя. Если накопление происходит при нормальных условиях, сигнал нормального приема выходит к конечному оборудованию (B₁). Стадия [4] показывает накопление данных, и стадия [5] показывает прием сигнала окончания приема данных.

Здесь данные об изображении среды, передаваемые для приема данных на стадии [5] процессора (C₁) от передачи данных на стадии (VIII) конечного оборудования (B₁), представляют собой изображение, обработанное компьютером. То есть изображение выражается в трех байтах и разделяется с помощью логической операции каждого байта. Затем путем вычисления гистограммы, оттенка цвета и колориметрической характеристики для каждого набора выделенных данных выделяют признаки микробов. Признаки выражаются в виде коэффициента. Затем путем поиска в предварительно подготовленной базе данных (данные, полученные путем анализа и упорядочения собранной информации) идентифицируют вид бактерии в среде. Затем на основании поиска в ранее накопленных базах данных делают прогноз роста бактерий. Таким образом, культивирование, измерение вида и количества колоний микробов может быть проделано за короткое время.

Последовательность обработки в компьютере, рассмотренная ранее, теперь будет описана более подробно. На блок-схеме на фиг.2 после начала работы изображение, имеющее соответствующий цвет, вводят в компьютер на стадии (а) (эта процедура будет описана более подробно далее), и изображение, полученное таким образом в компьютере на стадии (b), разделяют, например, на три первичных цвета, красный (red) R, зеленый (green) G и голубой (blue) В. Затем, на стадии (с), гистограмму каждого первичного цвета вычисляют и раскладывают по плотности распределения 256 видов цветов и на стадии (d) вычисляют оттенок цвета и колориметрическую характеристику, другими словами, устанавливают виды цветов и плотность. Для выделения признаков на стадии (е) производят сравнение с базой (D) данных, чтобы тем самым установить вид микробов. То есть новые данные, полученные от только что обработанного изображения, сравнивают с базой (D) данных (в качестве примера базы данных ID можно привести виды бактерий (группа/индивидуально, например coliform bacilli), коэффициент признака (<значение гистограмы> распределения R, G, В, Н, распределение S <значения оттенка цвета и колориметрической характеристики>, полученные с помощью той же процедуры, как и выше, и введенные ранее), чтобы выделить признаки видов бактерий, тем самым определить виды бактерий.

Затем, на стадии (f) из прочитанных таким образом данных выделяют контур колонии. На стадии (g) прогнозируют рост колонии, а на стадии (h) прогнозируют количество колоний бактерий. Здесь на основании полученных таким образом данных выделяют контур колонии, а степень α роста (как описано далее) вычисляют на основании расстояния между соответствующими контурами и площади колонии в порядке получения прогноза, например, на 24 часа, 48 часов, основываясь на степени α роста, полученной таким образом. Эта процедура будет описана более подробно со ссылками на фиг.3(а)-3(b), 4(a)-4(d) и 5(a)-5(d). Сначала будет описан один пример процедуры получения изображения на фиг.2(а) со ссылками на фиг.3. В качестве прибора для получения изображения фиг.3(а) используют цифровую видеокамеру (К) для получения изображения (Q’) среды (Q) (фиг.4), культивируемой в течение заданного времени, в компьютере (PC).

На фиг.3(b) показано устройство согласно изобретению и его составные части, состоящее из блока формирования изображения и внутреннего компьютера, раскрытых на схеме. В данном случае светоизлучающий диод (СИД) белого цвета используют в качестве источника (IIо) света, а цифровую камеру К на приборах с зарядовой связью (ПЗС) используют в качестве устройства формирования изображения, причем само изображение обрабатывают, например, в соответствии со стандартом “красный-зеленый-голубой” (256 тонов). В дополнение к упомянутой цифровой камере (К) можно использовать датчик линий, оптический фильтр и множество источников света. Кроме упомянутого источника (IIо) света можно использовать СИДы оранжевого цвета и других цветов, а вместо СИДа можно также использовать лампу (например, галогенную лампу). Прежде всего изображение получают без установления в нужной позиции, содержащей среду (Q) чашки Петри, и, несмотря на то, что на периферии изображения появляются “неоднородности”, такие как затемнения, на основании данных изображения получают точное значение. Далее, поскольку в среде (Q) появляются различные цвета и тени в зависимости от типа культуральной среды, интенсивность источника (IIо) света задают в соответствии с типом культуральной среды. Кроме того, значение, которое умножается ввиду упомянутых “неоднородностей”, задают заранее посредством коэффициента пропускания, коэффициента отражения или действительно запомненных данных.

То есть на стадии, где изображение (Q’) разделяют на три первичных цвета, как на стадии (b), изображенной на фиг.2, изображение (Q’) среды выражают в трех байтах R, G и В и сохраняют в памяти компьютера (PC). Это изображение выражено в форме множества значений изображения (цветное изображение: изображение, где каждая точка (пиксель) имеет не только градации, но также и цвета) и выражается в трех первичных цветах (базовые значения выражения для цветов), используя следующие уравнения для вычисления гистограммы (то есть градацию, то есть плотность, вычисляют для каждого первичного цвета).

где N представляет собой число яркости, FR представляет собой яркость в детектируемом пятне, представляет собой яркость в обследуемом пятне, и

обозначает логическое произведение.

В этом способе разделения три первичных цвета R, G и В, например, накладывают друг на друга, создавая выражение для цвета. Здесь в данных для цветного изображения каждый первичный цвет выражается с помощью ряда из трех цифр. С помощью этого производят логическое арифметическое вычисление для каждого первичного цвета и выделяют изображение для каждого первичного цвета (фиг.4(b)). Затем, на стадии вычисления гистограммы для каждого первичного цвета на стадии (с) фиг.2, распределение плотности вычисляют для каждого R, G, В цвета, как показано на графике на фиг.4(с). Затем на фиг.4(а) колориметрическую характеристику и цветовой оттенок вычисляют в соответствии со следующими уравнениями,

S=S_r+S_g+S_b

Колориметрическую характеристику S и цветовой оттенок Н вычисляют с помощью приведенных выше уравнений. В приведенных выше уравнениях S_r представляет собой элемент цветового оттенка цвета R, S_g представляет собой элемент цветового оттенка G, и S_b представляет собой элемент цветового оттенка цвета В. (β представляет собой удельный коэффициент обесцвечивания изображения.

На стадии (е) выделения признаков бактерии на фиг.2 путем сравнения с данными, полученными предварительно с помощью процедуры, рассмотренной выше, выделяют те бактерии, которые имеют признаки, общие с изображением (Q’’) среды (Q). Затем при выделении контура колонии на стадии (f) на фиг.2 выделяют контур на основе полученных данных. Как показано на фиг.5(а), расстояния (х1) и (у1) между контурами 1 и 2 вычисляют для прогнозирования контуров 1' и 2' (через несколько часов) на фиг.5(b), используя степень α роста. На фиг.5(а) и 5(b) исходные контуры 1 и 2 бактерий преобразует в контуры 1' и 2' с помощью изображения, развивающего результат вычисления по следующим уравнениям:

E=x₁(α_x)

F=y₁(α_y)

В приведенных выше уравнениях α_x представляет собой компонент степени роста в направлении оси х, α_у представляет собой компонент степени роста в направлении оси у, Е представляет собой степень роста в направлении оси х, и F представляет собой степень роста в направлении оси у. Как видно из фиг.5(b), исходные контуры 1 и 2 увеличиваются по площади и сливаются друг с другом, становясь одним контуром. Затем подсчитывают количество колоний, основываясь на данных, полученных путем такого преобразования изображения, которое только что рассмотрено. Как изображено на фиг.5(с), присвоение меток производят в отношении контуров путем сканирования их в направлениях осей х, у. Затем их сканируют в направлении осей у, х (направление сканирования изменяется), чтобы установить количества (в иллюстрируемом примере контуры 1 и 2 объединяют вместе в один контур 1' и 2' и появляются три колонии (1), (2) и (3)). Эти числа указывают на количество колоний. Количество колоний после общего времени культивирования (от 24 до 48 часов) прогнозируют, основываясь на степени роста и тому подобное из накопленной базы данных. Более конкретно процесс роста колоний прогнозируют на основе базы данных, а затем прогнозируют количество колоний на основе как плотности цвета (описано далее) по соседству колоний из новых данных, так и рассмотренной выше степени роста. Таким образом, получают информацию о виде бактерий и количестве колоний. Одновременно с этим или при отдельном измерении независимо от количества колоний, подсчитанных указанным выше образом, идентифицируют вид бактерии.

Фиг.6(а) изображает поверхность (культуральную среду) среды (Q_o), где бактерии, даже если они и присутствуют, еще незаметны. Фиг.6(b) изображает поверхность при культивировании бактерий, где колония (с1) бактерий может быть видна. Фиг.6 (с) изображает поверхность после прохождения, например, от 4 до 6 часов. Время культивирования продолжается до этого момента времени. На этой поверхности можно увидеть не только колонию (c1₁) как результат роста колонии (с1), но также имеются изменения цвета по области (W) соседству. Таким образом, изображение (Q’) среды (Q_o) получают тем же способом, как описано выше, вид бактерий идентифицируют в сравнении с базой (D) данных и устанавливают степень роста, коэффициент признака и тому подобное. Затем делают прогноз роста путем использования колориметрической характеристики, оттенка цвета, плотности цвета, степени роста, коэффициента признака и тому подобное для области (W) по соседству колонии (c1₁). Фиг.6(а) изображает поверхность в процессе роста колоний, где можно увидеть колонию (c1₂) как результат дальнейшего роста колонии (c1₁) и возникновения новой колонии (с1₃). На фиг.6(е) колонии (c1₂) и (с1₃) продолжают расти и, кроме того, возникает новая колония (c1₄). Фиг.6(f) изображает поверхность, например, после прохождения 24 часов, где рассмотренные выше колонии продолжают расти и возникает много новых колоний.

Теперь будет описан способ исследования микробов, представляющий собой дальнейшее развитие описанного выше способа согласно настоящему изобретению. Изображение среды, полученное от образца, собранного с вещества, или твердого тела, имеющего микробы, или рассмотренной выше среды, которое подвергают обработке для испускания света, обработке красителем или чем-то подобным в соответствии с необходимостью до или после культивирования, разделяют на три первичных цвета, затем вычисляют хроматическую информацию гистограммы, колориметрическую характеристику и оттенок цвета для каждого первичного цвета и полученную таким образом информацию сравнивают с интегральными данными, полученными путем объединения вторых данных из обобщенной информации о микробах с первыми данными о микробах, которые предварительно собраны таким же способом, как и выше, так что выделяют признаки, специфические для микробов для идентификации типа микробов, а затем прогнозируют состояние и размножение микробов после прохождения заданного времени, тем самым состояние размножения микробов после прохождения заданного времени, требуемого для культивирования микробов в среде, может быть определено заранее.

Примеры способов, которые могут быть включены во вторые данные, такие как указанная выше обобщенная информация о микробах (PCR: случайный PCR (RAPD), гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE)) и тому подобное, включают типичный способ культивирования, кислородные антитела (EIA), способ с иммунно-магнитными сферами и тому подобное. Используют все или некоторые данные, полученные путем выражения признаков микробов, полученных в форме чисел. Таким образом, согласно настоящему изобретению интегральные данные, полученные путем объединения вторых данных из обобщенной информации о микробах, например, с первыми данными о микробах, которые предварительно накапливают с помощью такой же процедуры, как описано выше, используют и сравнивают с новой средой. То есть, когда результат сравнения первых данных с новой средой, которую необходимо исследовать, доказывает, что новая среда является такой же, как определенные бактерии из первых данных, выделяют конкретные данные и в то же время выделяют обобщенную информацию, относящуюся к ней.

Следовательно, бактерии могут быть точно идентифицированы на основе обобщенной информации, таким образом, дополнительно увеличивается точность идентификации вида бактерии.

Фиг.7 изображает расположение устройств-компонентов, составляющих установку (J) для исследования согласно одному из воплощений настоящего изобретения, таких как устройство для культивирования (термостат с присоединенным механизмом автоматической загрузки) (А₂), устройство для получения изображений (B₂), узел с арифметическим процессором (С₂) (компьютер), устройство предварительного сброса (Du), секция источника питания и управляющий узел (Е). На фиг.8 представлен общий вид снаружи установки (J) для исследования, в которой компоненты устройств фиг.7 размещены в виде одной группы внутри корпуса (Н). Корпус (Н) установки (J) для исследования на фиг.8 имеет отверстие (h) загрузки, образованное на левой стороне его лицевой поверхности. Через это отверстие (h) загрузки чашки (1а) Петри, содержащие, каждая, среду (х), такую как культуральная среда, инокулированная бактериями, загружают по одной. Корпус также имеет экран (2а) монитора, сформированный на правой стороне его лицевой поверхности. Результат исследования, состояние области по соседству и тому подобное можно наблюдать на экране (2а) монитора. Корпус (Н) снабжен на правой стороне его боковой поверхности ручкой (3’а) для выемки кассеты (3а) (как описано далее) для размещения в нем содержащих среду чашек (1а) Петри, которые складывают в вертикальные стопки до 20 штук в каждой и располагают в четыре ряда. Поскольку формирование колоний усиливается, когда к среде (х) прикладывают магнитное поле и электрическое поле, установка для исследования на фиг.8, имеющая средства для присоединения устройств-компонентов, может дополнительно сократить время культивирования.

Фиг.9(а) является видом сверху, изображающим внутреннее устройство корпуса (Н) на фиг.8. Чашки (1а) Петри, содержащие среду (х) и загружаемые по одной через отверстие (h) загрузки, снабжены, каждая, идентификационным знаком, таким как штриховой код или что-либо подобное, и их складывают вертикально в стопку до 20 штук в каждой с образованием такой конфигурации, что четыре набора содержащих среду чашек (1а) Петри располагаются по внутренней периферии столика (4а) устройства (А₂) для культивирования. Таким образом, в устройстве (A₂) для культивирования могут быть размещены 80 содержащих среду чашек (1а) Петри. Среды (х) культивируют в течение заданного времени (6 часов, например) внутри устройства (A₂) для культивирования. Когда культивирование заканчивается, чашки (1а) Петри извлекают по одной из-под корпуса (Н) с помощью механизма (5а) выгрузки содержащих среду чашек Петри (фиг.7). После того как крышку каждой чашки (1а) Петри удаляют, среду (х) переносят в устройство для получения изображения (B₂) (цифровую видеокамеру) для фотографирования. Затем данные фотографирования вводят в узел арифметического процессора (C₂). После фотографирования содержащую среду чашку (1а) Петри закрывают крышкой и затем переносят в кассету (3а), расположенную в задней части, с помощью манипулятора (6а) переноса содержащих среду чашек Петри и с помощью челночного механизма (7а). В кассете (3а) содержащие среду чашки (1а) Петри складывают в стопки до 20 штук в каждой и располагают в четыре ряда для накопления. Затем их стерилизуют с помощью предварительного устройства (Du) для разгрузки (стерилизующая лампа или что-либо подобное). После этого кассету (3а) извлекают из корпуса (Н).

Интересной альтернативой было бы, чтобы вместо использования предварительного устройства (Du) для разгрузки внутри корпуса (Н) содержащая среду чашка (1а) Петри стерилизовалась бы после ее выгрузки из корпуса (Н). На фиг.9(b) показан вид спереди внутреннего пространства на фиг.9(а), но часть с узлом арифметического процессора (С₂) отсутствует. Фиг.9(с) представляет собой вид сбоку, подобным же образом изображающий внутреннее пространство на фиг.9(а). Является также принятым, чтобы внутри корпуса (Н) было установлено устройство для стерилизации, такое как, например, микроволновая печь или что-либо подобное. В настоящем воплощении используют культуральную среду, инокулированную бактериями. Необходимо заметить, однако, что настоящее изобретение никаким образом не ограничивается этим воплощением и что другие среды могут быть использованы селективно в зависимости от вида и формы среды (х). Оно может быть сконструировано таким образом, чтобы сигнальная лампа, звонок или что-либо подобное приводилось в действие, когда обнаружено, что уровень конкретных бактерий превышает заданный уровень. Является также принятым, чтобы устройство для измерения состояния температуры, влажности, пыли и тому подобное было отдельно установлено в камере или в каком-либо другом месте корпуса (Н), чтобы информация, получаемая от него, вводилась в узел арифметического процессора (С₂) для управления параметрами окружающей среды.

Фиг.10 представляет собой блок-схему, поясняющую процедуру, включающую стадии загрузки содержащей среду чашки (1а) Петри, накопление содержащих среду чашек (1а) Петри в устройстве (А₂) для культивирования, переноса их, определения завершения культивирования, выгрузки такой чашки (1а) Петри, переноса среды в устройство (В₂) для получения изображения после удаления верхней крышки чашки (1а) Петри, возвращения верхней крышки на место после того, как изображение получено, накопления и переноса в предварительное устройство (Du) для выгрузки, выгрузки и завершения работы.

Теперь будет описан механизм освещения, используемый для фотографирования среды (х). Необходимо, чтобы среда (х) была ярко освещена. Для достижения этой цели является обычным, чтобы среда освещалась сверху. Этот способ освещения является эффективным, когда среда тонкая. Но поскольку свет стремится пройти через нее, иногда трудно получить подробное изображение. Согласно настоящему изобретению существует возможность создания механизма освещения, изменяющего, когда это необходимо, интенсивность освещения на верхней и нижней поверхности. Этот механизм освещения проецирует освещающий свет в направлении среды (х) путем размещения ее в “сэндвиче” между другими средами. Освещающее устройство имеет функцию обратной связи, позволяющую автоматически устанавливать интенсивность освещения в зависимости от среды (х). При помощи такого расположения отраженный свет и проходящий свет поступают в среду (х) таким образом, что может быть сфотографировано изображение каждой части.

Эта процедура будет описана более подробно со ссылками на фиг.11(а) и 11(b). Фиг.11(а) показывает одно из изображений (Q) среды, где также изображены контур m колонии (c1₁) и трещина, образовавшаяся в колонии (c1₂). Предполагается, что освещающий свет проецируется только с одной стороны. Хотя контур m колонии (c1₁) является до какой-то степени заметным (детектируемым), в некоторых случаях необходимо подбирать интенсивность освещения для получения более точного контура m. Является более сложным получение четкого изображения трещины в колонии (с1₂) с той же интенсивностью освещения, как и интенсивность освещения для детектирования контура m. Далее, в порядке определения контура m является необходимым увеличение интенсивности освещения. Однако, если интенсивность освещения увеличивается, определение трещины n становится в некоторых случаях сложным. Согласно настоящему изобретению путем передачи освещающего света от нижней поверхности может быть получен более детальный контур m’, как показано на фиг.5(b). Также с помощью изменения интенсивности освещения осветительного устройства в зависимости от среды (х) могут быть получены изображения более мелких частей трещины n’.

На фиг.12 показано, как два источника (I_о), (II_о) света и две принимающих свет части (I’_o), (II’_o) расположены по отношению к среде (х) и позиционное взаимное соотношение узла управления (С_r) с источниками (I_о), (II_о) света и с принимающими свет частями (I’_o), (II’_o). Таким образом, в настоящем воплощении используют два типа источников света. Из двух источников (I_о), (II_о) света источник (I_о) света служит в качестве опорного источника света, а другой источник (II_о) света испускает свет всех цветов видимого спектра. Источник (I_о) света расположен таким образом, чтобы окружать среду (х). При работе этот источник (I_о) света проецирует опорный свет, свет, отраженный средой (х), детектируют с помощью принимающей свет части (I’_о) и сигнал посылают в управляющий узел (С_r). Управляющий узел (С_r) сравнивает получаемый сигнал с проецирующимся сигналом и посылает оптимальный сигнал источнику (I_о) света. Такая же операция проделывается также по отношению к другому источнику (II_о) света. Таким образом, признаки среды (х) более точно различают путем использования двух видов источников света. Количество таких источников света может быть увеличено. Является также эффективным, чтобы интенсивность освещения могла изменяться конструктивно.

Цифровая видеокамера имеет возможность движения в небольших пределах. На фиг.13 показано, как перемещается изображение до и после перемещения цифровой видеокамеры (К). То есть цифровая видеокамера (К) установлена на механизме, способном перемещать ее как в направлении Х-оси, так и в направлении Y-оси, и, как показано на фиг.13(b), изображение (Q’₁) перед перемещением и (Q’₂) после перемещения перекрываются, результатом этого является операция интерполяции для формирования изображения (Q’’), так что разложение улучшается. Изображение N, полученное таким способом, получают путем деления изображения N₀ перед перемещением плюс изображение N₁ после перемещения на два. Такой же результат также может быть получен путем использования, там, где это необходимо, механизма для перемещения среды (х) без перемещения цифровой видеокамеры (К).

Фиг.14 представляет собой блок-схему, изображающую всю процедуру в целом, включая стадии получения изображения (Q’₁), перемещения по осям Х и Y, получения изображения (О’₂), получения изображения (Q’’) путем интерполяционной цифровой обработки и завершения.

Является также принятым, чтобы испускающий свет материал при облучении лучом света, таким как луч света из диапазона ближнего ультрафиолета, смешивался с материалом, формирующим саму чашку Петри для содержания среды, чтобы изображение могло считываться при испускании флуоресцентного света. Таким путем точность определения может быть увеличена.

Промышленная применимость

Для исследования собранной среды при обработке продовольствия важно знать, насколько быстро размножаются бактерии, если в среде определены ядовитые бактерии. Быстро размножающиеся бактерии могут вызывать отравление продовольствием. Однако исследование микробов обычно требует определенного времени в зависимости от вида бактерии. Необходимое время также изменяется даже для одного и того же вида бактерий в зависимости от условий окружающей среды. Настоящее изобретение представляет возможность предварительной идентификации вида бактерии и прогноза скорости роста бактерий в среде за короткое время. Согласно настоящему изобретению состояние идентификационных бактерий после прохождения заданного времени может стать известным заранее за короткое время.

В настоящем изобретении изображение бактерий, культивируемых в течение короткого времени (от около 5 до 6 часов) разделяют на три первичных цвета, затем вычисляют гистограмму, колориметрическую характеристику и оттенок цвета для каждого цвета для установления коэффициента роста для прогноза роста колоний бактерий и коэффициента признака для определения признаков, специфических для каждого микроба. Затем все это сравнивают с данными, которые предварительно вычисляют таким же способом, как рассмотрено выше, и накапливают. В соответствии с необходимостью интегральные данные, содержащие обобщенную информацию, исследуют для сравнения. Таким образом идентифицируют вид бактерии. Затем, используя коэффициент роста и тому подобное, прогнозируют состояние размножения бактерий после прохождения времени (24, 48 часов, например), обычно требуемого для культивирования бактерий, тем самым состояние размножения бактерий после прохождения заданного времени может легко стать известным за короткое время. Настоящее изобретение предлагает способ и установку, определяющие микробы с высокой точностью. Также согласно настоящему изобретению устройства для точного фотографирования микробов и исследования среды размещают как одну группу в корпусе, так что среду могут определять автоматически и результаты исследования могут эффективно накапливаться. Кроме того, среда может быть легко стерилизована. Установки с такой конструкцией могут быть установлены в различных инспектирующих организациях и в других местах. С помощью такой установки исследуемую среду можно определять автоматически без какой-либо информации о среде и результаты накапливать для будущих обследований. Далее, путем стерилизации среды заданным способом среду можно безопасно сбрасывать. Таким образом, любой человек может точно исследовать продовольствие без необходимости в специалистах.

То есть согласно настоящему изобретению без интенсивных тренировок, кто угодно может легко и эффективно исследовать состояние размножения микробов.

Согласно настоящему изобретению реальное состояние микробов можно исследовать только путем культивирования их в течение короткого времени (обычно требовалось около 24 или 48 часов, как указано выше). Путем накопления и сравнения данных о микробах вид микробов может быть точно определен путем идентификации микробов и прогнозирования состояния размножения. Более того, путем увеличения объема и дополнительного накопления данных для сравнения точность исследования может быть дополнительно повышена.

Настоящее изобретение может быть полезно для улучшения системы обеспечения надежности продовольствия, а также быть исключительно полезным для выполнения требований закона PL, НАССР (Hazard Analysis Critical Control Point) или GMP (Good Manufacturing Practice), которые в последнее время стали широко известны. Кроме того, настоящее изобретение может применяться не только в области продовольствия, включая питьевую воду, но также в области клинической медицины, санитарной медицины, сельского хозяйства, окружающей среды, морской воды, сточных и других вод, лесоводства, воздушной среды, и многих других, где могут распространяться микробы.

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа исследования микробов, преимущественно в продовольственных продуктах, на предмет загрязнения их патогенными и другими микробами, детектирования и/или идентификации бактерий и других микробов. Способ предусматривает получение изображения исследуемой среды, содержащей микробы, подвергнутой воздействию освещением, обработке красителем до или после культивирования в чашке Петри. Полученное изображение разделяют на три первичных цвета, вычисляют хроматические данные гистограммы, колориметрическую характеристику и определяют оттенки цвета для каждого первичного цвета. Сравнивают полученные данные с предварительно накопленными данными с помощью аналогичной процедуры разделения изображения на три первичных цвета, и выделяют признаки, специфические для идентификации вида микробов. Затем проводят прогнозирование состояния размножения исследуемых микробов после культивирования в течение заданного времени, учитывая фактическое состояние исследуемых микробов после окончания культивирования микробов в течение заданного времени. Установка для осуществления способа исследования микробов включает корпус, имеющий входное отверстие для загрузки чашек Петри с помощью механизма загрузки, расположенные в корпусе круглый столик, установленный с возможностью вращения и служащий для складирования подаваемой по одной чашек Петри в вертикальную стопку, механизм выгрузки чашек Петри, устройства освещения и обработки красителем среды, устройство для получения изображения, компьютер с монитором и механизм подачи заданного количества чашек Петри в кассету. Изобретение позволяет повысить точность исследования за счет увеличения объема дополнительно накопленных специфических данных для сравнения состояния размножения микробов, предоставляет возможность предварительной идентификации вида бактерии и прогнозирует скорость размножения микробов за более короткое время исследования. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 14 ил.

1. Способ исследования микробов, предусматривающий получение изображения исследуемой среды, содержащей микробы, подвергнутой воздействию освещением, обработке красителем до или после культивирования в чашке Петри, разделение полученного изображения на три первичных цвета, вычисление хроматических данных гистограммы, колориметрической характеристики и определение оттенка цвета для каждого первичного цвета, сравнение полученных данных с предварительно накопленными данными с помощью аналогичной процедуры разделения изображения на три первичных цвета и выделение признаков, специфических для идентификации вида микробов, и затем прогнозирование состояния размножения исследуемых микробов после культивирования в течение заданного времени, причем прогнозирование размножения микробов осуществляют с учетом фактического состояния исследуемых микробов после окончания культивирования микробов в течение заданного времени.2. Установка для осуществления способа исследования микробов, содержащая корпус, имеющий входное отверстие для загрузки чашек Петри с помощью механизма загрузки, расположенные в корпусе круглый столик, установленный с возможностью вращения и служащий для складирования подаваемой по одной чашек Петри в вертикальную стопку, механизм выгрузки чашек Петри, устройства освещения и обработки красителем среды, устройство для получения изображения, компьютер с монитором и механизм подачи заданного количества чашек Петри в кассету.3. Установка по п.2, отличающаяся тем, что устройство освещения содержит, по меньшей мере, один источник света.4. Установка по п.2, отличающаяся тем, что она снабжена устройством для стерилизации исследуемой среды.5. Установка по п.2, отличающаяся тем, что она снабжена сигнальной лампой, звонком для сигнализации о том, что превышен заданный уровень размножения конкретных микробов.6. Установка по п.2, отличающаяся тем, что указанный корпус размещен в камере, содержащей устройство, выполненное с возможностью измерения температуры, влажности и запыленности в пространстве указанной камеры и с возможностью ввода полученных данных в указанный компьютер для управления параметрами в указанном пространстве.