СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/68 

Уровень техники

Царства микроорганизмов, растений и животных (например, беспозвоночных) являются богатыми природными источниками активных ингредиентов с различными физико-химическими и лекарственными свойствами. Фармакопеи США и Европы наполнены примерами медикаментов, происходящих из природных источников. Смотри U.S. Pharmacopeia, 1995 (United States Pharmacopeial Convention, Inc., 1994) и Martindale, The Extra Pharmacopeia 31 (Royal Pharmaceutical Society, 1996). Многие антимикробные агенты (например, пенициллины, цефалоспорины и аминогликозиды), противогрибковые средства (например, амфотерицин В и нистатин), антипаразитарные средства (например, хинин), кардио- и вазоактивные агенты (например, сердечные гликозиды - дигоксин, алкалоиды спорыньи, никотин и окситоцин), противовоспалительные агенты (например, аспирин), мускариновые агенты (например, ацетилхолин) и антимускариновые агенты (например, атропин и скополамин), агенты, действующие на нервную систему (например, кураре, физостигмин и опиаты), актикоагулянты (например, гепарин), противоопухолевые агенты (например, алкалоиды барвинка, таксол и производное подофиллотоксина этопозид) и гормоны (например, эстрогены, андрогены, прогестины, пептидные гормоны и ростовые факторы) были открыты как природные продукты. Смотри, например, Goodman & Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (9th Edition McGraw-Hill, 1996). В этих примерах предполагается, что некоторые активные компоненты растительных экстрактов также могут быть очищены и при этом все еще сохраняют свою биологическую активность.

В большинстве указанных выше примеров выдающиеся этнофармакологические свойства соединения были охарактеризованы в известных фармакологических системах и тестах только после выделения соединения из природного источника. Смотри, например. Turner, R.A. Screening Methods in Pharmacology (Academic Press, 1965) и Turner, R.A., Peter Hebborn Screening Methods in Pharmacology (Vol.II, Academic Press, 1971). В то время, как способ определения или подтверждения активностей растительных экстрактов может быть осуществлен путем скрининга их индивидуальных компонентов, многие из этих экстрактов могут обладать дополнительными формами фармакологической активности, которая может быть не очевидной на основании известных для экстрактов, если таковые известны, этнофармакологических характеристик их индивидуальных компонентов (например, способность экстрактов влиять на передачу сигнала в ядро, изменять перемещение рецепторов клеточной поверхности и регулировать события на уровне генома).

Характеристика определенных природных соединений, либо происходящих из природных источников, либо получаемых синтетическим или полусинтетическим путем, составляет фармакологическую базу для основной части западной медицины. Способ разделения этнофармакологически активного растительного экстракта до единственного основного активного соединения может, однако, приводить к потере биологической активности по ряду причин (например, отдельное соединение нестабильно в процессе экстракции или в очищенной форме, соединение может реагировать с химическими компонентами, присутствующими в экстракте в процессе очистки, соединение отделяется в процессе очистки или, что более важно, в основе фундаментальной этнофармакологии не всегда лежит принцип присутствия в экстракте единственного активного соединения, а предпочтительнее - принцип взаимодействия двух или более активных соединений, обнаруживаемых в экстракте). Таким образом, новой фармакологической концепцией являются вероятность присутствия в растительном экстракте более одного соединения, способного вносить вклад в суммарное фармакологическое действие экстракта, а также геномные способы идентификации таких соединений в природном продукте.

В настоящем изобретении предлагается геномный скрининг, с помощью которого экстракт из растения может быть охарактеризован в отношении его потенциальных биологических свойств, которые могут относиться или не относиться к известным, если они известны, этнофармакологическим свойствам экстракта. В настоящем изобретении предлагается новый подход к анализу потенциального (потенциальных) механизма (механизмов) действия растительных экстрактов, лежащих в основе эффективности их терапевтического действия, и способ идентификации индивидуального (индивидуальных) соединения (соединений), который проявляет раскрытое биологическое свойство, для идентификации нового фармацевтического агента или нового фармацевтического применения существующего фармацевтического препарата.

Сущность изобретения

В одном аспекте характеризуется способ идентификации фармакологического агента, причем способ включает стадии: обработки клеток определенного типа растительным экстрактом; выделения белка или РНК (например, матричной РНК) из клеток определенного типа, обработанных растительным экстрактом; идентификации тех белка или РНК, выделенных из клеток определенного типа, обработанных растительным экстрактом, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках определенного типа (например, белка или РНК, которые регулируются позитивно, регулируются негативно, появляются или исчезают в клетках определенного типа под действием растительного экстракта); обработки соединением (соединениями) клеток определенного типа, причем соединением (соединениями), обнаруженным(и) в растительном экстракте; выделения белка или РНК из клеток определенного типа, обработанных данным соединением (соединениями); а также идентификации того (тех) соединения (соединений), которое (которые) также вызывает стимуляцию или подавление экспрессии белка или РНК, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках определенного типа.

Термин "растительный экстракт" обозначает набор различных природных соединений, которые выделены из растения (например, из листьев, коры, плодов, цветков, семян или корней). Примером такого экстракта является экстракт из дерева ginkgo biloba (гинкго двухлопастный). Термин "клетка определенного типа" обозначает либо выделенную клетку (например, происходящую из такого организма, как организм человека или животного), либо клетки, содержащиеся в ткани или в органе этого организма. Клетка определенного типа может быть нормальной клеткой или патологически измененной клеткой (например, клеткой, которая патологически или физиологически отлична от своего нормального клеточного типа, такой как опухолевая клетка).

Растительный экстракт и соединение (соединения) могут быть внесены к клеткам определенного типа либо in vitro, либо вводиться in vivo (например, интактному животному, из которого впоследствии получают данный тип клеток после обработки растительным экстрактом или соединением (соединениями). При внесении in vitro белок или РНК, например, могут быть выделены немедленно или в течение не более чем одного дня после внесения растительного экстракта или соединения (соединений). При введении in vivo белок или РНК, например, могут быть выделены немедленно или в течение не более чем одного дня после введения растительного экстракта или соединений животному. Белок может находиться внутри клеток данного типа или секретироваться клетками данного типа. Примеры таких белков включают рецепторы, ростовые факторы, ферменты или транскрипционные факторы.

В другом аспекте в изобретении характеризуется способ определения геномного ответа клеток определенного типа на растительный экстракт, причем этот способ включает стадии: обработки растительным экстрактом клеток определенного типа; выделения белка или РНК (например, матричной РНК) из клеток определенного типа, обработанных растительным экстрактом; и сравнения белка или РНК, выделенных из клеток определенного типа, обработанных растительным экстрактом, с белком или РНК, выделенных из необработанных клеток определенного типа.

В одном воплощении способ дополнительно включает стадию идентификации того белка или РНК, выделенных из клеток определенного типа, обработанных растительным экстрактом, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках определенного типа. В следующем воплощении способ дополнительно включает секвенирование белка, РНК или белка, кодируемого данной РНК, идентифицированных в клетках определенного типа, обработанных растительным экстрактом, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках определенного типа. В еще одном воплощении способ дополнительно включает идентификацию гена, кодирующего белок или РНК, идентифицированные в клетках определенного типа, обработанных растительным экстрактом, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках определенного типа.

В другом воплощении клетки определенного типа соответствуют известной биологической мишени (например, участку активации) растительного экстракта. Например, если известно, что растительный экстракт лечит астму, рак, расстройства кровообращения или неврологические нарушения, то применяемым типом клеток является клетка легкого, раковая клетка, клетка сосуда или нервная клетка, соответственно.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут ясны из подробного описания изобретения и из формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

Подразумевается, что специалисты в данной области науки, основываясь на представленном здесь описании, могут использовать настоящее изобретение в наиболее полной степени. Следующие конкретные воплощения следует поэтому рассматривать только как иллюстративные, и они ни в коей мере не ограничивают остальную часть раскрытия изобретения.

Если это специально не оговорено, все используемые здесь научные и технические термины имеют то же самое значение, что и общепринятое, понятное обычным специалистам в области, к которой относится изобретение. Кроме того, все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены для справки.

Растительные экстракты и их индивидуальные соединения

Растительные экстракты могут быть получены стандартными способами химической экстракции (например, применяя воду для экстракции водорастворимых соединений, спирты и ацетон для экстракции жирорастворимых соединений или их смеси). Экстракт может быть затем дополнительно очищен для снижения количества соединений в экстракте или даже выделения единственного соединения или соединений одного класса с помощью стандартных способов, таких как хроматография и кристаллизация. Смотри, например, Ginkgolides - Chemistry, Biology, Pharmacology and Clinical Perspectives, edited by P. Braquet (J.R.Prous, Science Publishers, Barselona, Spain, 1988); Okabe, J. Chem. Soc. (c) p.2201 (1967); и Nakauishi, Pure & Applied Chemistry 19:89 (1967).

Идентификация геномных событий путем выделения белка

Клетки-мишени определенного типа в культуре собирают перед и после экспозиции с рядом концентраций растительного экстракта (например, экстракта ginkgo biloba). Сходная процедура может быть применена в отношении клеток из ткани или органа-мишени организма, который подвергался воздействию дозы или множественных доз растительного экстракта.

Клетки лизируют и белки солюбилизируют в буферах, содержащих детергенты (например, твин 20, SDS (додецилсульфат натрия) или NP-40, получаемых из Sigma Chemicals, St. Louis, МО). Белки разделяют двумерным электрофорезом в геле с изоэлектрофокусированием а первом направлении и градиентным электрофорезом в геле во втором направлении. Смотри, например, Ausubel, A.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, pp.10.3.1-10.4.5. (John Wiley & Sons, 1987). Это чрезвычайно эффективный способ для исследования сложных смесей белков (например, в одном 2-мерном геле можно разделить по крайней мере 1500 белков). Смотри, например, O'Farrell, Р.Н., J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975).

Матрица экспрессии белков может быть визуализирована окраской Coomasie Blue (Ausubel, A.M., et al.. Current Protocols in Molecular Biology, pp.10.6.1 (John Wiley & Sons,(1987)) или окраской серебром (Ausubel, A.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, pp.10.6.1-10.6.3 (John Wiley & Sons (1987)).

Для мониторинга эффекта растительных экстрактов на типы клеток in vitro клеточные линии или клетки, выделенные из тканей животных, могут инкубироваться, например, с растущими дозами растительных экстрактов, например, при 37°С. Клетки могут быть собраны через различные промежутки времени для выделения клеточных белков или РНК с применением традиционных способов.

РНК из необработанных и обработанных клеток можно анализировать, например, используя электрофорез в 1% агарозном/формальдегидном геле с переносом на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизацией с геноспецифичными радиомечеными ДНК-зондами. Гибридизация может быть проведена, например, при 42°С в течение 24 часов в 50% (по объему) формамиде, 2х стандартном цитратном буфере (SSC), 1х растворе Денхардта, 0,1% додецилсульфате натрия (ДСН) и 200 мг/мл ДНК из молок лосося. Фильтры могут быть надлежащим образом промыты и затем нанесены на рентгеновскую пленку. Авторадиографические полосы сканируют для определения положительной или отрицательной регуляции конкретных интересующих генов.

Общий клеточный белок может быть подвергнут электрофорезу в 10% ДСН-полиакриламидном геле и затем перенесен на нитроцеллюлозную бумагу. Фильтры могут инкубироваться с антителами против конкретного интересующего белка, а затем со вторым меченым антителом для визуализации комплекса антиген-антитело методом хемилюминесценции. Авторадиографические полосы сканируют для определения положительной или отрицательной регуляции конкретных интересующих генов.

Клетки можно также метить в пульсовом режиме радиоактивными аминокислотами, например, S³⁵-метионином (Amersham Corp., Arlington Heights/ IL), и определить матрицу экспрессии меченых белков авторадиографией 2-мерных гелей. В том случае, когда изучают матрицу посттрансляционно модифицированных белков, например, фосфорилированных белков, к инкубационной среде добавляют радиоактивный донор фосфата, такой как Р³²-γАТФ (Amersham Corp., Arlington Heights, IL), и затем матрица фосфорилированного белка в 2-мерных гелях может быть визуализирована с помощью авторадиографии.

Смотри, например, Hansen К., et al., Electrophoresis 14:112-116 (1993); и Guy, R., Electrophoresis 15:417-440 (1994). В более позднем варианте экспрессия немеченых фосфорилированных белков может визуализироваться с помощью антител против фосфотирозина или фосфосерина после переноса гелей на нитроцеллюлозу. Смотри, например, Ausubel, A.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, pp. 10.7.1-10.8.6 (John Wiley & Sons, 1987).

Специфические геномные события определяют с помощью сравнения матрицы экспрессии белков в клетках перед и после экспозиции с растительным экстрактом. Пятна конкретных белков в 2-мерных гелях, для которых выявлено либо увеличение, либо снижение экспрессии, определяемое по интенсивности окраски карты белков, отражают изменения в геномной активности, индуцированные компонентами растительного экстракта. Способ является высоковоспроизводимым и может служить средством для выделения малых количеств чрезвычайно чистых белков для анализа аминокислотной последовательности с применением стандартной техники (т.е. химии отщепления с амино-конца по Эдману). Смотри, например, Graven, et al., J. Biol. Chem. 269:24446 (1994).

Для белков, которые экспрессируются в низких количествах так, что для пептидного секвенирования можно не получить достаточного количества материала, пятна белков можно вырезать из 2-мерного геля и использовать непосредственно для иммунизации кроликов для выработки антител. Смотри Harlow, Е. & Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, p.61. Доступность антитела позволяет использовать иммуноаффинную очистку более высоких количеств регулируемого белка для идентификации последовательности аминокислот в пептиде.

Исходя из последовательности аминокислот в пептиде, можно синтезировать олигонуклеотиды, основываясь на вырожденном или наиболее предпочитаемом генетическом коде, для использования в качестве зондов для скрининга библиотеки кДНК с целью получения полноразмерной кодирующей последовательности гена (генов). Смотри, например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 2 (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Идентификация геномных событий с помощью выделения мРНК

Другой способ выявления изменений геномных событий в ответ на растительный экстракт заключается в отслеживании изменений матричной РНК (мРНК) в клетке (Liang, P. & Pardee, А.В., Science 257:967-971 (1992)). Для этого клетку в культуре экспонируют с растительным экстрактом в некоей концентрации, или клетки в составе ткани, или органа-мишени в организме могут быть подвержены местному или системному действию одной дозы или множественных доз растительного экстракта в течение определенного периода с последующей экстракцией.

мРНК получают обычными способами экстракции суммарной РНК, как описано в Ausubel, A.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, pp.4.1.2-4.3.4 (John Wiley & Sons, 1987). Поли(А⁺) РНК может быть получена из этого препарата с помощью хроматографии на олиго-dT (Aviv, Н., & Leder, P., J. Mol. Biol. 134:743 (1972), как описано в Ausubel, A.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, pp.4.5.1-4.5.3 (John Wiley & Sons, 1987).

Готовят два пула мРНК, т.е. один - из клеток перед и другой - после экспозиции с растительным экстрактом. Специфические геномные события представлены в обоих пулах в зависимости от того, подавляется ли активность гена или увеличивается экспрессия гена под действием растительного экстракта. В случае, когда ген негативно регулируется в ответ на действие растительного экстракта, мРНК должна присутствовать в больших количествах в пуле мРНК, полученном из контрольных клеток. В случае, когда ген позитивно регулируется в ответ на действие растительного экстракта, мРНК должна присутствовать в больших количествах в пуле мРНК, полученном из клеток, обработанных растительным экстрактом. Для идентификации групп мРНК, которые регулируются позитивно или негативно, может быть применен ряд методов, например, разностной гибридизации или дифференциального проявления.

(а) Разностная гибридизация

Были разработаны методы разностной гибридизации (Lee, S.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2825 (1991)), в которых мРНК одного из двух пулов превращают в первую цепь кДНК (антисмысловую) с использованием олиго-dT праймеров, либо прикрепленных к целлюлозным шарикам, либо в свободной форме, и обратной транскриптазы. Смотри, например, Sam-brook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 2, р. 10.46 (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). В случае, когда первая цепь прикреплена к целлюлозным шарикам, разностная хроматография мРНК может быть выполнена путем пропускания второго пула мРНК через колонку. мРНК, представленная в обоих пулах, должна гибридизоваться (т.е. мРНК из второго пула должна гибридизоваться с антисмысловой кДНК на колонке и должна задерживаться на колонке). Незадерживаемый материал, который не гибридизуется в колонке, должен содержать типы мРНК, возникающие в результате изменения геномной активности в ответ на действие растительного экстракта на клетки. Затем на основе мРНК незадерживаемого материала может быть получена библиотека кДНК в бактериофаге. Смотри, например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 2, pp.8.11-8.45 (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Специфические клоны, не представленные в первом пуле мРНК, идентифицируют в виде негибридизуемых бляшек в случае, если скрининг библиотеки проводят с помощью зондов, меченных Р³² по концам, полученных на основе первого пула. Описаны также и другие сопоставимые подходы (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 2, pp.10.41, 10.42 (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Включенные гены идентифицируют секвенированием ДНК клонов кДНК. Смотри, например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 2, pp. 13.3-13.20 (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

(b) Дифференциальное проявление мРНК

Этот способ хорошо описан в научной литературе. Смотри Liang, Р., & Pardee, А.В., Science 257:967-970 (1992); Callard, D., et al., BioTechniques 16:1096-1103 (1994); Chen, Z., et al., BioTechniques 16:1003-1006 (1994); и Zhao, S., et al., BioTechniques 20:400-404 (1996). Частичные последовательности кДНК для мРНК, выделенных из клеток, обработанных или не обработанных растительным экстрактом, получают с помощью обратной транскрипции (смотри, например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 2, p. 10.46 (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, с использованием 5'-Т₁₁СА в качестве 3'-праймера и короткого (6-7 оснований) 5'-праймера. Для реакции амплификации применяют метку α³⁵S-dАТФ. Меченные, амплифицированные с помощью ПЦР короткие фрагменты каждого из пулов мРНК затем фракционируют (например, проявляют) с помощью гелей для секвенирования ДНК. Полосы, представленные с неравной интенсивностью в двух пулах, вырезают из геля, повторно амплифицируют и используют в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК, как описано выше, для идентификации генов, регулируемых растительным экстрактом.

Применение

Этим способом можно составить каталог профиля генов конкретного типа клеток в ответ на экспозицию с определенным растительным экстрактом, представляющим интерес с точки зрения фармакологии, не зная подлинных компонентов растительного экстракта. Полезность растительного экстракта может быть затем оценена на основе известной роли некоторых из этих генов в специфических биологических процессах. В этом смысле терапевтический потенциал продукта может выходить за рамки его известных этнофармакологических свойств, или его известное этнофармакологическое свойство может быть подтверждено на уровне генома. Более того, аналогично действующее(щие) индивидуальное(ные) соединение (соединения) экстракта могут впоследствии быть идентифицированы в качестве терапевтических средств на основе влияния экстракта на определенный набор геномных событий.

Другие воплощения

Должно быть понятно, что в то время, как изобретение было описано в связи с его подробным описанием, упомянутое выше описание сделано с целью иллюстрации и не ограничивает объема изобретения, которое определено объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации представлены в формуле изобретения.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к способам геномного скрининга, и может быть использовано для идентификации фармакологического агента в растительном экстракте. Способ осуществляют путем обработки клеток растительным экстрактом, выделения белка или РНК из этих клеток; идентификации тех выделенных белка или РНК, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках, обнаружения соединения (соединений) в указанном растительном экстракте. Далее обрабатывают обнаруженным соединением (соединениями) клетки, выделяют белок или РНК из клеток, обработанных данным соединением (соединениями) и идентифицируют то (те) соединение (соединения), которое (которые) также вызывает стимуляцию или подавление экспрессии белка или РНК, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках. Изобретение позволяет охарактеризовать биологические свойства растительного экстракта и выявить индивидуальное соединение (соединения), которое проявляет неизвестное или раскрытое биологическое свойство данного экстракта. 5 з.п. ф-лы.

1. Способ идентификации фармакологического агента, причем указанный способ включает стадии: обработки клеток определенного типа растительным экстрактом; выделение белка или РНК из клеток определенного типа, обработанных указанным растительным экстрактом; идентификации тех указанных белка или РНК, выделенных из клеток определенного типа, обработанных указанным растительным экстрактом, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках определенного типа; обнаружения соединения (соединений) в указанном растительном экстракте; обработки соединением (соединениями) клеток указанного типа, обнаруженным (обнаруженными) в указанном растительном экстракте; выделение белка или РНК из клеток определенного типа, обработанных указанным (указанными) соединением (соединениями); и идентификации того (тех) из указанного (указанных) соединения (соединений), которое (которые) также вызывает (вызывают) стимуляцию или подавление экспрессии указанного белка или РНК, концентрация которых отличается от таковой в необработанных клетках указанного типа.2. Способ по п.1, который включает выделение белка из клеток определенного типа, обработанных указанным растительным экстрактом, и

из клеток определенного типа, обработанных указанным (указанными) соединением (соединениями).