СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ШТАММОВ BACILLUS ANTHRACIS К СИБИРЕЯЗВЕННОМУ БАКТЕРИОФАГУ Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/07 C12R1/92 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам характеристики штаммов по количественному содержанию в их популяции клонов, резистентных к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов.

Лизабельность сибиреязвенными бактериофагами является одним из основных тестов, позволяющих идентифицировать сибиреязвенные культуры, выделенные из объектов внешней среды, а также из материала от больных людей и животных. Явление фаголизабельности и фагорезистентности представляет интерес не только в плане идентификации сибиреязвенных культур и их дифференциации от близкородственных сапрофитов. В литературе описаны фагорезистентные штаммы В. anthracis и выделенные субкультуры (Ипатенко с соавт., 1987; Васильев с соавт., 1998). Некоторые авторы связывают изменение чувствительности сибиреязвенных штаммов к литическому действию специфических бактериофагов с определенными биологическими свойствами этих штаммов (Обносова, Шуляк, 1978; Thome, 1985).

В настоящее время накоплено немало данных о неоднородности популяций штаммов возбудителя сибирской язвы по различным генетическим и фенотипическим признакам, в том числе и по устойчивости к бактериофагам. Это делает методы, позволяющие оценить степень однородности состава штаммов по тем или иным свойствам, ценным механизмом изучения роли отдельных клонов с измененными биологическими свойствами в сохранении вида при изменении условий существования (пассажи на питательных средах и через организм животных, воздействие физических, химических и биологических факторов).

Существует целый ряд методов, позволяющих определять чувствительность культур к сибиреязвенным бактериофагам: микрометод, пробирочный метод, метод стекающей капли, метод нарастания титра фага. Все эти методы разработаны для идентификации выделенных культур, т.е. направлены на выявление чувствительных к литическому действию фагов бактериальных клеток, что служит одним из критериев их принадлежности к В. anthracis.

Наиболее близким по существу является микрометод определения чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам (Ипатенко с соавт., 1987).

Для сокращения срока исследования используют молодые, 3-6-часовые культуры. При исследовании агаровых культур или смыва 5-6-часовых культур готовят взвеси бактерий в физиологическом растворе с концентрацией 125-500 млн. м.к. в 1 мл по оптическому бактерийному стандарту. Бульонные культуры исследуют в такой же концентрации. Пробирки с взвесью клеток бактериальной культуры тщательно встряхивают до получения равномерного помутнения и оставляют на 5-10 мин для отстаивания комочков культуры.

Исследования проводят в бактериологических чашках, в которые заранее (за день) ровным слоем толщиной 3-5 мм наливают дрожжевой или 1,5-2%-ный мясопептонный агар (рН 7,4-7,6). Если агар разливается в день исследования, то его необходимо подсушить в термостате в течение 2-3 ч.

Подсушенную поверхность агара разделяют горизонтальными и вертикальными линиями на три участка в каждом ряду. Каждый ряд участков по вертикали нумеруют и используют для исследования одной микробной культуры. На три участка одного вертикального ряда наносят по одной бактериологической петле подготовленную к исследованию культуру и подсушивают 5 мин. Затем на первые два участка наносят пастеровской пипеткой по 1 капле цельного бактериофага, распределяя его по поверхности в пределах границ участка. Третий горизонтальный ряд служит контролем исследуемой культуры. Чашки оставляют на 10-15 мин при комнатной температуре для подсушивания, затем переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при 37°С. Результаты учитывают через 2-4 ч (молодые 3-6-часовые культуры) или 4-6 ч инкубирования (старые культуры); учет можно производить и через 12-24 ч. В первом случае чашки просматривают при малом увеличении микроскопа, а во втором и третьем - невооруженным глазом и при помощи лупы. Результаты исследования учитывают по наличию или отсутствию лизиса бактерий на участках с бактериофагом в сравнении с ростом культуры на контрольном участке. Если на участках с бактериофагом отмечается зона лизиса культуры, то эта культура чувствительна к данному бактериофагу.

Близким по своей сути является также метод стекающей капли. В 6 пробирок на поверхность скошенного агара наносят по одной капле исследуемой культуры. Каплю равномерно распределяют по всей поверхности агара и пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 15 мин. Затем в 4 пробирки вносят по одной капле неразведенного бактериофага и пробирки вновь ставят в термостат на 6-18 ч. Если испытуемая культура чувствительна к лизирующему действию бактериофага, то по ходу стекающей капли отсутствует рост исследуемой культуры, тогда как в контрольных пробирках, куда фаг не вносили, наблюдается сплошной рост культуры. Если «дорожки» нет, то испытуемая культура не чувствительна к бактериофагу.

Недостатком этих двух очень близких по своей сути методов является то, что ввиду крайне малой площади поверхности, обработанной фагом, они выявляют лишь общую чувствительность микробных клеток данной популяции к литическому действию бактериофага и не способны выявлять различия в чувствительности отдельных особей. Это обусловлено и тем, что исходным посевным материалом является агаровая культура, которая при посеве в бульон или приготовлении бактериальной взвеси берется из одной или, в лучшем случае, из нескольких колоний. При посеве в бульон взвеси спор на протяжении нескольких генераций вегетативных клеток в течение 3-6 ч изменяется исходное соотношение клонов с различными биологическими свойствами, включая чувствительность к бактериофагам.

Учитывая, что сибиреязвенные культуры в отечественных коллекциях штаммов хранятся в виде спор, определенный интерес представляет количественное определение содержания фагорезистентных клонов непосредственно в споровой взвеси без предварительных пассажей на питательных средах, изменяющих это соотношение.

Целью изобретения является повышение чувствительности метода за счет увеличения числа исследуемых особей первичной популяции штамма (исследуется не менее 500 к.о.е.), увеличения достоверности, т.к. отсутствуют промежуточные генерации вегетативной культуры, а также повышение точности метода, т.е. возможности количественной характеристики исходной споровой взвеси штамма по чувствительности к бактериофагу.

Поставленная цель достигается тем, что взвесь спор концентрацией 10³ спор в 1 мл засевается на поверхность 10-20 подсушенных пластин питательного агара строго по 0,1 мл на каждую, после подсушивания поверхность 5-10 чашек обрабатывается цельным препаратом бактериофага. Посевы инкубируют 20-24 ч. Результаты учитывают, сравнивая количество колоний, выросших на контрольных чашках, не обработанных фагом (100%) с количеством колоний на чашках, обработанных тем или иным бактериофагом (х%), которые могут быть отсеяны для дальнейшего изучения.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Применение в качестве посевного материала непосредственно взвеси спор, дающей после инкубации при 37°С рост возбудителя в виде изолированных колоний, исследование на чувствительность к бактериофагу значительного количества (не менее 500) к.о.е., которые более достоверно представляют популяцию штамма, при этом исключаются промежуточные генерации вегетативного размножения, учет результатов путем подсчета фагорезистентных колоний в сравнении с общим числом колоний позволяет дать четкую количественную характеристику штаммов по данному признаку и сравнить различные штаммы.

Способ осуществляется следующим образом. Используя отраслевой стандарт мутности ГИСК им. Л.И.Тарасовича, готовят взвеси спор изучаемых штаммов, соответствующие 10 ед. оптической мутности, и методом десятикратных разведении титруют до разведения 10^-5, с которым ведется дальнейшая работа. При равномерном посеве 0,1 мл такой взвеси спор на всю поверхность чашки Петри с плотной питательной средой, как правило, вырастает от 50 до 100 изолированных колоний.

Чашки Петри с заранее разлитой любой плотной питательной средой, пригодной для культивирования сибиреязвенного микроба (агар Хоттингера с рН 7,4-7,6, селективная среда для выделения или культивирования сибиреязвенного микроба), перед засевом помещают в термостат при 37°С с приоткрытой крышкой на 1-1,5 ч для подсушивания.

На 10-20 чашек с плотной питательной средой наносят точно по 0,1 мл подготовленной взвеси спор, которую распределяют по поверхности плавными вращательными движениями. После полного впитывания жидкости половину засеянных чашек, которые в дальнейшем служат контролем, убирают в термостат, а на оставшиеся 5-10 засеянных агаровых пластин наносят по 0,5 мл препарата бактериофага, тщательно следя за тем, чтобы вся поверхность была обработана препаратом. После этого чашки с приоткрытыми крышками помещают в термостат до полного впитывания жидкости. Затем чашки переворачивают и инкубируют при 37°С 20-24 ч так же, как и контрольные.

После инкубации в течение 20-24 ч посевы просматривают и подсчитывают количество выросших колоний на обработанных и на не обработанных бактериофагом чашках. В контрольных посевах должно быть не менее 500 колоний. Содержание фагорезистентных особей в популяции штамма выражают в процентах.

, где

а - процент фагорезистентных особей в популяции данного штамма;

b - количество колоний, выросших на посевах, обработанных препаратом бактериофага;

с - количество колоний, выросших на посевах, не обработанных бактериофагом.

Культуры из колоний, выросших на посевах, обработанных препаратом бактериофага, при необходимости отсевают на питательные среды и используют для дальнейшего изучения их различных биологических свойств.

Возможность практического) использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Из взвеси спор штамма В. anthracis 1 (CO) в 30%-ном растворе глицерина, хранившейся в ампуле при 4-6°С, приготовлена взвесь в физиологическом растворе NaCl, соответствующая 10 ед. мутности по отраслевому стандарту мутности ГИСК имени Л.И. Тарасевича, которую титровали в физиологическом растворе NaCl десятикратными разведениями до разведения 10^-5.

В чашки Петри разливали расплавленный агар Хоттингера (рН 7,4). Чашки с агаром подсушивали в термостате с приоткрытой крышкой в течение 1 ч. На поверхность агара в 14 чашках Петри наносили по 0,1 мл взвеси спор из разведения 10^-5 после тщательного ее перемешивания путем пипетирования. Вращательными движениями чашек распределяли взвесь по поверхности среды.

После полного впитывания жидкости 7 чашек помещали в термостат для инкубирования. На поверхность остальных 7 агаровых пластин наносили по 0,5 мл бактериофага К-ВИЭВ (титр по Апельману 4×10^-8). Плавно наклоняя чашку, смачивали всю поверхность питательной среды препаратом. Посевы помещали в термостат с приоткрытой крышкой до полного впитывания жидкости, после чего чашки переворачивали крышкой вниз и оставляли при 37°С. Учет результатов проводили через 20 ч. На 7 чашках, обработанных бактериофагом К-ВИЭВ, количество выросших колоний составило: 0+3+2+2+5+2+3=17. На контрольных посевах, не обработанных препаратом бактериофага, количество ( выросших колоний составило: 67+80+90+89+79+83+87=601. Содержание особей, резистентных к литическому действию сибиреязвенного бактериофага К-ВИЭВ, в популяции штамма В. anthracis 1(CO) составило:

Пример 2. Из взвеси спор штамма В. anthracis 81/1 в 30%-ном растворе глицерина, хранившейся запаянной в ампуле при 4-6°С, приготовлена взвесь в дистиллированной воде, соответствующая 10 ед. мутности по отраслевому стандарту мутности ГИСК имени Л.И. Тарасевича, которую титровали в дистиллированной воде десятикратными разведениями до разведения 10^-5.

В чашки Петри разливали расплавленную среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба с добавлением фенолфталеинфосфата натрия. Перед использованием чашки со средой подсушивали в термостате с приоткрытой крышкой в течение 1 ч 20 мин. На поверхность агара в 20 чашках Петри наносили по 0,1 мл взвеси спор из разведения 10^-5 после тщательного ее перемешивания путем пипетирования. Вращательными движениями чашек распределяли взвесь по поверхности среды. После полного впитывания жидкости 10 чашек помещали в термостат для инкубирования. На поверхность остальных 10 агаровых пластин наносили по 0,5 мл цельного препарата бактериофага К-ВИЭВ (титр по Аппельману 4×10^-8). Плавно наклоняя чашку, смачивали всю поверхность питательной среды препаратом бактериофага. Посевы помещали в термостат с приоткрытой крышкой до полного впитывания жидкости, после чего чашки переворачивали крышками вниз и оставляли при 37°С.

Учет результатов проводили через 22 ч. На 10 чашках, обработанных бактериофагом К-ВИЭВ, количество выросших колоний составило: 3+3+2+3+2+4+3+1+4+2=27. Количество колоний на чашках, не обработанных бактериофагом, составило: 48+66+57+44+67+50+63+58+49+62=564. Содержание особей, резистентных к литическому действию сибиреязвенного бактериофага К-ВИЭВ, в популяции штамма В. anthracis 81/1 составило:

Поскольку в данном примере посевы производились на селективную среду, содержащую ингибиторы посторонней микрофлоры, а также фенолфталеинфосфат натрия, чашки с посевами обрабатывали в парах аммиака, что позволило на основании отрицательного теста на фосфатазу с достаточной долей уверенности исключить принадлежность фагорезистентных колоний к спорообразующим сапрофитам.

Пример 3. Из взвеси спор штамма В. anthracis 1(CO) в 30%-ном растворе глицерина, хранившейся в запаянной ампуле при 4-6°С, готовили взвесь в физиологическом растворе NaCl, соответствующую 10 ед. мутности по отраслевому стандарту мутности ГИСК имени Л.И. Тарасовича, которую титровали в физиологическом растворе NaCl десятикратными разведениями до разведения 10^-5.

В чашки Петри разливали расплавленный агар Хоттингера (рН 7,4). Чашки с агаром подсушивали в термостате с приоткрытой крышкой в течение 2 ч. На поверхность агара в 20 чашках Петри наносили по 0,1 мл взвеси спор после тщательного ее перемешивания путем пипетирования. Вращательным движением чашек распределяли взвесь по поверхности среды. После полного впитывания жидкости 10 чашек помещали в термостат для инкубирования. На поверхность остальных 10 агаровых пластин наносили по 0,5 мл цельного препарата бактериофага ВА-9 (титр по Аппельману 2×10^-9). Плавно наклоняя чашку, смачивали всю поверхность среды препаратом бактериофага. Посевы помещали в термостат с приоткрытой крышкой до полного впитывания жидкости, после чего чашки переворачивали крышкой вниз и оставляли при 37°С.

Учет результатов проводили через 24 ч. На 10 чашках, обработанных бактериофагом ВА-9, количество выросших колоний составило: 7+9+9+11+7+13+7+7+10+4+=83. Количество колоний на чашках, не обработанных бактериофагом, составило: 67+58+60+64+53+57+65+69+58+61=612. Содержание особей, резистентных к литическому действию сибиреязвенного бактериофага ВА-9, в популяции штамма В. anthracis 1(CO) составило:

Как показали эксперименты, 7-10 засеянных чашек с питательной средой достаточно для исследования не менее 500 к.о.е. (спор) при указанном методе подготовки споровых взвесей. Применение споровых взвесей более высокой концентрации приводит к образованию сливного роста культуры на контрольных посевах, что делает невозможными точные подсчеты. Снижение концентрации спор в исследуемой взвеси требует увеличения количества засеваемых чашек, что делает исследования более трудоемкими и увеличивает материальные затраты. При одновременном изучении популяционного состава штамма В. anthracis по резистентности к нескольким бактериофагам контрольные посевы являются общими, и их количество должно соответствовать количеству опытных посевов для каждого бактериофага.

Время менее 20 ч недостаточно для формирования на посевах, обработанных бактериофагом, колоний, достаточных по величине не только для визуального учета, но и для отсева на питательные среды для дальнейшего изучения их биологических свойств. Инкубирование посевов более 24 ч может привести к слиянию колоний при их росте на более частых контрольных посевах, что затрудняет учет результатов.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит увеличить чувствительность, точность и достоверность характеристики исходных популяций штаммов В. anthracis по количественному содержанию в них особей (спор), резистентных к литическому действию различных сибиреязвенных бактериофагов, а возможность отбора фагорезистентных клонов позволит изучить комплекс их биологических свойств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ипатенко Н.Г., Седов В.А., Зелепукин B.C. и др. Сибирская язва сельскохозяйственных животных // М.: Агропромиздат, 1987. С.175-177.

2. Васильев П.Г., Иванов Ю.И., Садыков Н.С., Кожухов В.В., Зиганшин Р.Ш., Дербина Л.М., Сенькин А.В. Чувствительность штаммов В. anthracis, выделенных из разных источников внешней среды, к видоспецифическим сибиреязвенным бактериофагам // Диагн., лечение и проф. опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. Мат. юбилейной науч. конф. посвящ. 70-летию НИИ Микробиологии МОРФ. - Киров, 1998. - С.64.

3. Обносова Н.В., Шуляк В.П. О патогенных свойствах возбудителя сибирской язвы в разных очагах // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР: Тез. докл. Х Пленарного заседания межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой (28-29 сентября 1978 г., г. Баку. - Москва, 1978. - С.123-124.

4. Thome C.B. Genetics of Bacillus anthracis // In Leive L. (Ed.). Microbiology. - 1985. - Amer. Soc. Microbiol, Washington D.C. - 1985. - P. 56-62.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам характеристики штаммов по количественному содержанию в их популяции клонов, резистентных к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов. Для реализации способа осуществляют мерный посев взвеси спор на чашки Петри с плотной питательной средой в концентрации, обеспечивающей образование 50-100 изолированных колоний. Поверхность опытных чашек обрабатывают сибиреязвенным бактериофагом, посевы инкубируют и затем подсчитывают количество выросших колоний на чашках с бактериофагом (опыт) и без него (контроль), при этом в контроле изучают не менее 500 к.о.е. Процентное содержание фагорезистентных особей в популяции рассчитывают по соотношению количества колоний в опыте к количеству колоний в контроле. Использование способа позволит увеличить чувствительность, точность и достоверность характеристики исходных популяций штаммов В. anthracis по количественному содержанию в них особей (спор), резистентных к литическогому действию различных сибиреязвенных бактериофагов, а возможность отбора фагорезистентных клонов позволит изучить комплекс их биологических свойств.

Способ количественного определения резистентности популяционного состава штаммов Bacillus anthracis к сибиреязвенному бактериофагу, отличающийся тем, что осуществляют строго мерный посев на 10-20 чашек Петри взвеси спор в объеме 0,1 мл с концентрацией, обеспечивающей образование 50-100 изолированных колоний на поверхности плотной питательной среды, далее поверхность опытных чашек обрабатывают препаратом сибиреязвенного бактериофага, все посевы инкубируют, выросшие на опытных и контрольных без бактериофага чашках колонии подсчитывают, при этом в контрольных посевах изучают не менее 500 к.о.е., и рассчитывают процентное содержание фагорезистентных особей в популяции по соотношению количества колоний, выросших на опытных чашках, к количеству колоний на контрольных чашках.