ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Helicobacter pylori И СПОСОБ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине.

Открытие H.pylori в 1982 году явилось отправной точкой в формировании новой концепции этиологии гастродуоденальных заболеваний. В настоящее время общепринятым фактом является роль Н. pylori в патогенезе хронического гастрита. В 1990 году эти бактерии официально включены в международную классификацию как хеликобактерный гастрит или гастрит, ассоциированный с хеликобактериозом, гастрит типа В. С инфицированием H.pylori ассоциировано около 70-80% случаев гастритов, более 70% случаев язвенной болезни желудка, 90% язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, повышен риск развития рака желудка и B-клеточной лимфомы. В научных докладах последних лет активно обсуждается вопрос о связи H.pylori с внежелудочными проявлениями (заболеваниями кишечника, гепатобилиарной системы, поджелудочной железы), а также поражениями сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата, кожи и т.д.

Для правильной и своевременной постановки диагноза хеликобактериоза разработано множество методов, сгруппированных с использованием нескольких параметров для классификации. В зависимости от цели, материала, техники исполнения их подразделяют на скрининговые и подтверждающие; инвазивные и неинвазивные; прямые и косвенные. Одним из методов лабораторной диагностики H.pylori-инфекции является бактериологическое исследование - выделение, идентификация, изучение биологических свойств возбудителя. Трудоемкость и сложность выделения культуры H.pylori ограничивают применение этого метода в практике практического здравоохранения, но он остается единственным для фенотипического определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам.

Для культивирования H.pylori предложены различные питательные среды, обязательными компонентами которых являются базовый агар, ростовые добавки, а для селективных - ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры. Большинство базовых агаров удовлетворяют требованиям, предъявляемым для культивирования H.pylori, например колумбийский агар, эритрит агар, сердечно-мозговой агар. H.pylori очень прихотливый микроорганизм, требующий дополнительных факторов роста (витаминов, микроэлементов) [1]. Обязательным компонентом среды должна быть добавка 5-10% крови или сыворотки животных (лошади, барана). Использование крови человека ограничено наличием у большинства взрослого населения защитных антител, способных ингибировать рост H.pylori [2]. При этом эритроциты могут быть лизированы, чтобы ростовые вещества могли быть использованы быстрее, что достигается при применении шоколадного агара. Разработана питательная среда, не содержащая сыворотку и ткани животных -SATFM (serum - animal tissue - free medium), которая может быть использована как для выделения чистой культуры (плотная), так и для транспортировки (полужидкая) с разницей в процентном содержании агара [3]. Н.В.Сафоновой и А.Б.Жебруном (1995) предложена среда, приготовленная на основе эритрит-агара, в которую ех tempore вносят кровь, гемин и селективную добавку [4]. М.М.Меджидовым и коллегами (2000) разработан хеликобактер-агар, содержащий селективную добавку, состоящую из антибактериальных и противогрибковых препаратов, и кровь, вносимые ex tempore [5]. А.Б.Жебрун с коллективом авторов (2002) рекомендуют использовать в качестве основы питательной среды колумбийский агар или сердечно-мозговой агар с добавлением 5-7% лошадиной сыворотки или 5-7% дефибринированной лошадиной крови и 1% раствора изовиталекса [6]. Наиболее близким к заявляемому является способ культивирования H.pylori на шоколадном агаре, приготовленном на основе среды Колумбия агар с добавлением 2,5% донорской крови. Затем к охлажденной до 50°С питательной среде авторы предлагают добавлять 2,5% гемолизированной донорской крови. Способ обеспечивает более быстрое культивирование на более дешевой среде, но не лишен ряда недостатков [7]. Недостатком прототипа на взгляд авторов является использование донорской крови, что может снижать частоту высеваемости из-за наличия в донорской крови антител к H.pylori, оказывающих ингибирующее действие. Особенно остро стоит проблема при получении чистой культуры, когда после пересева изолированных колоний для выделения чистой культуры вырастают единичные колонии, и биологического материала оказывается недостаточно для идентификации и постановки антибиотикограммы.

Недостатком способов культивирования на твердых питательных средах является:

- невысокая эффективность высеваемости хеликобактеров при первичной изоляции,

- при дальнейших пересевах для получения чистых культур штаммы теряются, всхожесть ослабевает и утрачивается,

- скудность роста чистых культур приводит к невозможности определения чувствительности выделенного штамма к антибиотикам и химиопрепаратам.

Проблему накопления культуры можно решить с помощью использования жидких сред. Сходный с твердыми средами состав (основы, ростовые и селективные добавки) используется и в жидких средах, хотя процесс культивирования более трудоемок и в практических лабораториях не нашел широкого применения [8]. Предложены различные основы жидких сред: Brucella - бульон, сердечно-мозговой бульон, соевый бульон с ростовыми добавками (сыворотка, дрожжевой экстракт, циклодекстрин и другие) и антимикробными препаратами (ванкомицин, налидиксовая кислота, амфотери[9; 10]. Предложена среда, имеющая постоянный состав витаминов и микроэлементов без добавления сыворотки - serum - free Ham's F-12 [11]. При росте на жидких питательных средах бактерии имеют типичную извитую форму, подвижны и биохимически активны, полноценны в антигенном отношении [12]. H.pylori растет в микроаэрофильной атмосфере, состоящей из 5% О₂, 5-10% СО₂, 85-90% N₂. Различные системы могут быть использованы для создания микроаэрофильных условий. Среди них - микроаэробный бокс или инкубатор, в котором адекватная атмосфера поддерживается автоматически. Такую атмосферу можно создать в микроанаэростате типа GasPac 100 или GasPac 150 Anaerobic Systems фирмы BBL с использованием газогенераторных пакетов типа СатруРас фирмы BBL или Oxoid, которые начинают продуцировать газовые смеси при добавлении воды, которая также создает необходимую для роста H.pylori влажность. Но при культивировании в жидкой среде сложность может представлять создание и поддержание микроаэрофильных условий. Эта задача может быть решена постоянным контролированием микроаэробной атмосферы в пробирках путем перемешивания на специальных платформах под углом 20° со скоростью вращения 120 оборотов в минуту [13] или культивирования во флаконах с отверстиями для доступа газов, для чего разработаны мини-биореакторы для принудительного введения в атмосферу культивирования углекислого газа через трубки, погруженные во флаконы с жидкой питательной средой [14].

Недостатки способов культивирования на жидких питательных средах:

- сложность создания и поддержания микроаэрофильных условий в жидких питательных средах,

- необходимость использования дополнительного оборудования (шейкеров, вращательных платформ, биореакторов и т.д.) для принудительного введения углекислого газа.

Задачей изобретения является разработка способа тонкослойного культивирования Helicobacter pylori с использованием двухфазной питательной среды, доступного для бактериологических лабораторий, не оснащенных специальным оборудованием. Достигаемый технический результат заключается в отсутствии необходимости использования дополнительного оборудования для поддержания микроаэрофильных условий в жидкой фазе среды, использовании стандартных питательных сред (Колумбия агара и бульона Шедлера) и в том, что происходит накопление чистой культуры H.pylori в количестве, достаточном для морфологической, биохимической идентификации и постановки антибиотикограммы.

Некоторые микроорганизмы с трудом удается выращивать на твердых или жидких питательных средах, но они гораздо более активно растут и размножаются в двухфазных питательных средах, состоящих из комбинации твердой и жидкой фаз. Возможным объяснением может быть то, что подобные питательный среды создают условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть жизненного цикла микроба требует твердой питательной среды, а другие стадии жизненного цикла проходят в жидкой питательной среде. Это, в частности, свойственно эпителиальным патогенам, к которым относится H.pylori, частично размножающимся к клетках слизистых оболочек, а частично - на поверхности слизистой в просвете органа. При этом состав компонентов жидкой и твердой фазы питательной среды определяется особенностями биологии конкретного микроорганизма.

Так, патентом РФ №2272834 (15) защищена питательная двухфазная среда для выделения одноклеточных микроорганизмов - трихомонад. Патентом РФ №2412991(16) защищена двухфазная питательная среда для культивирования криптоспоридий, а патент РФ №2346052 (17) предлагает двухфазную питательную среду для выделения бруцелл.

Авторы заявляемого изобретения предлагают следующий состав питательной среды. Двухфазная питательная среда состоит из двух фаз: твердой и жидкой. Твердая фаза представляет собой шоколадный агар, приготовленный на основе Колумбия агара с 5% крови барана.

Состав Колумбия агара:

Ингредиенты грамм/лит Р Биопептон 20,00 Триптический перевар говяжьего сердца 3,00 Крахмал кукурузный 1,00 Натрия хлорид 5,00 Агар-агар 15,00 Конечное значение рН (при 25°С) 7,3±0,2  

Приготовление:

Размешать 44,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 50°С и асептично внести стерильную дефибринированную кровь барана (5% от общего объема). Агар слегка подогревают на слабом огне, не доводя до кипения. Тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри по 14 мл. При приготовлении шоколадного агара следует обратить особое внимание на правильный подогрев: правильно приготовленный агар имеет светло-коричневую окраску схожую с цветом молочного шоколада. При слишком слабом подогреве агар будет иметь кирпично-красный цвет, а при сильном - темно-коричневый.

Преимущества используемой твердой фазы

Колумбия агар отличается разнообразием включенных в рецептуру среды источников белкового питания. Комбинация пептонов обеспечивает на ней быстрый и обильный рост очень прихотливых микроорганизмов. В результате приготовления шоколадного агара из эритроцитов экстрагируются гемин, НАД, и ростовые факторы гемофильными и прихотливыми бактериями, в том числе и H.pylori, используются быстрее.

Жидкая фаза представляет собой бульон Шедлера, обогащенный 10% сывороткой крупного рогатого скота.

Состав бульона Шедлера:

Ингредиенты грамм/лит Р Гидролизат казеина 5,67 Протеозопептон 5,00 Папаиновый перевар соевой муки 1,00 Дрожжевой экстракт 5,00 Глюкоза 5,83 Натрия хлорид 1,67

Калия гидрофосфат 0,83 Трис (гидроксиметиламинометан) 3,00 L-Цистин 0,40 Гемин 0,01 Конечное значение рН (при 25°С) 7,6±0,2  

Приготовление:

Размешать 28,41 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить с частым помешиванием для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить и асептично добавить до 10% от общего объема стерильной сыворотки крупного рогатого скота. Перед розливом среду тщательно перемешать. Избегать перегревания среды или ее окисления на свету, так как это приводит к задержке роста бактерий.

Преимущества используемой жидкой фазы:

Данная среда является прекрасной основой, в которую для выделения прихотливых анаэробных, в том числе и капнофильных бактерий, можно добавлять кровь или другие обогатительные добавки. Комбинация гидролизата казеина, протеозопептона, папаинового перевара соевой муки, дрожжевого экстракта и L-цистина обеспечивает присутствие азотистых питательных веществ, витаминов и других факторов, необходимых для роста микроорганизмов. Глюкоза является источником энергии. Гемин и витамин К стимулируют рост прихотливых микроорганизмов.

Авторы предлагают следующий способ тонкослойного культивирования H.pylori на двухфазной питательной среде.

1 этап. Первичный посев исследуемого материла (биоптаты слизистой оболочки желудка) производят на колумбийский агар с добавлением 5% крови барана. Термостатирование в микроаэрофильных условиях (СО₂-инкубаторе) при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности.

2 этап. Оценка результатов посева. Выявление подозрительных колоний (мелкие, прозрачные диаметром 1-2 мм сходные с «капельками росы»). Пересев отобранной колонии на шоколадный агар для получения чистой культуры. Инкубирование в микроаэрофильных условиях при 37°С в течение 3-5 дней.

3 этап. Накопление чистой культуры. В случае скудного роста единичные колонии рассеивают петлей по поверхности плотной среды и заливают жидкой питательной средой, приготовленной на основе бульона Шедлера, обогащенным 10% сывороткой крупного рогатого скота. Оптимальное количество жидкой среды, наливаемой в чашку Петри диаметром 90 мм, составляет 3,5 мл (соотношение твердой и жидкой фаз 4:1). Инкубирование в микроаэрофильных условиях 37°С в течение 3 дней.

4 этап. Идентификация выделенной культуры, выросшей в жидкой фазе.

Изучение морфологических свойств. Из культуральной жидкости готовят фиксированные мазки, окрашивают по Граму и препарат «раздавленная» или «висячая капля» для определения подвижности.

Изучение биохимических свойств. Постановка тестов на каталазу, оксидазу, уреазу.

Постановка антибиотикограммы.

Таким образом, заявляемый авторами изобретения способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori предполагает использование преимущества жидкой фазы по сравнению с твердой фазой для накопления культуры, а ее тонкослойное распределение поддерживает микроаэрофильные условия в толще жидкости без дополнительного оборудования.

Литература

1. Jiang X., Doyle M.P. Growth supplements for Helicobacter pylori. // J Clin Microbiol. - 2000. - Vol.38. - P.1984-1987.

2. Westblom T.U., Madan E., Riff B.R. Improved growth of Helicobacter pylori using a liquid medium supplemented with human serum. // Ital. J. Gastroenterol. - 1991. - Vol.29(Suppl. 2). - P.48.

3. Dierikx C.M., Martodihardjo J., Kuipers E.J. et al. Serum and animal tissue free medium for transport and growth of Helicobacter pylori. // Immunol. Med. Microbiol. - 2007. - Vol.50. - P.239-243.

4. Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз. - Реком. для врачей. - Спб. - 1995.

5. Меджидов М.М., Темирханова З.У., Алиева Х.М. и др. Оценка питательной среды для выделения и культивирования Helicobacter pylori. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 2000. - №2. - С.25-29.

6. Жебрун А.Б., Александрова В.А., Гончарова Л.Б. др. Диагностика, профилактика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori-инфекцией. (Пособие для врачей). Спб., 2002.

7. Червинец В.М., Червинец Л.Ф. Патент на изобретение РФ №2145975 «Способ культивирования Helicobacter pylori». - 2000.

8. Shahamat M., Mai U.E., Paszko-Kolva С. et al. Evaluation of liquid media for growth of Helicobacter pylori. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol.29. - P.2835-2837.

9. Morshed M.G., Karita M., Konishi H. et al. Growth medium containing cyclodextrin and low concentration of horse serum for cultivation of Helicobacter pylori. // Microbiol. Immunol. - 1994. - Vol.38(11). - P.897-900.

10. Murano A., Miyake M., Kato J. et al. Enhancement of the growth of Helicobacter pylori in Brucella broth by hydrogen peroxide. // Microbiol. Immunol. - 1999. - 43(11). - P.1009-15.

11. Testerman T.L., McGee D.J., Mobley H.L.T. Helicobacter pylori growth and urease detection in the chemically defined medium Ham's F-12 nutrient mixture. // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39. - P.3842-3850.

12. Lin Y.L., Lee N., Chan E.C. Determination of optimal liquid medium for enzyme expression by Helicobacter pylori. // J. Clin. Pathol. - 1996. - Vol.49. - P.818-820.

13. Xia H.X, English L., Keane C.T. et al. Enhanced cultivation of Helicobacter pylori in liquid media. // J. Clin. Pathol. - 1993. - Vol.46(8). - P.750-753.

14. Secker D.A., Tompkins D.S., Alderson G. Gas-permeable life cell tissue culture flasks give improved growth of Helicobacter pylori in a liquid medium. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol.29. - P.1060-1061.

15. Патент РФ №2272834.

16. Патентом РФ №2412991.

17. Патент РФ №2346052.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине. Способ предусматривает предварительный посев исследуемого материала на Колумбия агар с добавлением 5% крови барана. Термостатируют в микроаэрофильных условиях в СО₂ инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности. Производят отбор колоний и пересевают их на чашки Петри с шоколадным агаром и термостатируют в микроаэрофильных условиях в СО₂ инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности. По завершении стадии термостатирования чашки Петри с шоколадным агаром заливают сверху жидкой питательной средой на основе бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота с последующим термостатированием их в СО₂ инкубаторе при 37°С в течение 72 часов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы.

1. Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori, содержащая твердую фазу, представленную шоколадным агаром, изготовленным на основе Колумбия агара с 5% крови барана, и жидкую фазу, представляющую собой бульон Шедлера, обогащенный 10% сывороткой крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что соотношение твердой фазы к жидкой составляет 4:1 (14 мл агара и 3,5 мл бульона).

2. Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori по п.1, отличающаяся тем, что Колумбия агар содержит следующие ингредиенты в г/литр:
Ингредиенты грамм/литр Биопептон 20,00 Триптический перевар говяжьего сердца 3,00 Крахмал кукурузный 1,00 Натрия хлорид 5,00 Агар-агар 15,00 Конечное значение рН (при 25°С) 7,3±0,2  

3. Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori по п.2, отличающаяся тем, что бульон Шедлера содержит следующие ингредиенты в г/литр:
Ингредиенты грамм/литр Гидролизат казеина 5,67 Протеозопептон 5,00 Папаиновый перевар соевой муки 1,00 Дрожжевой экстракт 5,00 Глюкоза 5,83 Натрия хлорид 1,67 Калия гидрофосфат 0,83 Трис (гидроксиметиламинометан) 3,00 L-Цистин 0,40 Гемин 0,01 Конечное значение рН (при 25°С) 7,6±0,2  

4. Способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori с использованием двухфазной питательной среды по п.1, предусматривающий первичный посев исследуемого материала на Колумбия агар с добавлением 5% крови барана, термостатирование в микроаэрофильных условиях в СО₂ инкубаторе при 37°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности, пересев отобранных колоний чашки Петри с шоколадным агаром, последующее термостатирование в микроаэрофильных условиях в СО₂ инкубаторе при 37^°С в течение 3-5 дней при повышенной влажности, отличающийся тем, что после термостатирования чашки Петри с шоколадным агаром заливают сверху жидкой питательной средой на основе бульона Шедлера, обогащенного 10% сывороткой крупного рогатого скота согласно п.1 и окончательно термостатируют их в СО₂ инкубаторе при 37^°С в течение 72 часов.