СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ И СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВОДОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N31/00 G01N31/22 G01N21/78 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу детектирования водородных радикалов, присутствующих в воде, в частности в электролитически восстановленной воде или в водном растворе, и к способу количественного анализа концентрации водородных радикалов.

Предпосылки изобретения

Как правило, так называемая электролитически восстановленная вода, получаемая в катодной камере путем электролиза электролитического раствора гидроксида натрия или подобного, рассматривается как жидкость, имеющая активность по отношению к устранению активного кислорода и ингибирующую активность по отношению к расщеплению цепочек ДНК в организме. Это рассматривается как результат способности к восстановлению активного водорода, содержащегося в электролитически восстановленной воде.

Концентрация водородных радикалов, содержащихся в электролитически восстановленной воде или в подобном, влияет на активность по отношению к устранению активного кислорода в организме, и, следовательно, установление способа детектирования для водородных радикалов, а также способа количественного анализа для этого, является востребованным.

Термин активный водород обозначает водородный радикал, легко вызывающий химическое взаимодействие с помощью такого способа, как ультрафиолетовое излучение или разряд, и водород, образующийся, когда кислота действует на металл, или тот, который возникает на катодной стороне при электролизе, также представляет собой водородный радикал, имеющий высокую реакционную способность. Активный водород высвобождает металл из соли щелочного металла и легко восстанавливает до металлов оксиды, сульфиды и тому подобное различных металлических элементов. Кроме того, активный водород образует гидрид с мышьяком, фосфором, кислородом, галогеном, сурьмой, оловом или подобным и образует формальдегиды с моноокисью углерода и двуокисью углерода. Кроме того, активный водород вызывает реакцию присоединения, замещения или отщепления атома водорода с различными органическими соединениями и добавляет водород к ненасыщенному органическому соединению. Водородные радикалы, которые сами по себе являются относительно стабильными, выделяют исключительно большое количество тепла и возвращаются в молекулярное состояние, когда приходят в контакт с поверхностью металла.

2H → H₂ + 435 кДж/моль

Водородные радикалы детектируются по разнице давлений, когда их концентрация является высокой, или по изменению цвета оксида вольфрама, или по другому, когда их количество является малым. Однако эти способы для детектирования водородных радикалов, образующихся в газе, не могут быть применены для измерения количества водородных радикалов, присутствующих в воде. Присутствие водородных радикалов в электролитически восстановленной воде может быть доказано, когда водородные радикалы могут быть детектированы и определены путем их захвата с помощью водорастворимого агента для захвата радикалов, и, следовательно, исследования развиваются для установления способа детектирования и способа определения.

Когда используется только образец воды или водорастворимый агент для захвата радикалов из 5,5-диметил-1-пирролин-N-оксида (ДМПО) и образец водного раствора, взаимодействующие друг с другом для измерения спектра ЭПР (электронного парамагнитного резонанса) с помощью резонатора для электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), спектр, соответствующий водородным радикалам, не наблюдается.

Когда гидроксидные радикалы образуются с помощью реагента Фентона, для подтверждения уменьшения количества гидроксидных радикалов с помощью восстанавливающей способности образца водного раствора по спектру ЭПР, четкой разницы не наблюдается. Таким образом, считается трудным детектирование водородных радикалов, присутствующих в электролитически восстановленной воде, с помощью способа, имеющего низкую чувствительность детектирования, из-за низкой концентрации водородных радикалов.

Описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает способ детектирования водородных радикалов, присутствующих в воде или в водном растворе, с высокой точностью, и способ количественного анализа для этого. Автор пытался нейтрализовать большое количество образцов воды, заставляя их взаимодействовать с агентом для захвата радикалов из натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС), и после этого концентрируя их в роторном испарителе. В результате, в образце электролитически восстановленной воды, проявляющем активность по отношению к устранению активного кислорода, наблюдается оранжевое окрашивание. Однако никакого окрашивания не наблюдается по отношению к сверхчистой воде (вода Milli Q), к другой минеральной воде или к технической воде. Это является понятным, поскольку ДБНБС взаимодействует с активным водородом, присутствующим в электролитически восстановленной воде, для того, чтобы вновь образовать окрашенное вещество. Автор полагает, что водородные радикалы, присутствующие в водном растворе, могут точно детектироваться с помощью этого явления, и разработал способ детектирования и способ количественного анализа для водородных радикалов. Настоящее изобретение основывается на указанном выше наблюдении и предлагает способы детектирования и количественного анализа водородных радикалов путем использования натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) в качестве агента, захватывающего радикалы, для электролитически восстановленной воды или подобного.

Настоящее изобретение направлено на способ детектирования водородных радикалов, присутствующих в воде или в водном растворе, с помощью добавления натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) к образцу таким образом, что она взаимодействует с водородными радикалами, при этом образуя азосоединение ДБНБС, и детектирования водородных радикалов с помощью окрашивания, основываясь на его характеристиках поглощения.

В качестве указанной воды или водного раствора предпочтительно используется электролитически восстановленная вода.

Указанное окрашивание использует такую реакцию окрашивания, что натриевая соль 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) взаимодействует с водородными радикалами, с образованием азосоединения ДБНБС. Это окрашивание следует из пика поглощения на длинах волн от 425 до 450 нм.

Настоящее изобретение также направлено на способ количественного анализа для водородных радикалов, присутствующих в воде или водном растворе, состоящий из следующих стадий (1)-(4):

(1) продувки газообразного водорода через раствор 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (здесь и далее упоминается как ДФПГ), имеющий поглощение вблизи 517 нм, при постоянной скорости, в присутствии платиновой черни, для получения графика корреляции между уменьшением коэффициента поглощения вблизи 517 нм и временем продувки газообразного водорода (создание калибровочной кривой A);

(2) взаимодействия цистеина и ДФПГ друг с другом, для получения графика корреляции между уменьшением коэффициента поглощения ДФПГ вблизи 517 нм и концентрацией цистеина (создание калибровочной кривой B), где цистеин может быть заменен таким восстанавливающим агентом, как аскорбиновая кислота;

(3) продувки газообразного водорода через раствор натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) с постоянной скоростью, в присутствии платиновой черни, в течение заданного времени, при таких же условиях, как в указанной стадии (1), и после этого измерения коэффициента поглощения вблизи 450 нм, для получения графика корреляции между значением коэффициента поглощения и концентрацией водородных радикалов, образовавшихся в течение времени продувки газообразного водорода, вычисленной по калибровочной кривой A и калибровочной кривой B (создание калибровочной кривой C); и

(4) добавления натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) к образцу и измерения коэффициента поглощения вблизи 450 нм, для получения значения концентрации водородных радикалов по значению коэффициента поглощения, с помощью указанной калибровочной кривой C.

Вода или водный раствор предпочтительно концентрируют для повышения концентрации водородных радикалов в 10–500 раз.

Далее описание приводится на основе одного из воплощений настоящего изобретения.

В настоящем изобретении способ детектирования водородных радикалов использует характеристики поглощения света, основанные на взаимодействии, представленном ниже. То есть натриевая соль 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) взаимодействует с водородными радикалами, с образованием азосоединения ДБНБС. Азосоединение ДБНБС имеет пик поглощения на длинах волн от 425 до 450 нм, и, следовательно, водородные радикалы могут детектироваться по его окрашиванию.

Как показано на схеме реакций, ДБНБС (формула A) взаимодействует с водородными радикалами, присутствующими в воде или водном растворе, и преобразовывается в ДБНБС-H (формула B), и две его молекулы взаимодействуют друг с другом с образованием димера (формула C). После этого осуществляется дегидратация при нагревании с образованием азокси соединения ДБНБС (формула D). Одна молекула кислорода удаляется с образованием стабильного азосоединения ДБНБС (формула E). Количественный анализ водородных радикалов становится возможным путем детектирования поглощения при 425-450 нм, полученного от этого азосоединения ДБНБС. Хотя последовательное взаимодействие указанных выше соединений формул A-E представляет собой новую реакцию, обнаруженную автором впервые, сходная реакция образования азоксибензола или азобензола за счет реакции восстановления нитробензола или нитрозобензола является известной (A.Streitwieser, Jr. & C.H.Heathcock: Introduction to Organic Chemistry, pp. 960-965, Macmillan Publishing Co., Inc., New York (1976)). Азоксибензол и азобензол взаимно преобразуются друг в друга с помощью реакции окисления-восстановления.

Водородные радикалы, присутствующие в воде или водном растворе, количественно анализируются с помощью следующего способа.

ДФПГ находится в форме стабильных свободных радикалов, имеющих специфическое поглощение при длинах волн вблизи 517 нм. ДФПГ количественно взаимодействует с водородными радикалами, и поглощение вблизи 517 нм исчезает. С другой стороны, гранулированная платиновая чернь, имеющая большую площадь поверхности, преобразует молекулы газообразного водорода в водородные радикалы (атомарный водород) и удерживает их. Следовательно, водородные радикалы легко могут получаться путем продувки газообразного водорода через раствор, в присутствии платиновой черни. Когда газообразный водород продувается через водный раствор ДФПГ заданной концентрации в присутствии платиновой черни при постоянных условиях, при этом может быть получена калибровочная кривая (A), демонстрирующая взаимосвязь между временем продувки и уменьшением коэффициента поглощения ДФПГ при 517 нм.

Чтобы рассчитать концентрацию водородных радикалов, образовавшихся за время продувки газообразного водорода, восстанавливающее вещество, такое как цистеин, например, который, как известно, взаимодействует количественно, и ДФПГ взаимодействуют друг с другом с получением калибровочной кривой (B), демонстрирующей концентрацию цистеина и уменьшение коэффициента поглощения ДФПГ вблизи 517 нм. Полагая, что 1 моль цистеина соответствует 1 моль водородного радикала, концентрация водородных радикалов, образующихся за время продувки газообразного водорода, вычисляется по калибровочной кривой (A).

С другой стороны, ДБНБС (формула A) взаимодействует с водородными радикалами с образованием азосоединения ДБНБС (формула D), через промежуточное дигидрокси соединение (ДБНБС-H-) формулы B и его димер (формула C). Специфичное поглощение азосоединения ДБНБС вблизи 450 нм используется для количественного анализа. Водородные радикалы образуются, когда продувается газообразный водород в присутствии платиновой черни, как описано выше, и, следовательно, калибровочная кривая (C), демонстрирующая взаимосвязь между поглощением вблизи 450 нм и концентрацией водородных радикалов, может быть получена с помощью калибровочных кривых (A) и (B), путем получения взаимосвязи между коэффициентом поглощения вблизи 450 нм и временем продувки газообразного водорода.

Следовательно, чтобы получить значение концентрации водородных радикалов в образце, ДБНБС заданной концентрации добавляют к раствору образца для взаимодействия ДБНБС с водородными радикалами и образования азосоединения ДБНБС, и после этого измеряется его коэффициент поглощения вблизи 450 нм, для измерения концентрации водородных радикалов по указанной калибровочной кривой (C).

Когда в качестве образца используется электролитически восстановленная вода, эту электролитически восстановленную воду предпочтительно концентрируют до 10-500 раз. Например, 200 мкл хранимого раствора ДБНБС добавляют к 125 мл электролитически восстановленной воды, и смесь перемешивается, а затем концентрируется/обезвоживается в термостате при 60°C, с помощью роторного испарителя. Концентрированное/обезвоженное вещество растворяют в 1 мл сверхчистой воды (вода Milli Q) и извлекают. Затем концентрированное/обезвоженное вещество сохраняют в термостате с нагревом при 60°C, в течение около 1 часа, оставляют стоять на льду в течение 5 минут и центрифугируют, например, при 12000 об/мин, с получением супернатанта.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, демонстрирующий характеристики поглощения азосоединения ДБНБС.

Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий взаимосвязь между временем продувки газообразного водорода и коэффициентом поглощения при 450 нм.

Фиг.3 представляет собой график, демонстрирующий взаимосвязь между содержанием электролитически восстановленной воды и значениями степени взаимодействия водородных радикалов.

Фиг.4 представляет собой график, демонстрирующий взаимосвязь между концентрацией хлорида натрия и значениями степени взаимодействия водородных радикалов.

Фиг.5 представляет собой график, демонстрирующий результат измерения количества не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС с помощью ВЭЖХ.

Фиг.6 представляет собой график, демонстрирующий спектр поглощения не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС в видимом и ультрафиолетовом свете.

Фиг.7 представляет собой график, демонстрирующий результат измерения количества подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС с помощью ВЭЖХ.

Фиг.8 представляет собой график, демонстрирующий спектр поглощения подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС в видимом и ультрафиолетовом свете.

Фиг.9 представляет собой график измерения масс-спектра не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС.

Фиг.10 представляет собой график измерения масс-спектра подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС.

Фиг.11 представляет собой график измерения спектра ЯМР не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС.

Фиг.12 представляет собой график измерения спектра ЯМР подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС.

Фиг.13 представляет собой график, демонстрирующий калибровочную кривую A.

Фиг.14 представляет собой график, демонстрирующий калибровочную кривую B.

Фиг.15 представляет собой график, демонстрирующий калибровочную кривую C.

Наилучший способ осуществления изобретения

Пример 1: Детектирование образования водородных радикалов с помощью платиновой черни-водорода с ДБНБС

1-1 Реагент

Используется ДБНБС от Labo Tech Co., Ltd., платиновая чернь от Ishifuku Kinzoku Kogyo Kabushiki Kaisha и газообразный водород от Taiyo Sanso Kabushiki Kaisha. ДБНБС растворяют в сверхчистой воде (вода Milli Q) при концентрации 12,5 мг/мл, хранят при 4°C и используют полностью в течение двух недель.

1-2 Образование водородных радикалов с помощью платиновой черни-водорода

Газообразный водород преобразуется в атомарный водород на поверхности платины. Для этого газообразный водород продувают через 20 мл раствора ДБНБС, 2,5 мг/мл, содержащего 0,01 мг/мл платиновой черни, при скорости продувки 45 мл/мин. Образцы по 200 мкл каждый извлекают через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 минут, соответственно, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 минут, и после этого супернатанты содержатся в термостате с нагревом при 60°C в течение 1 часа. Контроль, приготовленный без продувки газообразного водорода, сохраняется с нагревом при 60°C в течение 1 часа.

1-3 Детектирование водородных радикалов

Контрольный водный раствор ДБНБС после взаимодействия калибруется для понижения поглощения самого ДБНБС до нуля, и длины волн от 350 до 600 нм соответствующих образцов ДБНБС сканируются для получения дифференциального спектра. Этот дифференциальный спектр измеряется для детектирования того, что ДБНБС преобразуется в новое вещество благодаря обработке платиновой чернью-водородом. Чтобы исследовать, взаимодействует или нет ДБНБС специфически с водородными радикалами, возникающими от обработки платиновой чернью-водородом, изготавливают также образцы, обработанные только платиновой чернью, только газообразным водородом, только газообразным азотом и платиновой чернью-газообразным азотом.

Образец азосоединения ДБНБС, полученный с помощью реакции платиновой черни–водорода, демонстрирует гладкий спектр поглощения в видимой области, имеющий пик в области от 425 нм до 450 нм, как показано на фиг.1 (Pt-H₂). Этот образец имеет оранжевый цвет. Это указывает на то, что ДБНБС преобразуется в азосоединение ДБНБС, то есть в новое вещество оранжевого цвета. Высота пика увеличивается в зависимости от количества продуваемого газообразного водорода, достигая максимума при времени продувки 45 минут, и потом уменьшается, как показано на фиг.2.

В образцах, обработанных только платиновой чернью, только газообразным водородом, только газообразным азотом и платиновой чернью-газообразным азотом, изготовленных для исследования специфичности реакции платиновой черни-водорода, окрашивание не наблюдается, и не наблюдается изменений также и в ультрафиолетовой части спектра поглощения. Значения коэффициента поглощения в спектрах поглощения веществ, полученных путем взаимодействия с водородными радикалами, при 450 нм рассматриваются как значения степени взаимодействия водородных радикалов (значения AH).

Пример 2: Детектирование водородных радикалов в электролитически восстановленной воде с помощью ДБНБС

2-1 Реагент

Используются такие же реагенты, как и в примере 1.

2-2 Электролитически восстановленная вода

Вода, содержащая 0,01% NaCl, электролитически восстанавливается с помощью устройства для электролитического восстановления воды TI-8000 от Nihon Trim Co., Ltd. на уровне 4 (5A), для получения электролитически восстановленной воды на катодной стороне.

2-3 Детектирование водородных радикалов

200 мкл исходного раствора ДБНБС добавляют к 125 мл электролитически восстановленной воды и смесь перемешивают, а затем концентрируют/обезвоживают в термостате при 60°C, с помощью роторного испарителя. Концентрированное/обезвоженное вещество растворяют в 1 мл сверхчистой воды (вода Milli Q) и извлекают. Затем концентрированное/обезвоженное вещество выдерживают в термостате с нагревом при 60°C, в течение 1 часа, оставляют стоять на льду в течение 5 минут и центрифугируют при 12000 об/мин, с получением супернатанта. Образец ДБНБС, изготовленный подобным же образом, с помощью указанной выше сверхчистой воды, в качестве контроля, калибруют, и длины волн от 350 до 600 нм для образца ДБНБС сканируют, с получением дифференциального спектра.

Спектр, сходный со спектром поглощения, полученным в примере 1, наблюдается в электролитически восстановленной воде (фиг.1: электролитически восстановленная вода), и это подтверждает, что водородные радикалы присутствуют в электролитически восстановленной воде.

Пример 3: Взаимосвязь между концентрацией электролитически восстановленной воды и значением степени взаимодействия водородных радикалов и взаимосвязь между ионной силой и значением степени взаимодействия водородных радикалов.

Исследуют, существует ли корреляция между концентрацией электролитически восстановленной воды и количеством водородных радикалов или нет. Электролитически восстановленную воду разбавляют сверхчистой водой (вода Milli Q) для измерения значений степени взаимодействия водородных радикалов соответствующих образцов. Для исследования взаимосвязи между ионной силой и значениями степени взаимодействия водородных радикалов изготавливают образцы воды, имеющие значения концентрации NaCl от 0,0001% до 0,01%, для измерения взаимодействия активного водорода в образцах воды, полученных путем электролитического восстановления соответствующих образцов. Образцы воды электролитически восстанавливают с помощью устройства для электролитического восстановления воды TI-8000 от Nihon Trim Co., Ltd., на уровне 4 (5A), для получения восстановления образцов воды на катодной стороне.

Когда образцы воды, содержащие 25, 50, 75 и 100 объемных % образцов электролитически восстановленной воды, изготавливают путем разбавления для измерения значений степени взаимодействия водородных радикалов, значения степени взаимодействия водородных радикалов увеличиваются вместе с концентрацией электролитически восстановленной воды, как показано на фиг.3, и, следовательно, как выяснено, эта система измерений также обладает возможностью количественного определения и в образцах электролитически восстановленной воды. В электролитически восстановленной воде, полученной путем изменения концентрации соли (концентрации NaCl) в водном растворе для создания водного раствора, имеющего различную ионную силу, при получении электролитически восстановленной воды путем электролиза, значение степени взаимодействия водородных радикалов также увеличивается вместе с ионной силой (концентрация NaCl), как показано на фиг.4. Это указывает на то, что большое количество водородных радикалов образуется также, когда увеличивается ионная сила.

Пример 4: Анализ процесса взаимодействия водородных радикалов и ДБНБС

4-1 Образец

Используют ДБНБС от Labo Tech Co., Ltd., порошок платиновой черни типа M от Ishifuku Kinzoku Kogyo Kabushiki Kaisha и газообразный водород от Taiyo Sanso Kabushiki Kaisha, соответственно.

4-2 Взаимодействие ДБНБС

Образец, изготовленный путем продувки газообразного водорода через 20 мл раствора ДБНБС, 2,5 мг/мл, содержащего 0,01 мг/мл платиновой черни, при скорости продувки 45 мл/мин, в течение 1 часа, без тепловой обработки, и образец, подвергнутый тепловой обработке при 60°C в течение 1 часа и охлажденный льдом, для прекращения реакции, используют в качестве аналитических образцов.

4-3 Подготовка аналитического образца

(1) аналитический образец для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Аналитические образцы фильтруют через фильтры 0,45 мкм, соответственно, и используют их порции объемом 2000 мкл.

(2) Аналитический образец для анализа с помощью ЯМР и TOF-MASS спектрометрии

Не подвергавшееся нагреву реакционное промежуточное вещество, выделенное с помощью ВЭЖХ, ацетилируют с помощью уксусного ангидрида (от Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и стабилизируют, в то время как азосоединение, выделенное с помощью тепловой обработки, опять выделяют с помощью ВЭЖХ для завершения степени разделения.

(3) Аналитический образец для анализа следов элементов

Используют не подвергавшееся нагреву реакционное промежуточное вещество, выделенное с помощью ВЭЖХ, и азосоединение, выделенное с помощью тепловой обработки, изготавливают подобно тому, как при анализе с помощью ЯМР и TOF-MASS спектрометрии.

4-4 Условия и устройства для измерений

(1) Используют ВЭЖХ от Waters6OOE от Waters, с подвижной фазой из Milli-Q Water, при скорости потока 5 мл/мин, с помощью количества вводимого образца 2000 мкл, отбираемого с помощью автоматического самплера Waters717, при этом, используя колонку Nova-Pak C18, 19 на 300 мм, от Waters. Детектор на основе фотодиодной матрицы Waters996, от Waters, используют в качестве детектора для получения данных в диапазоне длин волн от 200 до 600 нм, с интервалами 1,2 нм. Спектральную хроматограмму анализируют с помощью персонального компьютера Compaq V700, используя программу, созданную Millennium 32 (Waters).

(2) Используют анализатор TOF-MASS Voyager (полученный от Applied Biosystems Japan Ltd.). Voyager представляет собой времяпролетный масс-спектрометр с лазерной ионизацией, имеющий ускоряющее напряжение 20 кВ. Ускоряющее напряжение устанавливается до значения 20 кВ, для осуществления анализа в линейном режиме пролета. Матрицу изготавливают путем растворения 1,3 мг 2-(4-гидрокси-фенилазо)бензойной кислоты (HABA) (от Aldrich Chemical Co., Ltd.) в 1 мл смеси вода-ацетонитрил 50:50. Предметное стекло для образца покрывают 0,5 мкл образца и сушат в естественных условиях, с последующим добавлением такого же количества матричного раствора, при этом образец опять сушат в естественных условиях и вводят в источник ионов.

(3) ЯМР (спектрометр ЯМР JEOL JNM-GSX400 system) с частотой 400 МГц используют для осуществления измерений ¹H-ЯМР. Диметилсульфоксид (ДМСО) (от Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и оксид дейтерия (D₂O) (от Aldrich Chemical Co., Ltd.) используются в качестве растворителей.

4-5 Аналитический результат

(A) Результат измерения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

(i) Аналитический образец (1)

газообразный водород продувают через 20 мл раствора ДБНБС, 2,5 мг/мл, содержащего 0,01 мг/мл платины, со скоростью продувки 45 мл/мин, и этот раствор фильтруют через фильтр 0,45 мкм, так что 2000 мкл этого не подвергавшегося нагреву образца измеряют с помощью ВЭЖХ, снабженной детектором на основе фотодиодной матрицы. Фиг.5 демонстрирует результат измерений. Пик не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС, наблюдаемый при времени удерживания около 9,0 минут, на фиг.5, демонстрирует пик поглощения при 220 нм, при этом не демонстрируя поглощения при 450 нм, как можно понять из спектра поглощения в ультрафиолетовом и видимом свете, изображенного на фиг.6. Согласно оценкам, это соответствует димеру, описываемому формулой C.

(ii) Аналитический образец (2)

Газообразный водород продувают через 20 мл раствора ДБНБС, 2,5 мг/мл, содержащего 0,01 мг/мл платины, со скоростью продувки 45 мл/мин, и раствор подвергают тепловой обработке при 60°C в течение 1 часа, охлаждают с помощью льда для прекращения реакции и фильтруют через фильтр 0,45 мкм, так что 200 мкл этого подвергавшегося нагреву образца измеряют с помощью ВЭЖХ, снабженной детектором на основе фотодиодной матрицы. Фиг.7 демонстрирует результат измерения. Что касается пика реагента ДБНБС, подвергавшегося нагреву, наблюдаемого при времени удерживания 8,5 минут, на фиг.7, пики поглощения наблюдаются при 320 нм и 450 нм, демонстрируя спектр поглощения в ультрафиолетовой области, сходный с известным азобензолом, как можно понять из спектра поглощения в ультрафиолетовом и видимом свете, изображенного на фиг.8. Это соответствует азосоединению ДБНБС, описываемому формулой E.

(B) Результат измерения масс-спектров (MALDI-TOF-MS)

(i) Аналитический образец (1)

Не подвергавшийся нагреву реагент ДБНБС, имеющий поглощение при 280 нм, полученный в указанном выше измерении с помощью ВЭЖХ, измеряется с помощью масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS).

Масс-спектр ацетилированного не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС, имеющего поглощение при 280 нм, демонстрирует ионный пик при m/z 675,449, как показано на фиг.9, и это совпадает с таким веществом, что одна молекула Br и одна молекула Na десорбируются из промежуточного соединения (формула C), и одна гидроксильная группа промежуточного соединения формулы C является ацетилированной.

(ii) Аналитический образец (2)

Подвергавшийся нагреву реагент ДБНБС, имеющий поглощение при 450 нм, полученный в указанном выше измерении с помощью ВЭЖХ, измеряется с помощью масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS).

Масс-спектр подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС, имеющего поглощение при 450 нм, демонстрирует ионный пик при m/z 656,329, как показано на фиг.10, и это соответствует азосоединению ДБНБС (формула E), из которого десорбируются две молекулы Na.

(C) Результат измерений ЯМР

(i) Аналитический образец (1)

Фиг.11 демонстрирует результат, полученный путем измерения реагента ДБНБС, не подвергавшегося нагреву, имеющего поглощение при 280 нм, полученного в указанном выше измерении с помощью ВЭЖХ, с помощью ¹H-ЯМР. Фиг.11 демонстрирует спектр ацетилированного не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС, имеющего поглощение при 280 нм. Измеряется контроль, изготовленный путем сбора уксусного ангидрида, используемого для ацетилирования, путем выделения с помощью ВЭЖХ. В то время как метильные группы контроля уксусного ангидрида демонстрируют сигнал при 2,5 м.д., присутствие метильных групп, демонстрируемое по химическому сдвигу 2,0 м.д., указывает на то, что гидроксильные группы не подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС и уксусный ангидрид вызывают непосредственное взаимодействие.

(ii) Аналитический образец (2)

Фиг.12 демонстрирует результат, полученный путем измерения подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС, имеющего поглощение при 450 нм, полученного в указанном выше измерении с помощью ВЭЖХ, с помощью ¹H-ЯМР. В то время как ДБНБС демонстрирует синглетный сигнал при 8,0 м.д., протон и химические сдвиги подвергавшегося нагреву реагента ДБНБС, имеющего поглощение при 450 нм, находятся в пределах от 6,6 до 6,8 м.д., а сигналы при 6,7575 м.д. и 6,634 м.д. дополнительно расщепляются на правый и левый синглетный симметричные сигналы. Это указывает на то, что протоны в мета-положениях становятся асимметричными, и имеет место связывание между протонами как следствие образования азогрупп.

(D) Результат элементного анализа

(i) Аналитический образец (1)

Не подвергавшийся нагреву реагент ДБНБС, имеющий пик поглощения при 220 нм, полученный в указанном выше измерении с помощью ВЭЖХ, подвергается следовому элементному анализу. Содержание углерода составляет 19,93% (рассчитанное значение: 19,35%), содержание водорода составляет 1,61% (рассчитанное значение: 1,61%), и содержание азота составляет 3,76% (рассчитанное значение: 3,76%). Это совпадает с таким веществом, у которого две молекулы Na десорбируются из тригидрата промежуточного соединения.

(ii) Аналитический образец (2)

Подвергавшийся нагреву реагент ДБНБС, имеющий поглощение при 450 нм, полученный в указанном выше измерении с помощью ВЭЖХ, подвергается следовому элементному анализу.

Содержание углерода составляет 21,53% (рассчитанное значение: 21,43%), содержание водорода составляет 1,73% (рассчитанное значение: 1,79%), и содержание азота составляет 3,84% (рассчитанное значение: 4,17%). Это совпадает с таким веществом, что одна молекула Br и одна молекула Na десорбируются из тетрагидрата азосоединения ДБНБС.

Пример 5: Количественный анализ водородных радикалов

5-1 Создание калибровочной кривой A (взаимосвязь между 1,1-дифенил-2-пикрилгидразилом (ДФПГ) и временем продувки газообразного водорода)

1 мл раствора этанола и 0,5 мM ДФПГ, и 0,05 мл 1,0 мг/мл буферного раствора платиновой черни-уксусной кислоты добавляют к 1,96 мл 0,1 M буферного раствора уксусной кислоты (pH 5,5), так что общая масса составляет 5 мл, и газообразный водород продувают через смесь со скоростью 45 мл/мин, для сбора образцов по 200 мкл через постоянные временные интервалы и измерения коэффициента поглощения при 517 нм, указывающего на специфическое поглощение ДФПГ, при этом получая график (калибровочная кривая A) на фиг.13, изображающий взаимосвязь между уменьшением коэффициента поглощения и временем продувки.

5-2 Создание калибровочной кривой B

От 0 до 100 мкM цистеина и ДФПГ взаимодействуют друг с другом для получения графика корреляции между уменьшением коэффициента поглощения ДФПГ вблизи 517 нм и концентрацией цистеина. Фиг.14 демонстрирует график калибровочной кривой B.

5-3 Создание калибровочной кривой C (взаимосвязь между поглощением натриевой соли азосоединения (азосоединения ДБНБС) 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты и концентрацией водородных радикалов)

Газообразный водород продувают через 5 мл раствора ДБНБС, 2,5 мг/мл, содержащего 0,01 мг/мл платины, со скоростью 45 мл/мин, для сбора образцов по 200 мкл, через постоянные временные интервалы, при взаимодействии друг с другом ДБНБС и водородных радикалов, нагрева образца при 60°C в течение 1 часа, а затем измерения коэффициента поглощения при 450 нм, указывающего на специфическое поглощение азосоединения ДБНБС, то есть продукта взаимодействия ДБНБС и водородных радикалов, при этом создается калибровочная кривая C, изображенная на фиг.15.

5-4 Измерение концентрации водородных радикалов в образце

(1) Изготовление образца

Электролитически восстановленная вода изготавливается со значением pH 7,0 для изготовления образцов уровней 1-4 в соответствии с условиями изготовления для них. Электролитически восстановленная вода получается в катодной камере путем введения водных растворов, содержащих NaOH, в указанную катодную камеру и анодную камеру, отделенные друг от друга соответствующей диафрагмой, подвода энергии к катоду и аноду и электролиза указанных водных растворов NaOH. Таблица 1 демонстрирует потенциалы окисления-восстановления (ORP) и значения pH этих образцов. Сверхчистая вода (вода Milli Q) используется в качестве контрольного образца.

200 мкл маточного раствора ДБНБС (12,5 мг/мл) добавляют к каждым 125 мл воды Milli Q и к образцам электролитически восстановленной воды уровней 1-4, и смесь концентрируют в вакууме в 125 раз. После концентрирования внутренние стенки колбы Кьельдаля (Kjeldahl) промывают с помощью 1 мл воды Milli Q, и раствор на некоторое время оставляют в покое и потом извлекают. Извлеченный раствор нагревают на горячей водяной бане (с решеткой) при 60°C, а затем охлаждают во льду для остановки реакции. Раствор центрифугируют со скоростью вращения 12000 об/мин в течение 5 минут для сбора супернатанта.

(2) Измерение коэффициента поглощения

Значения коэффициента поглощения указанных выше образцов измеряют при частоте 450 нм. Измерение производится на трех образцах для каждого уровня, для получения средней величины измеренных значений. Таблица 1 демонстрирует результаты измерения коэффициента поглощения. В результате анализа с помощью ВЭЖХ обнаружено по положениям элюируемых пиков и по спектрам поглощения ультрафиолетового и видимого света, что каждое окрашенное вещество, получаемое в результате взаимодействия между электролитически восстановленной водой и ДБНБС, является идентичным с азосоединением ДБНБС, получаемым путем продувки газообразного водорода в присутствии платиновой черни.

(3) Измерение концентрации водородных радикалов

Средний коэффициент поглощения 0,0358 для водных растворов ДБНБС в Milli Q, используемых в качестве контроля, полученный при 450 нм, вычитается из поглощения образца каждого уровня, для получения концентрации водородных радикалов по значению разности коэффициентов поглощения, с помощью калибровочной кривой (C). Значения концентрации водородных радикалов электролитически восстановленной воды, сконцентрированной в 125 раз, находятся в пределах от 7 до 34 мкM (мкмоль/л), для уровней 1-4.

Таблица 1 Milli Q Уровень 1 Уровень 2 Уровень 3 Уровень 4 pH -8,529,279,8410Потенциал окисления - восстановления ORP(мВ) -563841Коэффициент поглощения (средний) (450 нм) 0,03580,09270,10370,09750,1462Разность коэффициентов поглощения (по сравнению с Milli Q)  0,0569 0,0679 0,0617 0,1104 (Раствор, сконцентрированный в 125 раз) концентрация водородных радикалов (мкM)  1711834

Воплощение и примеры, описанные здесь, по всем пунктам должны рассматриваться в качестве иллюстративных, а не ограничивающих. Объем настоящего изобретения демонстрируется не с помощью приведенного выше описания, но с помощью объема формулы изобретения, и предполагается, что все модификации в пределах значений и диапазонов, эквивалентных объему формулы изобретения, являются включенными.

Промышленное применение

Когда используется указанный выше способ детектирования водородных радикалов и указанный выше способ количественного анализа, может детектироваться присутствие малого количества водородных радикалов в воде или в водном растворе, а также может правильно измеряться их концентрация. В частности, концентрация водородных радикалов в электролитически восстановленной воде может быть определена просто и правильно путем использования этого способа анализа. Следовательно, этот способ анализа может быть применен для применений различных типов продуктов в области медицины, в области пищевых продуктов, в области напитков и тому подобное, и электролитически восстановленная вода может быть изготовлена с помощью подбора концентрации водородных радикалов (активного водорода) в соответствии с применениями.

Способ также может быть использован для оценки рабочих характеристик сплава для хранения водорода.

Группа изобретений направлена на детектирование и количественное определение водородных радикалов, присутствующих в воде или в водном растворе, и характеризуется добавлением натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) к образцу для детектирования водородных радикалов по окрашиванию, возникающему в результате их характеристик поглощения, и дополнительно характеризующийся продувкой газообразного водорода через раствор 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ), имеющего поглощение вблизи 517 нм, и раствор натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) с постоянной скоростью, в присутствии платиновой черни для количественного анализа концентрации водородных радикалов по калибровочной кривой C графика корреляции между коэффициентом поглощения вблизи 450 нм, полученным для азосоединения ДБНБС, и концентрацией образующихся водородных радикалов. Достигается повышение точности и возможность анализа водородных радикалов в различных средах. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 15 ил.

1. Способ детектирования водородных радикалов, присутствующих в воде или в водном растворе, путем добавления натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) к образцу для детектирования водородных радикалов по окрашиванию указанного образца.2. Способ детектирования водородных радикалов по п. 1, в котором вода или водный раствор представляет собой электролитически восстановленную воду.3. Способ детектирования водородных радикалов по п. 1, в котором окрашивание возникает из-за пика поглощения азосоединения ДБНБС, образующегося при взаимодействии между натриевой солью 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) и водородными радикалами.4. Способ детектирования водородных радикалов по п. 3, в котором детектирующий пик поглощения азосоединения ДБНБС имеет место при длине волны от 425 до 450 нм.5. способ количественного анализа водородных радикалов, присутствующих в воде или в водном растворе, состоящий из следующих стадий (1)-(4):

(1) продувки газообразного водорода через раствор 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ), имеющий поглощение вблизи 517 нм, с постоянной скоростью в присутствии платиновой черни для получения графика корреляции между уменьшением коэффициента поглощения вблизи 517 нм и временем продувки газообразного водорода (создание калибровочной кривой A);

(2) взаимодействия цистеина и ДФПГ друг с другом для получения графика корреляции между уменьшением коэффициента поглощения ДФПГ вблизи 517 нм и концентрацией цистеина (создание калибровочной кривой B);

(3) продувки газообразного водорода через раствор натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) с постоянной скоростью в присутствии платиновой черни в течение заданного времени при таких же условиях, как в указанной стадии (1), и после этого измерения коэффициента поглощения вблизи 450 нм для получения графика корреляции между значением коэффициента поглощения и концентрацией водородных радикалов, образовавшихся в течение времени продувки газообразного водорода, вычисленной по калибровочной кривой A и калибровочной кривой B (создание калибровочной кривой C); и

(4) добавления натриевой соли 3,5-дибром-4-нитрозобензолсульфоновой кислоты (ДБНБС) к образцу с образованием азосоединения ДБНБС и измерения коэффициента поглощения азосоединения вблизи 450 нм для получения значения концентрации водородных радикалов по значению указанного коэффициента поглощения с помощью указанной калибровочной кривой C.