СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ПО ВИРУЛЕНТНОСТИ IN VITRO Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, и в частности, к определению вирулентности и дифференциации штаммов Bacillus anthracis по этому признаку in vitro.

Патогенность сибиреязвенного микроба определяется двумя факторами - капсулой и экзотоксином. Эти два основных фактора патогенности продуцируются микроорганизмом in vivo в ходе патологического инфекционного процесса в организме чувствительного к сибирской язве животного или человека, а также in vitro при культивировании на искусственных питательных средах в условиях, моделирующих внутреннюю среду макроорганизма. Штаммы сибиреязвенного микроба различаются по продукции этих факторов, что в результате определяет их разную вирулентность. Поэтому вирулентность штаммов можно оценить in vivo по величине дозы клеток B.anthracis, вызывающей гибель половины при всех взятых в опыт животных, либо in vitro по наличию и характеру продукции капсулы и экзотоксина.

Известен способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vivo [1] заключающийся в приготовлении взвеси спор сибиреязвенного микроба с концентрацией 1, 10, 100, 1000 и 10000 спор в заражающей дозе, каждой из которых заражают по 6 белых беспородных мышей или по 3 кролика либо морской свинке каждой из последних трех доз. Затем регистрируют гибель животных от сибирской язвы в течение 10 дней после заражения, вычисляют DCL для кроликов или морских свинок, либо LD₅₀ для белых мышей. Штаммы относят к вирулентным, если DCL для морских свинок или кроликов либо LD₅₀ для белых мышей не превышает 10000 спор.

Недостатками этого способа являются использование большого количества лабораторных животных (30 белых мышей или 9 морских свинок либо кроликов), зависимость получаемых результатов от физиологического состояния животных, неоднозначность определения вирулентности на разных видах лабораторных животных, низкая степень дифференцированности штаммов с выделением только двух групп вирулентные и авирулентные.

Наиболее близким к предлагаемому является способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro [2] который включает параллельный высев штаммов на питательный агар и среду капсулообразования, культивирование посевов на питательном агаре в воздушной атмосфере, а на среде капсулообразования в атмосфере CO₂ с последующим учетом капсулообразования и дифференциацией штаммов на 3 группы в зависимости от способности к капсулообразованию и его характера. I образующие капсулу в атмосфере CO₂, II образующие капсулу в атмосфере CO₂ и на воздухе, III не образующие капсулу, при этом I группу составляют вирулентные штаммы, а II и III авирулентные.

Недостатком этого способа является невозможность отдифференцировать по вирулентности штаммы I и III группы, хотя в опытах на белых мышах in vivo штаммы II группы оказываются вирулентными, а III группы авирулентными. Этот недостаток определяется невозможностью учитывать токсинообразование штаммов.

Было экспериментально показано, что при одновременном определении in vitro продукции капсулы в атмосфере CO₂ и на воздухе и продукции токсина в атмосфере CO₂ все штаммы можно разделить на 5 групп, имеющих разную вирулентность, определенную в эксперименте на животных.

Целью изобретения является повышение точности способа дифференциации штаммов по вирулентности in vitro.

Цель достигается тем, что способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro включает параллельный высев клеток испытуемых штаммов на поверхность питательного агара и плотной среды капсулообразования, культивирование посевов на питательном агаре в воздушной атмосфере, а на среде капсулообразования в атмосфере CO₂ с последующим учетом образования капсулы, причем в качестве питательного агара используют агар Хоттингера, а в качестве среды капсулообразования агар для иммунологического исследования, содержащий антитоксические антитела (RYE), посевы на нем культивируют в течение 40-48 ч при 35-37^oC, затем выдерживают при 4-10^oC в течение 48-72 ч и проводят дополнительно учет образования штаммами токсина.

По отношению к прототипу у заявляемого способа имеются отличительные признаки использование в качестве питательного агара Хоттингера, в качестве среды капсулообразования RYE, культивирование на RYE в атмосфере CO₂ в течение 40-48 ч при 35-37^oC с последующим выдерживанием при 4-10^oC в течение 48-72 ч и учет образования токсина.

Этим достигается поставленная цель повышение точности дифференциации штаммов по вирулентности in vitro.

Предлагаемый способ позволяет выделить вместо 2 степеней 5 степеней вирулентности штаммов с соответствующим фенотипом:
1. Высоковирулентные, образующие капсулу и токсин в атмосфере CO₂ и не образующие капсулу на воздухе.

2. Умеренновирулентные, образующие капсулу и не образующие токсин в атмосфере CO₂ и не образующие капсулу на воздухе.

3. Слабовирулентные, образующие капсулу в атмосфере CO₂ и на воздухе и не образующие токсин в атмосфере CO₂.

4. Авирулентные не образующие капсулу в любых условиях и образующие токсин в атмосфере CO₂;
5. Апатогенные не образующие капсулу и токсин. Кроме более высокой точности дифференциации способ имеет преимущество также перед известным способом дифференциации штаммов по вирулентности in vivo, так как не требует использования лабораторных животных, сокращает время исследования (с 10 до 6 сут) и материальные затраты, позволяя использовать для дифференциации 50 штаммов вместо 300 кроликов или морских свинок или 1500 белых мышей 4 чашки с питательными средами.

Изобретение осуществляется следующим образом. RYE [3] готовят путем растворения в 358 мл дистиллированной воды ингредиентов, которые берут в соотношении, г:
1-Аргинин•HCl 0,125
1-Аспарагиновая кислота 0,184
1-Валин 0,137
1-Гистидин•HCl 0,055
Глицин 0,065
1-Глутамат натрия 0,612
1-Изолейцин 0,170
1-Лейцин 0,230
1-Лизин 0,230
1-Метионин 0,073
1-Пролин 0,043
1-Серин 0,235
1-Треонин 0,120
1-Тирозин 0,144
1-Триптофан 0,035
1-Фенилаланин 0,125
1-Цистин 0,025
Аденин 0,0021
Урацил 0,0014
Тиамин•HCl 0,001
CaCl₂•2H₂O 0,012
MgSO₄•H₂O 0,0099
MnSO₄•H₂O 0,0009
K₂HPO₄ 3,000
NaHCO₃ 8,000
d(+)глюкоза 2,500
Дрожжевой экстракт 8,000
Контролируют pH среды и при необходимости доводят его до 8,0. Полученный раствор питательной основы среды стерилизуют путем фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22-0,45 мкм. Навеску агарозы 15 г расплавляют в 500 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121^oC в течение 20 мин. К расплавленной и охлажденной до 50^oC агарозе добавляют стерильно раствор питательной основы в объеме 358 мл и баранью антисыворотку против спор сибиреязвенного вакцинного штамма 34F₂ в объеме 142 мл, перемешивают и разливают в чашки Петри по 10-12 мл. Готовят суспензии спор исследуемых штаммов с оптической плотностью, соответствующей ОСО мутности ГИСК 10 ед. Посевной материал наносят петлей бляшками диаметром 3-4 мм или репликатором от 5 до 25 инокулятов параллельно на одну чашку с RYE и одну чашку с агаром Хоттингера. Для контроля качества среды засевают культуру заведомо вирулентного штамма. Чашки с RYE помещают в микроанаэростат или CO₂-инкубатор. Из микроанаэростата вакуумным насосом откачивают 25% воздуха, ориентируясь на показания мановакуумметра, и замещают его углекислым газом. В CO₂-инкубаторе чашки культивируют с 10% углекислого газа. Посевы на RYE выращивают при 35-37^oC в течение 40-48 ч, затем переносят чашки из микроанаэростата или CO₂-инкубатора в холодильник и выдерживают там 48-72 ч при 4-10^oC. Чашки с агаром Хоттингера инкубируют при 37^oC в обычной воздушной атмосфере 24 ч.

По окончании указанных сроков инкубации просматривают чашки, регистрируя морфологию колоний. Продуцирующие капсулу культуру формируют колонии в SM-форме округлые, гладкие, блестящие, со слизистым капсульным веществом на поверхности. Не продуцирующие капсулу культуры растут в R-форме в виде шероховатых с волокнистым краем матовых тусклых сухих колоний. Для подтверждения факта образования капсулы с колоний приготовляют мазки для микроскопии. На обезжиренных предметных стеклах делают мазки, подсушивают на воздухе и фиксируют в 96^o этаноле с 6% перекиси водорода в течение 20 мин. Мазки окрашивают раствором Ребигера в течение 15-20 с, промывают и высушивают. Микроскопируют мазки, пользуясь объективом 90 с масляной иммерсией. Капсулы окрашиваются в розовый цвет или остаются неокрашенными, бактерии в темно-фиолетовый.

Токсинообразование выявляют по методу [3] Для этого чашки с RYE просматривают при естественном освещении на черном фоне, пользуясь листом черной бумаги. Вокруг продуцирующих токсин колоний в среде формируются концентрические ореолы иммунопреципитации в виде белых тонких колец. На продуцирующие токсин колонии лишены таких ореолов.

Культуры относят к:
1) высоковирулентным, если они продуцируют капсулу и токсин в атмосфере CO₂ и не продуцируют капсулу на воздухе;
2) умеренновирулентным, если они не продуцируют токсин, продуцируют капсулу в атмосфере CO₂ и не продуцируют ее на воздухе;
3) cлабовирулентным, если они не продуцируют токсин и продуцируют капсулу в атмосфере cO₂ и на воздухе;
4) авирулентным, если они продуцируют токсин, но не продуцируют капсулу;
5) апатогенным, если они не продуцируют ни капсулу, ни токсин.

Результаты экспериментальных испытаний изобретения иллюстрируются сравнительными таблицами и графическими материалами.

В табл.1 представлены сравнительные результаты дифференциации штаммов B. anthracis предлагаемым способом и способом-аналогом; в табл.2 - сравнительные результаты дифференциации штаммов B.anthracis in vitro предлагаемым способом и способом-прототипом; в табл.3 результаты дифференциации штаммов B.anthracis по вирулентности in vitro предлагаемым способом с использованием репликатора.

На фиг.1 представлены рисунки колоний на чашках Петри для дифференциации штаммов B. anthracis по вирулентности предлагаемым способом и способом-прототипом, где A чашка с RYE, B чашка с агаром Хоттингера, C - чашка с бикарбонатным агаром. Номера секторов соответствуют порядковым номерам штаммов, приведенных в табл. 2. На чашках Петри A и B учет роста колоний изучаемых штаммов по предлагаемому способу. На чашках B и C учет роста колоний тех же штаммов по способу-прототипу.

На фиг. 2 представлены рисунки колоний штаммов на чашках Петри, дифференцируемых по предлагаемому способу с использованием репликатора, где A чашка с RYE, B чашка с агаром Хоттингера, C схема расположений колоний штаммов на чашках A и B. Номера колоний на рисунке C соответствуют порядковым номерам штаммов, приведенных в табл.3.

На фиг. 3 представлены рисунки колоний штаммов на чашках Петри с RYE, дифференцируемых по предлагаемому способу, с разным временем культивирования в атмосфере CO₂ при 37^oC, где A время культивирования 24 ч, B - время культивирования 40 ч, C время культивирования 48 ч, D время культивирования 72 ч. Номера секторов на чашках соответствуют порядковым номерам штаммов, приведенных в табл.2.

Возможность практического осуществления изобретения с использованием полной совокупности заявляемых признаков показана на конкретных примерах выполнения.

Пример 1. Готовили в соответствии с прописью одну чашку RYE и одну чашку агара Хоттингера. Готовили взвеси спор с оптической плотностью, соответствующей ОСО ГИСК 10 ед. следующих штаммов сибиреязвенного микроба: 81/1, 228, 140П, СТИ-1, 12/16-1. На поверхность одной чашки с каждой из сред, предварительно расчертив обратную сторону дна чашки на секторы или квадраты, засевали бляшкой бактериологической петлей в соответствующие секторы взвеси спор перечисленных штаммов. Чашку с агаром Хоттингера помещали в термостат с температурой 37^oC и обычной воздушной атмосферой, выдерживали в течение 24 ч, после чего учитывали капсулообразование. Чашку с RYE помещали в микроанаэростат, из которого откачивали 25% воздуха и замещали углекислым газом, выдерживали при 37^oC в течение 48 ч, после чего учитывали капсулообразование, а затем переносили в холодильник и выдерживали при 4^oC в течение 72 ч. По окончании этого срока учитывали токсинообразование на RYE и проводили дифференциацию штаммов в соответствии с приведенной схемой.

Готовили взвеси спор этих же штаммов с таким расчетом, чтобы в 0,2 мл содержалось по 1, 10, 100, 1000 и 10000 спор для каждого штамма. Этими дозами заражали белых беспородных мышей (по 6 животных на одну дозу), а дозами 100, 1000 и 10000 спор заражали по 3 кролика. Регистрировали гибель животных от сибирской язвы в течение 10 дней после заражения и определяли LD₅₀ для белых мышей и DCL для кроликов в соответствии с [1] Если LD₅₀ для белых мышей или DCL для кроликов не превышали 10000 спор, штаммы относили к вирулентным, если они были выше 10000 считали авирулентными.

Пример 2. Готовили в соответствии с прописями по одной чашке питательных сред: 1) RYE, 2) 1%-ный бикарбонатный агар, 3) агар Хоттингера. Для приготовления 1% -ного бикарбонатного агара 10 г питьевой соды растворяли в 100 мл стерильной дистиллированной воды при легком подогревании на пламени спиртовки, затем в 100 мл расплавленного и охлажденного до 50^oC агара Хоттингера добавляли 10 мл полученного 10%-ного содового раствора и разливали в чашки Петри. Готовили взвеси спор с оптической плотностью, соответствующей ОСО ГИСК 10 ед. следующих штаммов сибиреязвенного микроба: 81/1, 228, 140П, СТИ-1, 12/16-1. На поверхность одной чашки с каждой из сред, предварительно расчертив обратную сторону дна чашки на секторы или квадраты, засевали бляшкой бактериологической петлей в соответствующие секторы взвеси спор перечисленных штаммов. Чашку с агаром Хоттингера помещали в термостат с температурой 37^oC и обычной воздушной атмосферой, выдерживали в течение 24 ч, после чего учитывали капсулообразование. Чашки с RYE и бикарбонатным агаром помещали в микроанаэростат, из которого откачивали 25% воздуха и замещали углекислым газом, выдерживали при 35^oC в течение 48 ч, после чего учитывали капсулообразование, а затем чашку с RYE переносили в холодильник и выдерживали при 10^oC в течение 48 ч. По окончании этого срока учитывали токсинообразование на RYE. Дифференциацию штаммов в соответствии с предлагаемым способом проводили, учитывая результаты роста на RYE и агаре Хоттингера, а по способу-прототипу учитывая рост на бикарбонатном агаре и агаре Хоттингера.

Пример 3. Готовили чашку с RYE по прописи и технологии, приведенным выше, а также чашку с агаром Хоттингера. Аналогично примеру 1 готовили взвеси спор 25 штаммов сибиреязвенного микроба. На пару чашек агар Хоттингера-RYE засевали параллельно 25 штаммов с использованием репликатора с 25 штырьками, для чего в каждую из лунок матрицы репликатора вносили по 0,1 мл взвеси спор одного из штаммов, затем опускали в матрицу репликатор и переносили его на поверхность плотной среды RYE. Эту же операцию повторяли с чашкой агара Хоттингера. Инкубировали чашки и учитывали результаты, как описано в предыдущем примере.

Пример 4. Готовили, как описано выше, 4 чашки RYE и одну чашку агара Хоттингера. Засевали на сектора чашек петлей бляшками те же штаммы, что и в примере 1. Одну чашку RYE выращивали в анаэростате в течение 24 ч, вторую 40 ч, третью 48 ч и четвертую 72 ч. По окончании этих сроков учитывали капсулообразование, а после выдерживания чашек в течение 72 ч в холодильнике - токсинообразование. Дифференциацию штаммов проводили, как описано в предыдущих примерах.

Как видно из табл.1, дифференциация предлагаемым способом позволяет выделить 5 групп штаммов вместо 2, выделяемых при дифференциации по способу-аналогу. Различия в вирулентности первых трех групп, выявляемые при использовании предлагаемого способа, подтверждаются количественными различиями в величине ЛД₅₀ для белых мышей. В предлагаемом способе устраняется неоднозначность трактовки вирулентности штаммов 3 группы, свойственная способу-аналогу при использовании разных лабораторных животных, при которой штамм 140П может быть расценен как вирулентный (для белых мышей) и как авирулентный (для кроликов). Таким образом, предлагаемый способ повышает точность определения и объективность получаемых результатов по сравнению со способом-аналогом.

Сравнительные результаты дифференциации предлагаемым способом и способом-прототипом, отраженные в табл.2 и на фиг.1, показывают, что в способе-прототипе (B и C, фиг.1) не учитывается продукция токсина штаммами, и дифференциация ведется только на основании различий в продукции капсулы. Продуцирующие капсулу штаммы (1, 2 и 3) формируют на RYE (C) и агаре Хоттингера (B) округлые слизистые блестящие колонии, покрытые слоем капсульного вещества. В отличие от способа-прототипа в предлагаемом способе (A и B, фиг.1) на RYE (A), кроме капсулообразования у штаммов 1,2 и 3, регистрируется еще и токсинообразование у штаммов 1 и 4 в виде хорошо заметных на темном фоне белых колец иммунопреципитации вокруг колоний в среде в чашке Петри. Учет токсинообразования позволяет выделить вместо 2-х групп вирулентности в способе-прототипе 5 групп (табл.2) и тем самым повысить точность дифференциации штаммов in vitro.

Использование репликатора с 25 штырьками позволяет одновременно проводить дифференциацию до 25 штаммов на одной чашке Петри с RYE и одной с агаром Хоттингера. На фиг.2 видно, что близкорасположенные колонии, продуцирующие токсин, окружены слившимися ореолами иммунопреципитации, что позволяет сразу же выделить их среди остальных колоний. Учет капсуло- и токсинообразования позволяет одновременно дифференцировать все 25 штаммов с разделением их на 5 групп, что отражено в табл.3.

Результаты экспериментов показали, что заявленный интервал времени культивирования на RYE прт 37^oC в атмосфере CO₂ необходим и достаточен для получения нужного результата. На фиг.3 видно, что культивирование в течение 24 ч недостаточно, так как колонии малы, а иммунопреципитация не отмечается (A). Культивирование в течение 40 (B) и 48 (C) ч обеспечивает хорошо заметное глазом токсинообразование (1 и 4) и капсулообразование (1,2 и 3). При культивировании в течение 72 ч колонии "перерастают" и учет токсинообразования становится невозможным (D).

Результаты экспериментов показали, что заявленные интервалы температур культивирования 35^oC(пример 2)- 37^oC(пример 1) и выдерживания на холоде чашек с посевами на RYE 4^oC(пример 1)- 10^oC(пример 2), а также времени выдерживания их на холоде 48 ч(пример 1)- 72 ч(пример 2) необходимы и достаточны для получения необходимого положительного результата.

Таким образом, предлагаемый способ дифференциации штаммов B.anthracis по вирулентности in vitro повышает точность дифференциации. В отличие от известных способов, он позволяет выделить вместо 2-х 5 групп штаммов с отличающейся вирулентностью. Способ требует значительно меньших затрат времени и средств, не связан с использованием лабораторных животных и поэтому лишен недостатков способа in vivo, определяемых различиями в чувствительности к инфекции у разных видов лабораторных животных и физиологическом состоянии животных одного вида.

Источники информации
1. Бургасов П.Н. Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М. Медицина, 1984. -208 с.

2. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis//Ann. Met.N.-Y.Acad.Sci.-1960.-Vol.88.-N 6.-P.1024-1033.

3. Ivins B. E. Welkos S.L. Cloning and expression of Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis//Infect.and Immun.-1986.-Vol. 54.-N 2.-P.537-542.

Использование: медицинская микробиология, дифференциация штаммов по вирулентности, эпидемиологический и эпизоотологический анализ при сибирской язве, внутривидовая таксономия Bacillus anthracis. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве дополнительного критерия для дифференциации наряду с капсулообразованием in vitro используется токсинообразование. Продукция капсулы и токсина определяется одновременно на агаре для иммунологического исследования. Это позволяет дифференцировать штаммы на 5 групп: высоковирулентные, умеренновирулентные, слабовирулентные, авирулентные и апатогенные, в отличие от существующего способа, выделяющего только две группы: вирулентные и авирулентные. 3 табл., 3 ил.

Способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro, включающий параллельный высев клеток испытуемых штаммов на поверхность питательного агара и плотной среды капсулообразования, культивирование посевов на питательном агаре в воздушной атмосфере, а на среде капсулообразования в атмосфере CO₂ с последующим учетом образования капсулы, отличающийся тем, что в качестве питательного агара используют агар Хоттингера, а в качестве среды капсулообразования агар для иммунологического исследования, содержащий антитоксические антитела, посевы на нем культивируют в течение 40 48 ч при 35 37^oС, затем выдерживают при 4 10^oС в течение 48 72 ч и проводят дополнительно учет образования токсина.