СПОСОБ УСКОРЕННОГО СОЗДАНИЯ БЕЗВИРУСНОЙ РОСТКОВОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO НОВЫХ СОРТОВ КАРТОФЕЛЯ Российский патент 2004 года по МПК A01H1/00 A01H4/00 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству.

Сортовой картофель - культура важная, но вегетативно-размножаемая, поэтому относительно слабая по устойчивости к вирусам. Для защиты сортов и семян картофеля от вирусного вырождения требуется радикальное и регулярное оздоровление исходного материала от хронических инфекций.

Существуют различные оздоровительные мероприятия: создание и внедрение иммунных сортов картофеля, клоновый отбор безвирусных растений через иммуно-ферментный анализ, генеративная элиминация вирусных патогенов, клеточно-тканевые биотехнологии. В настоящее время известны следующие клеточно-тканевые биотехнологии оздоровления картофеля:

- освобождение сортов картофеля от вирусных инфекций методом апикальной меристемы, с использованием приемов термо- и хемотерапии (Трофимец Л.Н., Хижняк П.А., Кучумов А.П. Методы лечения картофеля, зараженного вирусными болезнями (обзор). - М.: ВНИИТЭИСХ, 1978. – 62 с.; Трофимец Л.Н. и др. Оздоровление картофеля от вирусных болезней методом верхушечной меристемы // С.-х. биология. - 1975. - №5.0.760-765);

- оздоровление картофеля через культуру каллуса (Бутенко Р.Г., Хромова Л.М., Седнина Г.В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля. - М.: ВАСХНИЛ, 1984. – 28 с.)

Создание новых коммерческих сортов картофеля с высокой комплексной вирусоустойчивостью маловероятно в ближайшие годы. Культивируемые же в производстве сорта генетически не приспособлены к размножению генеративным путем, поэтому семенное размножение у культурного картофеля, как правило, практикуется только в селекционной работе. Освобождение сортов картофеля от хронических вирусных инфекций через культуру каллуса - процесс долговременный в плане получения регенерантов, к тому же возможна потеря генетической стабильности материала из пассируемого каллуса.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ освобождения сортов картофеля от вирусов через апикальные меристемы (Анненков Б.Г. Биотехника меристемно-тканевого курса лечения сортов картофеля от хронической вирусной инфекции. // Сиб. вестник с.-х. науки. - 1990. - №3-6. 110-116). Метод апикальной меристемы является наиболее разработанным из возможных оздоровительных мероприятий в наше время. Он основан на стерильном вычленении мизерных (150-250 мкм) точек роста, формирующихся на кончиках ростков клубней (или микропочек из пазух зачаточных листочков на ростках), дальнейшем их культивировании на сложной питательной среде в пробирках и получении микропобега и мини-растений - регенерантов, безвирусность которых двукратно устанавливается с использованием иммуно-ферментных диагностикумов.

Однако биотехника меристемно-тканевого способа оздоровления картофеля недостаточно производительна и не дает гарантии скорого и положительного результата при двух-трехлетних трудозатратах. Регенерация побегов из меристем - долговременный процесс, к тому же вычленение максимально мизерных верхушечных меристем или боковых пазушных почек отличается кропотливостью и трудоемкостью.

Кроме этого, имеются явные доказательства того, что меристемная ткань, считающаяся стерильной (до последнего времени), содержит Х и S вирусы, наиболее часто встречающиеся на культурном картофеле. Поэтому для ряда сортов нет гарантии получения здоровых линий в конце меристемного курса лечения. Существует и ряд методических трудностей: большой отход эксплантов на питательной среде, медленный рост агрегатов в первый период после выделения, невысокий процент выхода растении, пригодных для дальнейшей работы. В результате вероятность получения безвирусных растений в первой серии эксплантов недостаточна для того, чтобы планировать точные сроки оздоровления. Меристемный метод был внедрен в практику оздоровления картофеля уже после того, как некоторые стародавние сорта подверглись массовому губительному вирусному вырождению. В последние годы в России возросла результативность селекции по картофелю, и процесс сортосмены значительно ускорился.

На современном этапе необходимы ускорение и усовершенствование процесса излечения сортов картофеля от вирусной инфекции, применение оздоровительных мероприятий на этапах селекции и семеноводства новых перспективных сортообразцов, так как недопустимо потерять их продуктивность из-за вирусной и вироидной инфекции. Необходимо перевести новые сортообразцы в стерильную культуру in vitro еще при организации их научного семеноводства или в процессе селекционных испытаний.

Целью настоящего изобретения является изыскание способа оздоровления семенного картофеля более кратковременного, доступного и экономически оправданного.

Предлагаемый способ экспресс-элиминации вирусной инфекции перспективных сортообразцов аккумулировал наиболее рациональные элементы ранее существовавших способов. Он базируется на отборе сортотипичных, идеально ровных, крупных клубней для "теплого и темного" проращивания. Затем проводят иммуно-ферментный поиск среди индексированных клубней (их ростков) образцов, свободных от важнейших вирусов. Иммуно-ферментный поиск (ИФА) проводят летом. В качестве первичных эксплантов in vitro используют мини-ростки первого или второго порядка размером 0,5-2,5 см после 3-х месячного проращивание клубней. Перевод на стерильную основу осуществляют в асептическом боксе. Для прямого перевода в пробирочную культуру необходима предварительная тщательная стерилизация мини-ростков (безвирусных). Прямой перевод мини-ростков с клубней картофеля в стерильную культуру на богатые питательные среды проблематичен в силу того, что вегетативно размножаемый картофель накапливает в клубнях скрытую внутрисосудистую и межклеточную инфекцию. В отличие от меристемной технологии при эксплантации асептически приготовленных мини-ростков очень высок процент зарастания питательной среды контаминантами грибной и бактериальной природы, так как меристемы под влиянием эндогенных факторов иммунитета фактически стерильны, а клубни выращивают, хранят и проращивают в нестерильных условиях. Внутрирастительная инфекция плохо элиминируется мягкими стерилентами, а длительное воздействие жестких дезинфицирующих веществ оказывает губительное влияние на точки роста эксплантов. В соответствии с предлагаемым изобретением мини-ростки с отобранных безвирусных клубней стерилизуют в эффективном, опробованном авторами стериленте: смесь (I:I) 96-градусного этилового спирта и 15-ти процентной перекиси водорода /табл.1/. Оптимальная экспозиция воздействия стерилента на ростки большинства сортов - 4-5 минут (табл.2), она позволяет получать в среднем по сортам до 40% живых побегов на ростках, свободных от бактериальной и грибной инфекций. После стерилизации ростки однократно промывают в стерильной дистиллированной воде и высаживают в отдельные стерильные биологические пробирки, на одну треть заполненные богатой агаризованной питательной средой с минеральной основой по прописи Мурасиге-Скуга. Пробирки плотно закрывают ватно-марлевыми пробками, подвергают автоклавированию в течение 30 минут при избыточном давлении 0,8-0,9 атм. Культивируют экспланты в световой комнате, оборудованной лампами ДРИ-2000 "ФОТОС". Фотопериод составляет 16 час, интенсивность освещения поверхности 5000 лк, температура 22±3°С. При планировании стерильных работ по переводу мини-ростков картофеля в пробирочную культуру необходимо учитывать особенности сортов и уровень их вирусоносительства (табл.3-5).

Обнаружено, что даже в старом семенном материале можно отыскать клубни, полностью свободные от важнейших вирусов Х, S, М и У. Вероятность же отбора безвирусных линий у селекционных образцов и молодых сортов, а также среди ранее оздоровленного (через меристемы) семенного картофеля высока и составляет свыше 40%. Важным условием получения необходимого для последующих сравнительных испытаний количества чистых ростковых пробирочных культур является соблюдение максимально возможной асептики при отмывке клубней, при их проращивании, съеме ростков, в процессе стерилизации и эксплантации. Прямое использование отобранных через ИФА безвирусных клубней для размножения невозможно по причине присутствия в отдельных из них скрытой, но опасной инфекции ВВКК (и микроплазм), малые титры которой не всегда удается выявить даже с использованием современных лабораторных способов контроля (индикация, электрофорез).

Хотя ВВКК - медленная инфекция, она проявлялась уже в первые годы после создания пробирочной культуры новых сортов при использовании предлагаемого способа, поскольку условия депонирования, микроклонального размножения и дальнейшего тепличного выращивания способствуют накоплению и проявлению вироидной инфекции. Поэтому как и при меристемном лечении, так и по предлагаемому способу ростковой терапии завершающие вегетативные и полевые испытания и отбор продуктивных выровненных линий обязательны и вполне заменяют использование методов спецконтроля ВВКК и других вредоноснейших инфекций (табл.6). После применения ростковой терапии получают безвирусные пробивочные ростковые линии, в течение зимы и весны их микроклонально размножают и в середине мая пикируют в тепличном боксе в горшочки, набитые торфогрунтом. Рассаду в начале июня высаживают в поле разреженно строчкой на гряде (140×50 см). Посадки дважды обрабатывают инсектицидами (карбофос, арриво) для исключения заражения через переносчики-векторы. После повторного ИФА, подтверждающего безвирусность полученных растений, отбирают лучшие высокопродуктивные ростковые линии, которые сохраняют и депонируют в пробирочной коллекции далее, и используют при получении исходного семенного материала для обеспечения ГСИ и ведения научного семеноводства картофеля на оздоровленной основе.

Экспериментальная работа выполнялась в 1998-2000 годах в лаборатории отдела биотехнологий и защиты растений ДВНИИСХ. Полевые опыты проводили в севообороте отдела. По предлагаемому способу весной отбирали клубни нескольких сортов картофеля, отмывали, просушивали и закладывали на проращивание в затемненное место. Для проведения анализа отбирали глазомерно здоровые, типичные крупные и средние клубни, не имеющие повреждений, отбраковывали деформированные клубни, возможно несущие в себе вироид веретеновидности клубней (ВВКК) или другие, не столь распространенные вирусы, не определяемые с помощью имеющихся в наличии моновалентных тест-наборов ВНИИКХа для проведения иммуно-ферментного анализа (ИФА). Летом ростки с пронумерованных клубней подвергали ИФА. Затем проводили стерилизацию мини-ростков предлагаемым стерилентом, переносили ростки в стерильные пробирки в соответствии с предлагаемым способом; после применения ростковой терапии получали безвирусные пробирочные ростковые линии, в течение зимы и весны их микроклонально размножали до 60 копий. В середине мая пикировали в тепличном боксе в горшочки с торфогрунтом. В начале июня рассаду высаживали в поле разреженно строчкой на гряде 140×50 см. Посадки дважды обрабатывали (карбофос, арриво) инсектисидами, проводили повторный ИФА и отбирали лучшие высокопродуктивные линии, депонировали в пробирочной коллекции и использовали при получении исходного семенного материала.

Новый способ, в отличие от меристемной биотехнологии оздоровления картофеля, позволяет при одинаковых трудозатратах получать большее на несколько порядков количество исходных ростковых эксплантов для работы. При этом на одну треть сокращается длительность процесса освобождения сортов от вирусной инфекции. Способ пригоден как для ускоренного создания безвирусных культур перспективных селекционных образцов и новых сортов, так и для получения собственных стерильных растений из приобретенных исходных клубней, ранее созданных на меристемной основе в стране или за рубежом. Способ отличается простотой исполнения, сокращает время и гарантирует успех при получении безвирусных и безвироидных растений. Впервые получены безвирусные пробирочные растения ряда новых сортов - Дальвас, Андроид, Дедовник, Киборг, Н-9 и др. Создан для внедрения в семеноводство многочисленный оздоровленный исходный клубневой материал.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению здорового и продуктивного исходного материала для дальнейшего семеноводства картофеля. Поводят отбор сортотипичных, выровненных крупных клубней, иммуно-ферментный поиск среди индексированных клубней и их ростков-образцов, свободных от распространенных вирусов /Х, S, M, и Y/, стерилизацию и регенерацию мини-ростков размером 0,5-2 см на среде по прописи Мурасиге и Скуга. При регенерации культивируют экспланы при температуре 22±3⁰С. Испытывают продуктивность у депонируемых и размноженных линий и отбирают лучшие для коллекции и производства оздоровленных исходных семенных клубней. Изобретение позволяет снизить производственные и временные затраты при получении безвирусных растений картофеля. 6 табл.

Способ создания безвирусной ростковой культуры in vitro новых сортов картофеля, включающий проращивание сортотипичных клубней, иммуно-ферментный поиск среди индексированных клубней и их ростков-образцов, свободных от распространенных вирусов (X, S, M и Y), прямой перенос эксплантов в стерильную пробирку на агаризованную (твердую) питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга, автоклавированную при избыточном давлении 0,8-0,9 атм., для дальнейшей регенерации с последующим сравнительным испытанием продуктивности депонируемых и размноженных линий и отбор среди них лучших для коллекции и производства оздоровленных исходных семенных клубней, отличающийся тем, что перед проращиванием проводят отбор сортотипичных клубней, в качестве эксплантов используют миниростки с безвирусных клубней размером 0,5-2 см, которые перед переносом в стерильную пробирку стерилизуют в течение 4 мин в смеси 1:1 96-градусного этилового спирта и 15-процентной перекиси водорода, а после переноса эксплантов на питательную среду культивируют при температуре (22±3)°С.