Способ микроклонального размножения картофеля Российский патент 2019 года по МПК A01H4/00 A01N25/00 

Предлагаемое изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к технологии ускоренного размножения пробирочных растений картофеля в условиях in vitro. Изобретение может быть использовано для оздоровления пробирочных растений картофеля при производстве семенного безвирусного посадочного материала из меристемных линий.

Картофель (Solanum tuberosum var. tuberosum) выращивается в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Относительно высокая продуктивность при известной простоте возделывания позволяет картофелю стабильно занимать второе место после злаковых культур в отечественном сельскохозяйственном производстве.

Важной особенностью картофеля является и то, что вследствие вегетативного размножения большинство поражающих его болезней передается через семенные клубни, которые и являются первичным источником инфекции для последующего заражения посадок. Картофель может поражаться болезнями на всех этапах жизненного цикла: до появления всходов, во время вегетации и в период хранения. Многие возбудители болезней способны также накапливаться и длительно сохраняться в почве.

Выращивание картофеля, свободного от инфекции, является перспективным направлением исследований в настоящее время. Микроклональное размножение картофеля из меристемных линий позволяет получать оздоровленный от вирусной, грибной и бактериальной инфекций семенной материал.

Картофельные вирусные заболевания чаще всего передаются через семенной материал. В процессе длительного культивирования стерильных растений из меристемных линий в условиях in vitro, часто происходит контаминация материала бактериальной и грибной микрофлорой. Причиной этого являются чаще всего инфицированные экспланты, реже компоненты питательных сред, возможна внутрилабораторная передача инфекции из воздуха, от персонала, и от одной культуры клеток к другим.

Известен способ, уменьшающий зараженность ягодных культур во время длительного культивирования из апикальных меристем, заключающийся во включении в питательные среды антибиотиков, в частности тетрациклина, что снижает контаминацию отдельных микроорганизмов, случайно попавших на поверхность питательной среды во время пересадок (Иванов А.И., Приходько Ю.Н., Приходько Д.П., Богомолов А.А. «Совершенствование методики получения растений земляники методом культуры апикальных меристем» / В сборнике «Селекция и агротехника выращивания плодовых и ягодных культур в Среднем Поволжье, Куйбышевское книжное изд-во, 1989, с. 63-75) [1].

Недостатком способа является ограничение использования тетрациклина для производства оздоровленного пробирочного растения ввиду того, что антибиотик активен в отношении лишь немногих грамотрицательных бактерий. К тетрациклину не устойчивы микроорганизмы большинства грибов, которые чаще всего вызывают контаминацию питательной среды при длительном культивировании стерильных растений в условиях in vitro.

Известен способ внесения антибиотика нистатина в культуру эксплантов земляники и яблони, описан положительный эффект от его применения при нулевом эффекте от антибиотиков макропен, цефипим и др. (Бунцевич Л.Л., Палецкая Е.Н., Костюк М.А., Медведеева Н.И. «Исследование эффективности антибиотиков и стерилизаторов нового поколения для подавления бактериальной и грибной контаминации среды и эксплантов» / Тематический сетевой электронный журнал СКЗНИИСиВ, 2012, №16(4). - С. 10) [2].

Недостатком способа является ограничение использования полиенового антибиотика нистатина для производства оздоровленного пробирочного растения ввиду того, что антибиотик не активен в отношении бактерий. Нистатин - противогрибковое, фунгистатическое средство.

Установлено, что морфологические типы бактерий, выделенных из культуральной среды растений вишни и черешни, представляют собой смесь различных видов микрорганизмов. Изучено 32 клона контаминат и выявлено, что источниками заражения являются ризосферная, эпифитная и эндофитная микрофлора растений. Исходя из этого, для декотаминации питательной среды, применяли антибиотики из группы аминогликозидов с широким антибактериальным спектром действия (Бургутин А.Б., Феактистов Н.В., пунина Н.В., Игнатов А.И. «Определение видовой принадлежности контаминирующих культур древесных растений in vitro I Звенигород, 2008. С. 80) [3].

Недостатком известного способа является способность микроорганизмов обладать резистентностью к антибиотическим веществам этого ряда.

Известен способ микроклонального размножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным содержанием макроэлементов, при этом посадку и культивирование осуществляли с добавлением в питательную среду индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и эмистима в концентрации 10^-7-10^-10 мл/л (патент РФ №2264706 «Способ оптимизации клонального микроразмножения винограда in vitro», А01Н 4/00, A01N 25/00, C12N 5/00, 2005 г.) [4]. Эмистим - биорегулятор роста и корнеобразования растений, способствует индукции ризогенеза и вытягивания в длину клеток всех тканей. В результате его применения происходит оптимизация метаболических процессов, повышается иммунитет у растений.

Недостатком известного способа является ограничение использования эмистима для производства оздоровленного пробирочного растения ввиду того, что этот биорегулятор не уничтожает бактериальные инфекции, которые чаще всего угнетают растения и приводят их к гибели. Хотя при этом его применение для оздоровления микрочеренков винограда не вызывает сомнения, так как виноград реже подвержен бактериальной инфекцией.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ приготовления питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля (патент KZ №25514 «Способ приготовления питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля», A01G 9/00 C05D 9/00, 2010 год) [5], включающий быстрое размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании оптимизированной безгормональной питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄7H₂O 5,0 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O 440 мг/л, мезо-инозит 100 мг/л, тиамин 1,0 мг/л, пиридоксин 1,0 мг/л, никотиновая кислота 0,5 мг/л, сахароза 25 г/л, глюкоза 25 г/л, агар 6 г/л, рН 5,7-5,8. Размножение пробирочных растений картофеля из меристемных линий проводили путем микрочеренкования in vitro. Пробирочные растения картофеля доставали из пробирки пинцетом и клали на стерильный матрасик. Скальпелем разрезали растение на черенки, состоящие из кусочка стебля с листочком и пазушной почкой. Черенкование пробирочных растений проводили с интервалом 14 дней. Выросшие растения с 5-6 черенками периодически разрезали и пересаживали в пробирки со свежей питательной средой Мурасиге и Скуга. Пробирочные растения выращивали в фактеростатной комнате при температуре 23-25°С и освещенность 7000 люкс.

Недостатком этого способа является отсутствием компонента питательной среды, позволяющего снизить контаминацию грибной и бактериальной микрофлоры в процессе длительного культивирования стерильных растений картофеля из меристемных линий в условиях in vitro.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение эффективности размножения оздоровленных пробирочных растений картофеля, полученных из меристемных линий, в условиях in vitro при использовании оптимизированной питательной среды Мурасиге и Скуга.

Технический результат достигается эффективным стимулированием корнеобразования в пробирочных растений картофеля, выращенных из меристемных линий, и полной деконтаминацией грибной и бактериальной микрофлоры.

Указанные задача и технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании оптимизированной безгормональной питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe₂SO₄, CaCl₂, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, рН 5,7-5,8, согласно изобретению, в питательную среду дополнительно вводят биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii (GenBank: JQ350879.1) при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄⋅7H₂O 5,0 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O 440 мг/л, мезо-инозит 100 мг/л, тиамин 1,0 мг/л, пиридоксин 1,0 мг/л, никотиновая кислота 0,5 мг/л, сахароза 25 г/л, глюкоза 25 г/л, агар 6 г/л,

биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii (GenBank: JQ350879.1) 0,5 мг/л, рН 5,7-5,8.

Отличительным признаком заявляемого способа является введение в состав питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii (GenBank: JQ350879.1) в концентрации 0,5 мг/л, которые обеспечивают деконтаминацию от нежелательной грибной и бактериальной микрофлоры культивируемого растительного материала и обогащение их ростовыми факторами.

Доказано, что биологически активные вещества мицелиальных грибов Trichoderma представляют собой соединения не пептидной природы, не имеющих амидных связей, обладающих иммуномодулирующими, ростостимулирующими свойствами (Павловская Н.Е. Влияние вторичных метаболитов грибов рода Trichoderma на посевные качества семян гороха / Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, И.Ю. Солохина, И.В Яковлева // Сельскохозяйственная биология. 2012. №3. С.114-117) [6], бактерицидным и фунгицидным действием в отношении ряда фитопатогенов, широко распространенных на овощных культурах, в том числе картофеля (бактериальные - Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis (возбудитель бактериального рака томатов), Pseudomonas syringae pv. tomato (возбудитель бактериальной точечности плодов томата), Xanthomonas euvesicatoria (возбудитель бактериальной пятнистости томата); грибные - Ascochita cucumis (возбудитель черной микосфереллезной стеблевой гнили огурца), Didymella lycopersici (анаморфа: Phoma lycopersici) (возбудитель стеблевой гнили томата), Phoma destructiva (возбудитель фомозной гнили томата), Fusarium oxysporum (возбудитель фузариозной гнили корневой шейки и корней томата), Fusarium solani (телеоморфа: Nectria haematococca) (возбудитель фузариозной гнили корней огурца) (Гнеушева И.А. Антагонистический потенциал штаммов Trichoderma spp.в отношении возбудителей грибных и бактериальных заболеваний растений / И.А. Гнеушева, И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская, А.В. Лушников // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Продовольственная безопасность от зависимости к самостоятельности", Орел. - 29 ноября 2017 г. В печати) [7].

Способ микроклонального размножения картофеля осуществляют следующим образом.

Отбирают растения картофеля (экспланты), регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,2 мм, не зараженные вирусной, бактериальной и грибной инфекциями. Растения должны иметь 8-10 междоузлий.

Затем готовят твердую оптимизированную безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄⋅7H₂O 5,0 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O 440 мг/л, мезо-инозит 100 мг/л, тиамин 1,0 мг/л, пиридоксин 1,0 мг/л, никотиновая кислота 0,5 мг/л, сахароза 25 г/л, глюкоза 25 г/л, агар 6 г/л. рН среды перед автоклавированием 5,7-5,8. Среду автоклавируют в автоклаве под давлением 1,0 атм, температуре 110°С в течение 10 минут.

Биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii (GenBank: JQ350879.1) в концентрации 0,5 мг/л добавляют в условиях ламинарного бокса в остывшую до +55°С питательную среду после автоклавирования, что обеспечивает их максимальное воздействие. После чего среду разливают по пробиркам.

Растения картофеля (экспланты), регенерированные из апикальных меристем, достают из пробирки пинцетом и кладут на стерильную чашку Петри. Скальпелем разрезают растение на черенки, состоящие из кусочка стебля с листочком и пазушной почкой. Длина микрочеренка составляет 10-12 мм, 2 мм над глазком, остальные под глазком.

Полученные микрочеренки высаживают в пробирки на твердую оптимизированную безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга. Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 23-25°С и влажности воздуха 70-75%.

Оценку морфометрических показателей и наличие контаминантов в выросших растениях с 5-6 черенками проводят с интервалом 14 дней. Затем пересаживают в пробирки со свежей питательной средой.

В ходе экспериментальных исследований было установлено, что заявляемый способ способствует размножению оздоровленных пробирочных растений картофеля сорта «Голубизна», полученных из меристемных линий, в условиях in vitro при использовании оптимизированной питательной среды Мурасиге и Скуга с биологически активными веществами мицелиального гриба Trichoderma lixii (GenBank: JQ350879.1) в концентрации 0,5 мг/л. Результаты исследования приведены в таблицах 1, 2.

В результате микроклонального размножения получено 614 образцов оздоровленных пробирочных растений картофеля из меристемных линий, свободных от вирусной, грибной и бактериальной инфекций.

Таким образом, именно отличительный признак заявляемого способа убедительно показывает деконтаминацию от нежелательной грибной и бактериальной микрофлоры культивируемого растительного материала и стимулирование их роста и развития.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Для микроклонального размножения картофеля проводят размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании безгормональной питательной среды с рН 5,7-5,8, содержащей микросоли и макросоли по Мурасиге и Скуга, Fe₂SO₄, CaCl₂, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii при следующем соотношении компонентов:

Макросоли - 50 мг/л,

Микросоли - 1 мг/л,

Fe₂SO₄⋅7H₂O - 5,0 мг/л,

CaCl₂⋅2H₂O - 440 мг/л,

мезо-инозит - 100 мг/л,

тиамин - 1,0 мг/л,

пиридоксин - 1,0 мг/л,

никотиновая кислота - 0,5 мг/л,

сахароза - 25 г/л,

глюкоза - 25 г/л,

агар - 6 г/л,

биологически активные вещества

мицелиального гриба Trichoderma lixii

- 0,5 мг/л.

Изобретение позволяет повысить эффективность размножения здоровых пробирочных растений картофеля. 2 табл.

Способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании безгормональной питательной среды с рН 5,7-5,8, содержащей микросоли, и макросоли по Мурасиге и Скуга, Fe₂SO₄, CaCl₂, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, отличающийся тем, что дополнительно в питательную среду вводят биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii при следующем соотношении компонентов:

макросоли 50 мг/л микросоли 1 мг/л Fe₂SO₄⋅7H₂O 5,0 мг/л CaCl₂⋅H₂O 440 мг/л мезо-инозит 100 мг/л тиамин 1,0 мг/л пиридоксин 1,0 мг/л никотиновая кислота 0,5 мг/л сахароза 25 г/л глюкоза 25 г/л агар 6 г/л биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii 0,5 мг/л