СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОЙ СТОЙКОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики различных анемий.

С этой целью часто используют методы, позволяющие оценить стойкость эритроцитов к воздействию различных факторов, способных спровоцировать их разрушение, то есть вызвать гемолиз.

Известен способ определения осмотической стойкости эритроцитов по Лимбеку и Рибьеру (Руководство по клиническим лабораторным исследованиям, Медгиз, 1960, стр. 96-98), при котором используют гипотонические растворы с концентрациями соли от 0,56 до 0,28%. Их разливают в ряд пробирок, затем одной и той же пипеткой от гемометра Сали в каждую пробирку приливают по 0,02 мл крови, взятой из мякоти пальца. Осторожным встряхиванием пробирки достигают равномерности взвеси крови в солевом растворе. Пробирки оставляют в штативе при комнатной температуре на 1 час, затем в течение 5 минут центрифугируют при 2000 об/мин, после чего отмечают максимальный и минимальный уровень осмотической стойкости.

Чтение результатов.

Максимальный и минимальный уровень стойкости - это те концентрации соли, при которых гемолиз начался и закончился.

Уровень максимальной стойкости, то есть первые следы гемолиза определяют на глаз по легкой желтизне, а уровень минимальной стойкости (полное разрушение эритроцитов) - по интенсивно красному цвету и полной прозрачности раствора.

Нормальные границы осмотической стойкости:

Для минимальной стойкости колебания в пределах 0,48-0,46%; для максимальной - 0,34-0,32%.

Понижение стойкости эритроцитов, по мнению авторов метода, имеет место при врожденном сфероцитозе, а при остром гемолитическом кризе и В12-дефицитной анемии расширение границ стойкости.

Недостатком известного способа является его неточность, связанная с тем, что

1) результаты учитываются через 3-4-24 часа, тогда как осмотический гемолиз эритроцитов совершается быстро, достигая своего максимума уже через 5 минут;

2) увеличение гемолиза в отдаленные промежутки времени может произойти за счет микробного прироста и за счет поглощения углекислого газа воздуха;

3) неточна визуальная оценка как минимального, так и максимального гемолиза.

Наиболее близким по достигаемому положительному результату является способ оценки стойкости эритроцитов к кислотному гемолитику путем определения величины светопропускания стандартизированной взвеси эритроцитов с построением графика гемолиза (Лабораторное дело. - 1965. - №9. - Стр. 530-531).

Ход определения.

Берут из прокола пальца 1-2 капли крови и помещают в пробирки с 2-3 мл физиологического раствора.

Стандартизация условий достигается доведением оптической плотности взвеси эритроцитов до величины, равной 0,7 единиц экстинции (D) в кювете с рабочей длиной 30 мм. Берут 2,0 мл взвеси эритроцитов с оптической плотностью 0,7 D и помещают в кювету, находящуюся в правом пучке света фотоэлектроколориметра. В левое гнездо вставляют кювету с физиологическим раствором.

К взвеси эритроцитов добавляют 2,0 мл 0,004 Н раствора соляной кислоты и сразу же отмечают показания ФЭК на правом барабане. Затем показания снимают через каждые 30 секунд до тех пор, пока они не станут постоянными. Значение оптической плотности записывают в столбик напротив соответствующих отметок времени.

Для построения графика кислотной стойкости эритроцитов производят следующие расчеты.

Из первого показания оптической плотности вычитают последнее. Таким образом узнают изменение оптической плотности, соответствующее 100% гемолизу. Полученный результат делят на 100 и получают изменение оптической плотности, приходящееся на 1% гемолиза.

1. Из каждого предыдущего показания оптической плотности вычитают последующее и получают изменения оптической плотности в каждые последующие 30 секунд.

2. Данные, полученные по пункту 2, делят на оптическую плотность, соответствующую 1% гемолиза (пункт 1), и получают процент гемолизировавшихся эритроцитов за каждые последующие 30 секунд.

3. Полученные результаты выражают графически (см. чертеж).

Возможна автоматизированная регистрация изменения оптической плотности в процессе гемолиза с использованием денситометра ЭФА-1.

Ход определения.

В кювету помещают 2,0 мл взвеси эритроцитов и 2,0 мл 0,004 Н соляной кислоты (перо самописца должно при этом отклоняться в крайнее правое положение) и включают механизм записи. Запись производят на бумажной ленте с миллиметровой сеткой. По мере развития гемолиза самописец вычерчивает интегральную кривую изменения оптической плотности взвеси эритроцитов.

Обработка материала.

Полученную кривую заключают в систему координат таким образом, чтобы нулевая отметка совпадала с началом записи, по оси абсцисс откладывают время гемолиза, а по оси ординат - оптическую плотность.

Изменение оптической плотности, соответствующее гемолизу за каждые последующие 30 секунд, легко найти, сопоставляя отрезки на осях абсцисс и ординат.

Процент распавшихся эритроцитов, приходящихся на 1 мм шкалы ординат, находят, измеряя в миллиметрах общее изменение оптической плотности, которое принимают за 100%. Эритроциты можно разделить на следующие группы: пониженно-стойкие - распавшиеся за первую треть всего времени гемолиза, среднестойкие - за вторую треть и повышенно-стойкие, распавшиеся за последнюю треть времени гемолиза.

Кроме того, можно подсчитать суммарный коэффициент кислотной стойкости эритроцитов, который представляет собой сумму произведений процента гемолиза на соответствующее время.

Этот метод, также как и аналог, применяют для диагностики различных анемий.

Недостатками известного способа являются:

1) трудоемкость; 2) длительность по времени; 3) невозможность оценить динамику растяжимости эритроцитов под влиянием кислотного гемолитика.

Положительным результатом заявляемого способа является определение параметров растяжимости эритроцитов до разрушения и нарастание светопропускания суспензии эритроцитов под воздействием кислотного гемолитика для более точной оценки стойкости эритроцитов к воздействию кислотного гемолитика по величине индекса кислотной стойкости.

Положительный результат достигается тем, что найденная стандартизированная степень разведения эритроцитов позволяет построить кривые гемолиза и растяжимости эритроцитов с использованием анализатора агрегации “Биола”, который используется во многих клинических лабораториях России только для оценки агрегации тромбоцитов, и по ним рассчитать индекс кислотной стойкости, снижающийся или повышающийся при наличии в исследуемой крови большого количества эритроцитов, склонных или более стойких к разрушению кислотным гемолитиком.

Способ осуществляется следующим образом.

Оборудование: анализатор агрегации тромбоцитов “Биола” (фирма “Биола”, ВКНЦ, Москва, Россия); центрифуга лабораторная (ОПн-3У4,2).

Реактивы:

1) антикоагулянт - 3,8% раствор цитрата натрия (получают, растворяя 3,8 г цитрата натрия (РЕАХИМ ОСЧ-6-4 Михайловский завод химреактивов) в 100 мл дистиллированной воды);

2) 0,85% раствор хлорида натрия (получают, растворяя 0,85 г хлорида натрия (РЕАХИМ ОСЧ-6-4 Михайловский завод химреактивов) в 100 мл дистиллированной воды);

3) кислотный гемолитик - 1% раствор уксусной кислоты (получают, добавляя 10,2 мл 98% уксусной кислоты в 89,8 мл дистиллированной воды).

Ход определения.

Из локтевой вены широкой сухой иглой берут кровь в мерную колбу с 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1. Покачиванием или легким встряхиванием кровь перемешивают с антикоагулянтом.

Кровь подвергают центрифугированию на центрифуге при 1500 об/мин в течение 15 мин, после чего плазму отсасывают пипеткой. Полученную эритроцитарную массу разводят 0,85% раствором хлорида натрия в отношении 1:3 и центрифугируют еще 15 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, а оставшуюся эритроцитарную массу тщательно перемешивают до однородного состояния. В пробирку с 4 мл 0,85% раствора хлорида натрия добавляют 0,01 мл полученной эритроцитарной массы и далее работают с данной эритроцитарной взвесью.

Вначале производят запись калибровочной кривой. Для этого 0,3 мл эритроцитарной взвеси помещают в кювету со встроенной магнитной мешалкой анализатора агрегации “Биола”, в нее же при постоянном помешивании на скорости "2" (температура 37°С) после звукового сигнала вводят 0,3 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Калибровочную кривую записывают в течение 2 мин.

Далее производят запись графика. Для этого в другую сухую кювету с магнитной мешалкой помещают 0,3 мл эритроцитарной взвеси и при постоянном помешивании на скорости "2" (температура 37°С) в нее после звукового сигнала вводят 0,05 мл 1% раствора уксусной кислоты. График записывают в течение 5 мин.

Первая кривая (1) отражает динамику изменения среднего размера частиц (эритроцитов) при воздействии на них кислотного гамолитика. Кривая поначалу постепенно растет вверх, отражая, таким образом, процесс растяжения эритроцитов, при котором под влиянием протонов водорода, проникающего в клетки, происходит увеличение онкотического давления внутри них и, как следствие, нарастание входящего тока молекул воды. Достигнув пика, кривая начинает опускаться вниз, что свидетельствует о том, что идет процесс фрагментации и полного разрушения эритроцитов под влиянием кислотного гемолитика.

Вторая кривая (2), характеризует изменение величины светопропускания лазерного пучка при прохождении через эритроцитарную взвесь в тот или иной момент гемолиза. После введения кислотного гемолитика кривая начинает расти вверх, затем, в определенный момент времени, рост ее прекращается и кривая выходит на плато.

Чтение результатов.

Для оценки кислотной стойкости эритроцитов используют следующие показатели.

Для кривой 1:

1) начальный средний размер эритроцитов (усл.ед.);

2) максимальный средний размер эритроцитов (усл.ед.);

3) растяжимость эритроцитов - величина нарастания среднего размера частиц от первоначального к максимальному (выражают в процентах, при этом первоначальный средний размер частиц берут за 100%);

4) время регистрации максимального среднего размера эритроцитов (сек).

Для кривой 2:

1) максимальная скорость гемолиза (усл.ед.);

2) время регистрации максимальной скорости гемолиза (сек);

3) средняя скорость гемолиза - величина, выражаемая площадью, ограниченной:

сверху - кривой 2;

снизу - осью абсцисс;

справа - перпендикуляром, опущенным от 2 кривой в точку оси абсцисс, соответствующую по времени третьей минуте инкубации эритроцитов (усл.ед.).

В заключение рассчитывают индекс кислотной стойкости (ИКС), объединяющий параметры обеих кривых и отражающий устойчивость исследуемых эритроцитов к воздействию кислотного гемолитика. Он определяется по формуле:

ИКС=t_d max/gV m,

где - t_d max - время регистрации максимального среднего радиуса эритроцитов (сек), определяемое по первой кривой;

- gV m - средняя скорость гемолиза (усл.ед.), которую определяют по второй кривой.

При исследовании образцов крови здоровых людей получены следующие нормальные величины ИКС: в среднем - 0,59, с пределами нормальных колебаний от 0,50 до 0,68.

Заявленный способ имеет следующие преимущества:

- простота и удобство выполнения,

- экономичность по времени,

- параллельная запись изменения среднего размера эритроцитов и величины светопропускания.

Заявляемый способ найдет широкое применение в клинике для диагностики различных анемий.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Для оценки кислотной стойкости эритроцитов взвесь эритроцитов стандартизируют разведением эритроцитарной массы физиологическим раствором в отношении 1:3 и центрифугированием в течение 15 мин с последующим разведением 0,01 мл эритроцитарного осадка в 4,0 мл физиологического раствора. Добавляют кислотный гемолитик, в качестве которого используют 1% раствор уксусной кислоты. Определяют величину светопропускания, осуществляя параллельную запись изменения среднего размера эритроцитов и величины светопропускания с построением графиков, по которым определяют время регистрации максимального среднего размера эритроцитов и среднюю скорость гемолиза. Рассчитывают индекс кислотной стойкости эритроцитов (ИКС) по формуле: ИКС= t_d max/gVm, где t_d max - время регистрации максимального среднего радиуса эритроцитов, сек; gVm – средняя скорость гемолиза, усл. ед., величину ИКС от 0,50 до 0,68 считают нормальной. Применение способа позволяет оценить показатели ригидности и стойкости эритроцитарного пула, необходимые для диагностики анемий различного происхождения. 1 ил.

Способ оценки кислотной стойкости эритроцитов путем определения величины светопропускания стандартизированной взвеси эритроцитов после добавления в нее кислотного гемолитика с построением графика гемолиза, отличающийся тем, что взвесь эритроцитов стандартизируют разведением эритроцитарной массы физиологическим раствором в отношении 1:3 и центрифугированием в течение 15 мин с последующим разведением 0,01 мл эритроцитарного осадка в 4,0 мл физиологического раствора, в качестве кислотного гемолитика используют 1%-ный раствор уксусной кислоты, осуществляют параллельную запись изменения среднего размера эритроцитов и величины светопропускания с построением графиков, по которым определяют время регистрации максимального среднего размера эритроцитов и среднюю скорость гемолиза и рассчитывают индекс кислотной стойкости эритроцитов (ИКС) по формуле

ИКС= t_d max / gVm,

где t_d max - время регистрации максимального среднего радиуса эритроцитов, с;

gVm – средняя скорость гемолиза, усл. ед.;

величину ИКС от 0,50 до 0,68 считают нормальной.