ТИПЫ ВОСКОВИДНОГО ПШЕНИЧНОГО КРАХМАЛА, СОДЕРЖАЩИЕ В ГРАНУЛЕ ВОСКОВИДНЫЕ БЕЛКИ Российский патент 2005 года по МПК A01H1/06 A01H5/00 

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В широком смысле, настоящее изобретение относится к мутантным крахмальным генам в полиплоидных зернах злаков (здесь и далее термин “крахмальный” употребляется для удобства изложения и означает применительно к генам, аллелям и т.п. - “участвующий в синтезе крахмала”). Более конкретно, настоящее изобретение относится к мутантным растениям пшеницы, мутантным зернам пшеницы и вырабатываемому ими крахмалу.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Зерно злаков, таких как рис, пшеница, кукуруза и ячмень, является частью питания населения Земли. Это зерно составляет значительную долю продуктов потребления населения Земли. Это зерно перерабатывают, получая хлеб, хлебобулочные изделия, макаронные изделия, муку и т.п. Переработанное зерно обладает различными характеристиками, вследствие чего его используют при изготовлении различных продуктов. Зерно пшеницы перерабатывают в пшеничную муку, которая является кладовой питательных веществ. Крахмал, белок, липиды, ферменты и питательные вещества влияют на продукцию, изготовленную из пшеничной муки, в разной степени. Крахмал, содержащийся в продукции, изготовленной из пшеничной муки, сильно влияет на ее свойства. Перевариваемость, температура обработки, кулинарные свойства муки сильно зависят от типа используемого крахмала.

Крахмал состоит из двух компонентов - амилозы и амилопектина. В зернах ряда диплоидных злаков, обладающих крахмальными мутациями, меняется хотя бы один из этих компонентов. Одна из крахмальных мутаций называется восковидной мутацией. В зернах злаков с восковидной мутацией вырабатывается крахмал с низким содержанием амилозы. Хорошо известны природные восковидные мутанты риса и кукурузы, оба вида являются диплоидными. Однако для полиплоидных видов природные крахмальные мутанты неизвестны. Для изменения крахмала в полиплоидных видах необходимо несколько независимых мутаций. У пшеницы природные мутанты редки, поскольку и мягкая, и стекловидная пшеница является гексаплоидной, а твердая - тетраплоидной. Никто не обнаружил природной восковидной пшеницы.

У пшеницы (Triticum aestivum L.) имеется три набора хромосом, происходящих от трех разных видов. Каждый набор хромосом обладает геномами, обозначаемыми буквами А, В и D. Восковидный мутант пшеницы должен содержать гомозиготные восковидные аллели в каждой из хромосом А, В и D. Мутации пшеницы были идентифицированы путем исследования характеристик индивидуальных геномов А, В и D. До 1992 г. в этих исследованиях характеристик белков обнаруживали только одну зону восковидного белка. Такой тест не позволял различить зоны белка для каждого из этих трех геномов. Если один из этих трех геномов не производил белок, такое исследование не могло его обнаружить. С помощью модифицированной регистрирующей системы, использующей электрофорез в полиамидном геле с применением додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) при низкой концентрации бисфосфоглицератакриламида и двумерный электрофорез в геле (2-D PAGE), обнаружили две из трех ожидаемых белковых зон. Третью зону обнаружили с помощью изоэлектронной фокусировки для первого измерения и модифицированного SDS-PAGE для второго. Модифицированная регистрирующая система идентифицировала три белковые зоны. Каждая белковая зона соответствовала одному из наборов хромосом А, В и D. Путем идентификации отдельных белков можно провести скрининг линий пшеницы на присутствие нулевых восковидных аллелей. Нулевой аллель не кодирует специфический белок на этом аллеле с помощью данной хромосомы. Нулевой мутант не производит конкретный белок с помощью каких-либо хромосом. Это отличает его от ненулевого мутанта, который производит этот белок, но в инактивированном состоянии.

После разработки теста, идентифицирующего три полосы, множество исследователей начало выполнять скрининг восковидной пшеницы на нулевые аллели. Если в пшеничном крахмале отсутствовали отдельные крахмальные белки, обнаруживались единичные нулевые аллели. Единичные нулевые восковидные аллели пшеницы были обнаружены в зародышевой плазме примерно лишь 10% проростков американской озимой пшеницы. Остальная пшеница относилась к диким видам, содержащим три функциональных восковидных локуса. R.A.Graybosch описал несколько единичных нулевых восковидных аллелей в геномах А и В. Известно, что в геноме D имеются лишь два единичных нулевых аллеля. Об одном единичном нулевом аллеле в геноме D сообщили японские исследователи и об одном - канадские.

Недавно исследователи обнаружили в пшенице четыре отдельных двойных нулевых восковидных аллеля. Все эти двойные нулевые восковидные аллели (частичные мутанты) были нулевыми для восковидных аллелей геномов А и В. Японские исследователи описали линии Kanto 79, 107, Sakai 173, а R.A.Graybosch - IKE. IKE представляет собой применяемую в промышленном масштабе линию, выведенную в рамках селекционной программы университета штата Канзас. Эти частичные двойные нулевые восковидные мутанты являются единственными известными. Однако можно ожидать, что с помощью модифицированной методики скрининга исследователи обнаружат дополнительные единичные и двойные нулевые аллели. Аналогично единичным восковидным нулевым мутантам, эти вновь открытые двойные нулевые частичные восковидные мутанты все же производят восковидный белок в D аллеле и, вследствие этого, все же обладают значительным содержанием амилозы. Однако содержание амилозы в этих двойных нулевых частичных восковидных мутантах существенно ниже, чем в единичных нулевых восковидных мутантах.

Даже после открытия двойных нулевых мутантов все же имелась потребность в восковидных мутантных пшеницах, которые обладали бы восковидными мутациями во всех трех геномах. В 1994 г. была получена восковидная мутантная пшеница, не содержащая восковидного белка. Культурный китайский сорт Bai Huo, не содержащий восковидного белка, был скрещен с Kanto 107 и Sakai 173. 14 из 720 семян F2 не содержали восковидных белков.

Обычное скрещивание частичных нулевых мутантов с единичным нулевым аллелем приводит к восковидной пшенице. Это также приводит к совершенно новой комбинации генов с хромосомами полученной восковидной пшеницы. Для получения пригодных линий из полученной восковидной пшеницы использовали скрещивание. Восковидную пшеницу оплодотворяли самоопылением и в процессе скрещивания потомство отбирали по агрономическим признакам и восковидности. Хотя полученные обычным скрещиванием растения с восковидными мутациями легко обнаружить с помощью йодного теста, выявить агрономические признаки намного труднее. Агрономические признаки часто являются мультигенетическими и для пшеницы они дополнительно усложнены тремя отдельными наборами хромосом. Восстановление этих трех хромосом с помощью обычного скрещивания или даже с помощью дигаплоидии требует времени и проведения целого ряда скрещиваний. Даже после проведения целого ряда скрещиваний восковидная пшеница не полностью идентична родительской, она лишь сходна с родительской.

Растение, которое практически идентично родительскому растению, является изогенной линией. Изогенная линия характеризуется практически идентичными генами. Формирование восковидной пшеницы, которая изогенна своим родителям, не приводит к трудностям, возникающим при обычном скрещивании. Необходим способ получения восковидной пшеницы, который не приводит к совершенно новой комбинации генов в хромосомах восковой пшеницы. Необходим эффективный способ получения полных мутантов из мутантов с двойными хромосомами или мутантов с двойными хромосомами из мутантов с одинарными хромосомами полиплоидных злаковых культур. Другими словами, необходим способ получения изогенных полиплоидных линий, несущих мутации.

Чтобы довести изогенные крахмальные мутации до промышленного масштаба, нужны дополнительные усилия. Селекционеры будут проводить скрещивание с использованием этой изогенной зародышевой плазмы для включения крахмальных мутаций в другую зародышевую плазму. Для обеспечения чистоты линии зародышевой плазмы необходим способ идентификации мутаций. Если мутация идентифицирована, то можно идентифицировать неправильное применение зародышевой плазмы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения полиплоидных изогенных семян и растений, которые отличаются от родительских тем, что являются крахмальными мутантами.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение изогенных семян и растений пшеницы, которые производят восковидный крахмал.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ идентификации изогенных линий путем получения обзорных пептидных карт модифицированного крахмала, производимого этими линиями.

Еще одной целью настоящего изобретения является способ получения восковидного пшеничного крахмала, который содержит инактивированный белок хотя бы в одном восковидном локусе.

Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является способ осуществления мутаций полиплоидных злаков с целью получения модифицированного крахмала.

В широком смысле настоящее изобретение включает способ получения семян полиплоидного злака с полностью мутантными аллелями. Этот способ включает следующие стадии. Обработку двойного мутантного аллеля в полиплоидном растительном материале с помощью мутагена. Это приводит к обработанному растительному материалу. Обработанный растительный материал затем подвергают скринингу для идентификации растительного материала с полностью мутантным аллелем. Затем отбирают растительный материал с полностью мутантным аллелем. Способ, соответствующий настоящему изобретению, также включает дополнительные стадии отбора полиплоидного растительного материала, обладающего единичным мутантным аллелем, и обработку этого растительного материала мутагеном с последующим скринингом растительного материала для идентификации растительного материала, содержащего двойной мутантный аллель. Это растительный материал затем используют с применением описанного ранее способа для получения полностью мутантного аллеля. Можно использовать целый ряд мутагенов, однако предпочтительно в качестве мутагена использовать этилметилсульфонат (ЭМС), поскольку он вызывает точечные мутации. Этот способ можно применять к растительному материалу, такому как семена пшеницы. В этом способе двойной мутантный аллель может представлять собой двойной нулевой аллель или двойной нулевой аллель может представлять собой двойной нулевой восковидный аллель. Скрининг может включать тест на непрозрачность. Стадия скрининга также может включать тестирование на крахмал с помощью йода. При тестировании йодом полностью мутантный аллель окрашивается в красный цвет.

Настоящее изобретение также относится и к продукту. Им является полиплоидный растительный материал, не содержащий белков или содержащий инактивированный белок, кодируемый с помощью одного аллеля всех наборов хромосом, и хотя бы один аллель, содержащий точечную мутацию, возникшую вследствие воздействия мутагенов. Этот растительный материал также включает хотя бы один аллель в одном наборе хромосом, который вследствие указанной точечной мутации кодирует инактивированный белок.

Полиплоидный растительный материал, соответствующий настоящему изобретению, включает изогенный полиплоидный растительный материал, который содержит не менее одного мутагена, вызывающего точечную мутацию специфического аллеля хотя бы в одном наборе хромосом, и не менее одной спонтанно возникающей мутации в том же специфическом аллеле в другом наборе хромосом. Кроме того, настоящее изобретение включает производимый ими крахмал. К целям настоящего изобретения относится и потомство этого растительного материала.

Более конкретно, к настоящему изобретению относятся двойные нулевые мутантные аллели в полиплоидном растительном материале, которые с помощью мутагенов преобразуются в полные мутантные аллели. Настоящее изобретение, в частности, включает мутантный растительный материал восковидный-60 и образующийся в нем крахмал. Этот мутант восковидный-60 можно получить из целого ряда частичных восковидных мутантов. Именно, его можно получить из IKE. Настоящее изобретение включает изогенные линии к родительской линии пшеницы, которые содержат полный мутантный восковидный аллель. В частности, настоящее изобретение включает изогенные линии к IKE, линии Kanto 79 и 107, Sakai 173 и Bia Huo, которые содержат полный мутантный восковидный аллель и образующийся в нем крахмал. Настоящее изобретение также включает изогенную пшеницу с полным мутантных крахмальным аллелем и хотя бы один специфический белок.

Настоящее изобретение также включает способ идентификации происхождения полиплоидного материала посредством выделения специфических крахмальных белков. Кроме того, настоящее изобретение включает способ идентификации специфического белка в крахмале восковидной пшеницы.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Единичный нулевой аллель* - белок не образуется с помощью одного аллеля в одном наборе хромосом.

Двойной нулевой аллель* - белок не образуется с помощью одного аллеля в двух наборах хромосом.

Полный нулевой аллель* - белок не образуется с помощью одного аллеля во всех наборах хромосом.

Единичный инактивированный аллель* - инактивированный белок образуется с помощью одного аллеля в одном наборе хромосом.

Двойной инактивированный аллель* - инактивированный белок образуется с помощью одного аллеля в двух наборах хромосом.

Полный инактивированный аллель* - инактивированный белок образуется с помощью одного аллеля во всех наборах хромосом.

Единичный мутантный аллель* - белок не образуется с помощью одного аллеля в одном наборе хромосом или инактивированный белок образуется с помощью одного аллеля в одном наборе хромосом.

Двойной мутантный аллель* - белок не образуется с помощью одного аллеля в двух наборах хромосом или инактивированный белок образуется с помощью одного аллеля в двух наборах хромосом.

Полный мутантный аллель* - белок не образуется с помощью одного аллеля во всех наборах хромосом или инактивированный белок образуется с помощью одного аллеля во всех наборах хромосом.

Частичный восковидный мутант - не содержит восковидные белки или инактивированные восковидные белки, образовавшиеся с помощью одного аллеля в двух наборах хромосом.

Мутант восковидный-60 - не содержит или восковидные белки, или инактивированный восковидный белок, образовавшиеся с помощью одного аллеля во всех наборах хромосом, но включает хотя бы один аллель в одном наборе хромосом, с помощью которого образуется инактивированный восковидный белок.

Новый полный мутант - не содержит или белки, или инактивированный белок, образовавшийся с помощью одного аллеля во всех наборах хромосом, но включает хотя бы один аллель в одном наборе хромосом, с помощью которого образуется инактивированный белок.

* Можно добавить идентифицирующие термины, такие как крахмальный, восковидный, ае, матовый, сахаристый-2 и др.

В широком смысле настоящее изобретение относится к получению мутированных крахмальных растений с помощью мутагенеза зерен полиплоидных злаков. Такие новые крахмальные мутантные растения получаются более эффективно, чем крахмальные мутантные растения, получаемые с помощью обычного скрещивания или даже скрещивания с использованием биотехнологических способов. Мутантные растения, соответствующие настоящему изобретению, изменяют крахмал. Одним из типов измененного крахмала является восковидный крахмал. Настоящее изобретение, в частности, включает получение восковидных полиплоидных растений. Более конкретно, настоящее изобретение включает восковидную пшеницу. Более конкретно, мутантное полиплоидное зерно восковидный-60.

Восковидная пшеница, соответствующая настоящему изобретению, получается из пшеницы с двойным нулевым восковидным аллелем, подвергнутой мутации с помощью этилметансульфоната (ЭМС). Полученный мутант восковидный-60 пшеницы вырабатывает восковидный крахмал, содержащий иммобилизованный белок - синтетазу крахмала с молекулярной массой 60 кДа (он не является нулевым для всех трех восковидных аллелей). Этот белок, дезактивированная иммобилизованная синтетаза крахмала с молекулярной массой 60 кДа, и определяет настоящее изобретение. Настоящее изобретение можно отличить от имеющейся восковидной пшеницы по наличию в экстрактах крахмала этого инактивированного иммобилизованного белка, синтетазы крахмала с молекулярной массой 60 кДа. Как и все крахмалы восковидной пшеницы, крахмал пшеницы, соответствующей настоящему изобретению, окрашивается йодом в красный цвет. Это красное окрашивание идентифицирует крахмал как восковидный крахмал. В отличие от всех имеющихся в настоящее время восковидных пшеничных крахмалов, крахмал, соответствующий настоящему изобретению, обладает зоной восковидного белка с молекулярной массой 60 кДа, которая проявляется при экстракции белков крахмала и их разделении с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия. Этот специфический белок, соответствующий настоящему изобретению, также можно идентифицировать путем использования антител, специфических по отношению к восковидному белку.

В редких случая мутации, осуществляемые с помощью ЭМС, могут воспрепятствовать образованию в крахмале указанного белка с молекулярной массой 60 кДа. Такое редкое растение должно быть тройным нулевым по восковидному аллелю без специфического белка. Растение с тройным нулевым восковидным аллелем и растение с инактивированным белком с молекулярной массой 60 кДа в двойном нулевом восковидном аллеле производят восковидные крахмалы, которые являются одинаковыми за тем исключением, что в крахмале, производимом последним растением, имеется белок с молекулярной массой 60 кДа. Хотя в этом редком случае восковидный крахмал представляется таким же, что и крахмал, предложенный в предшествующих исследованиях, все же растения должны сильно различаться. Изогенные растения - это растения, которые обладают практически одинаковыми генами. Растения, соответствующие настоящему изобретению, являются изогенными, и растения, полученные скрещиванием и гаплоидией, содержат смесь генов из двух источников. Термин “растение” обозначает все растение, включая клетки, листья, корни, меристемы, стебли, цветки, семена и пыльцу.

Изогенная линия, соответствующая настоящему изобретению, после получения может быть подвергнута скрещиванию с помощью традиционных способов скрещивания с целью перемещения мутантных аллелей в зародышевую плазму другой пшеницы или с целью перемещения различных аллелей в крахмальную мутантную пшеницу. Признак восковидности сохраняется в процессе скрещивания, если обработка йодом вызывает красное окрашивание.

Настоящее изобретение представляет собой способ многократного осуществления мутаций полиплоидных растений для получения изогенных растений с крахмальными мутациями. Выбирается полиплоидное растение, обладающее хотя бы одной крахмальной мутацией в одном наборе хромосом. Это растение подвергают мутации с помощью ЭМС. Этот способ мутагенеза приводит к получению изогенного растения с точечной мутацией. Полученные растения повергают скринингу на нужную точечную мутацию, которая дает нужный крахмал. Если восковидная мутация является нужной мутацией, то проводят скрининг на непрозрачность семян. Дополнительный скрининг этих семян можно осуществить, окрашивая крахмал зерна йодом. Семена, крахмал которых окрашивается в красный цвет, являются восковидными.

Таким образом, в общем случае способ, соответствующий настоящему изобретению, заключается в отборе полиплоидного растения с имеющейся крахмальной мутацией хотя бы в одном наборе хромосом, выполнения мутации отобранного растения и скрининге на мутацию в другом наборе хромосом. Каждая стадия этого способа может немного изменяться. Например, селекцию можно осуществлять с помощью теста выделения белка, такого как модифицированный электрофорез в полиамидном геле с использованием додецилсульфата натрия, или с помощью теста на фенотип. После проведения выбора можно увеличить количество зародышевой плазмы, чтобы материала было достаточно для проведения стадии мутации.

Стадию мутации можно осуществить с помощью целого ряда способов мутагенеза. Эти способы состоят в проведении мутации растительного материала с помощью подходящих мутагенов. Этими мутагенами можно воздействовать на пыльцу, плоды, пыльники, семена и яйцеклетки различных растений. Наиболее предпочтительным способом является обработка мутагенами семян или пыльцы. Мутагены могут быть химическими или физическими. Химические агенты включают следующие вещества (но не ограничиваются только ими): этилметансульфонат, диазореагенеты, N-нитрозо-N-метилглицин, псоралены, а физические средства - ультрафиолетовое излучение, рентгеновское излучение, гамма-излучение; также можно использовать и любые другие средства, оказывающие аналогичное воздействие. Наиболее предпочтительная группа мутагенов включает азиды натрия или нитрозогуанидин, или любой алкилирующий агент, такой как этилметансульфонат (ЭМС). Наиболее предпочтительньм агентом является ЭМС. Способ применения ЭМС описан в работе Neuffer, опубликованной в Maize Genetic Newsletter, 45, стр.146 (1971).

Применение ЭМС приводит к генерации точечной мутации в нуклеотидной последовательности гена. Некоторые другие способы приводят к более значительному разрушению гена, чем точечная мутация. ЭМС оказывает более специфичное мутагенное воздействие и не меняет большую часть генома растения. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением формируются линии, которые являются изогенными по отношению к родительской линии и включают новую точечную мутацию. Точечная мутация представляет собой наследственное генетическое изменение в ДНК растения. Генетическое изменение - это индуцированный мутантный аллель, что означает мутацию в геноме растения, которая была создана в растении или предке растения с помощью мутагенов, а не путем трансформации.

Заключительной стадией является скрининг, предназначенный для идентификации растений, выросших из мутированных семян, которые обладают крахмальной мутацией в дополнительном наборе хромосом. Скрининг может основываться на фенотипных признаках, свойствах компонентов крахмала, характеристиках крахмала и т.п.

Этот общий способ получения изогенных линий из полиплоидных злаков был использован для получения восковидной пшеницы, изогенной с IKE. В этом специфическом случае применении способа выбран IKE, двойной нулевой восковидный аллель (семена А, В двойной нулевой пшеницы). Затем семена IKE высевали и убирали самоопыленные семена. Собранные зерна (или семена) подвергали мутации с помощью ЭМС. Количество обработанных семян было достаточно большим, чтобы вызвать нужное количество событий мутаций. Вероятное число нужных событий мутации является функцией генетических характеристик и полиплоидии. Специалисты могут рассчитать это число. После мутации IKE нужное событие, которое представляет собой точечную мутацию в восковидном аллеле D генома, происходило более чем в одном из 600 растений. Эти растения содержали единичный инактивированный восковидный аллель и двойной нулевой восковидный аллель. Для получения наибольшего числа мутантных растений восковидный-60 (обладающих дополнительной мутацией в восковидном аллеле D генома) 15 фунтов семян IKE подвергали мутации в растворе ЭМС в течение 16 часов, а затем тщательно промывали. Обработанные семена высевали. Семена пшеницы вырастали, оплодотворялись, обрабатывались соответствующими гербицидами и инсектицидами. После созревания семена убирали вручную. Можно использовать механизированную уборку, однако это может привести к менее пригодным семенам. Для проведения скрининга с семян удаляли шелуху. Затем на просмотровом столе с подсветкой выполняли скрининг семян на присутствие нужных признаков крахмала и из небольшого количества семян отбирали приблизительно 60 непрозрачных семян. Затем эти отобранные семена окрашивали йодом. Вдали от зародыша семена разрезали бритвой. Йод наносили на отрезанные куски семян. Если окраска была красной, семена являлись семенами восковидной пшеницы, а если окраска не была красной, семена отбрасывали. Для получения большего количества семян отобранные мутантные семена IKE восковидный-60 высевали.

Эксперимент первый

ПРОВЕДЕНИЕ МУТАЦИИ IKE

Пятнадцать фунтов семян пшеницы IKE замачивали в растворе 77 г жидкого ЭМС в 15,4 л воды. При приготовлении раствора первые 9 литров воды содержали ЭМС. ЭМС оседал на дно емкости. Для равномерного перемешивания в раствор вводили шланг, через который подавали воздух. Затем в раствор прибавляли еще 6,4 л воды. Концентрация раствора ЭМС составляла 77 г/15400 мл = 0,5%. Затем в раствор вносили 15 фунтов семян IKE. Количество ЭМС в расчете на одно семя составляло 77000 мг/24160 = 0,32 мг/семя.

Находящиеся в растворе семена перемешивали струей воздуха в течение 20 часов. Семена извлекали из раствора с помощью сита. Для поглощения находящейся на поверхности семян воды и высушивания семян их перемешивали с крупным песком, тип #97591, изготовленным в Китае.

Не позже, чем через шесть часов после извлечения из воды семена высевали в поле. Скорость прорастания семян была хорошей. Семена возделывали и обрабатывали по стандартной схеме, применяемой для озимой пшеницы, за тем исключением, что после созревания колосья убирали вручную. Ручная уборка предотвращала чрезмерное повреждение колосьев.

Этот эксперимент можно повторить для любой двойной нулевой линии пшеницы. Эта процедура приводит к получению изогенных семян с дополнительной точечной мутацией. Затем изогенные семена подвергали скринингу на наличие точечных мутаций, приводящих к восковидной мутации.

Эксперимент второй

СКРИНИНГ НА ВОСКОВИДНОСТЬ

После обработки, описанной в первом эксперименте, собранную пшеницу подвергали индивидуальному обмолоту. Колосья молотили на молотилке (производства фирмы Almaco, Inc.), в которой использовано стирающее движение, осуществляемое двумя ремнями, движущимися в одном и том же направлении с разньми скоростями. Мякину сдували и одновременно в пакеты для монет собирали зерна.

Семена анализировали на наличие восковидного крахмала путем скрининга на непрозрачность. Прозрачность семян определяли с помощью поляризованного флуоресцентного освещения. С помощью флуоресцентного просмотрового стола и поляризатора визуально исследовали зерна отдельных колосьев. Определяли непрозрачные зерна. Эти непрозрачные зерна отбирали для дальнейших исследований.

Непрозрачные зерна обследовали с помощью методики окрашивания йодом. Отрезали кусочек эндосперма и на него на 10 секунд наносили каплю раствора йодида калия объемом 2 мкл (2 г I₂ и 20 г KI на 1 л H₂O). Под микроскопом с небольшим увеличением изучали изменение окраски этого кусочка эндосперма. Красновато-коричневое окрашивание показывает, что крахмал эндосперма приблизительно на 100% состоит из амилопектина (восковидный), тогда как синее окрашивание показывает, что он не является восковидным. Эти два исследования подтвердили, что в семенах подвергнутой мутагенезу пшеницы имеется восковидный мутант.

Восковидная пшеница, полученная в соответствии с настоящим изобретением, производит восковидный крахмал. В предшествующих исследованиях восковидную пшеницу получали путем обычного скрещивания растений с двойными нулевыми геномами А, В с растениями с нулевыми геномами D. Однако между настоящим изобретением и полученными ранее результатами имеется целый ряд различий. Одно различие заключается в том, что в соответствии с настоящим изобретением редко происходят нулевые мутации. Мутации, соответствующие настоящему изобретению, не являются нулевыми. В предшествующих исследованиях всегда происходили нулевые мутации.

В соответствии с настоящим изобретением образуются изогенные растения и семена. Другими словами, растения и семена, соответствующие настоящему изобретению, практически идентичны своим родителям, но включают указанную точечную мутацию. В отличие от этого, в предшествующих исследованиях изогенное растение не образуется. Растение, полученное в предшествующих исследованиях, сходно с обоими родителями.

В соответствии с настоящим изобретением в растении образуется инактивированный белок. В предшествующих исследованиях этого не происходило. Инактивированный белок, соответствующий настоящему изобретению, является специфическим белком крахмала. Другими словами, изогенное растение, соответствующее настоящему изобретению, можно отличить от растения, полученного в предшествующих исследованиях, по его крахмалу. Идентификация полезна для защиты чистоты линии зародышевой плазмы. Если изогенная линия, соответствующая настоящему изобретению, используется в программе скрещивания для интрогрессии восковидного признака в новую линию, то будет присутствовать специфический белок. Таким образом, можно установить, что источником восковидной мутации является изогенная линия, соответствующая настоящему изобретению. Неправильное применение зародышевой плазмы проростков можно определить по специфическому белку. Специфический белок можно использовать и для более точной идентификации зародышевой плазмы. Аминокислотная последовательность этого белка несет точечную мутацию, отличающую его от аминокислотной последовательности дикого типа. Таким образом, если аминокислотная последовательность в крахмале рассматриваемого растения содержит ту же аминокислоту, что и крахмал мутантного растения, то происхождение растения соответствует настоящему изобретению.

Указанный специфический белок можно использовать для двух основных целей: во-первых, для идентификации происхождения и, во-вторых, для идентификации нужных крахмальных мутаций. Если в соответствии с настоящим изобретением получен изогенный восковидный IKE, то крахмал будет содержать только один инактивированный белок с молекулярной массой 60 кДа. Если известно, что имеется только один белок, то для выделения этого белка можно использовать стандартную методику SDS-PAGE. Если возможно наличие более одного белка, то следует использовать модифицированную методику SDS-PAGE и 2-D PAGE, которая описана в работе МАКОТО YAMAMORY and TOSHIKI NAKAMURA (1994) Production of a Waxy Wheat by Genetically Eliminating Wx Protein. Gamma Field Symposia No. 33, Institute of Radiation Breeding NIAR, MAFF Japan, pages 63-74. (Подробное описание этих предложенных ранее методик приведено в работах KAGAWA, H., HIRANO, H., and KIKUSHI, F. (1988). (oryza sativa L.). Jpn. J. Breed. 38: 327-332, и O’FARRELL, P.H. (1975), High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250: 4007-4021). Если нужные крахмальные мутации определяются с помощью простого визуального теста, то выделение белка, видимо, не является обязательным. Однако целый ряд крахмальных мутаций в полиплоидных зернах визуально не идентифицируется. В случае таких крахмальных мутантов белок семени можно выделить и идентифицировать. Методика выделения белка из гранулы крахмала приведена ниже:

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ИЗ ГРАНУЛЫ КРАХМАЛА

Осторожно гомогенизируйте 12,5 г зерен в 25 мл экстракционного буферного раствора (50 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометанацетата, рН 7,5; 1 ммоль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты; 1 ммоль/л 1,3-дитиотреитола) в смесителе 3 раза по 20 секунд с 1-минутными интервалами между перемешиванием. Держите образцы на льду.

Профильтруйте через ткань mira и центрифугируйте при 6000 оборотов/мин в течение 30 мин.

Отбросьте надосадочную жидкость и соскребите обесцвеченные твердые вещества, покрывающие белую таблетку крахмала.

Ресуспендируйте таблетку в 25 мл буферного раствора и повторно процентрифугируйте. Повторите промывку еще два раза.

Ресуспендируйте промытую таблетку в ацетоне при -20°С, дайте таблетке отстояться при -20°С. Повторите.

Высушите крахмал в токе воздуха. (Храните при -20°С.)

ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКА:

Перемешайте 50 мг крахмала с 1 мл 2% раствора додецилсульфата натрия в колбе Эппендорфа.

Встряхните, центрифугируйте при 18000 оборотов/мин и температуре 4°С в течение 5 мин. Слейте надосадочную жидкость. Повторите дважды.

Прибавьте 1 мл буферного раствора для образца (4 мл дистиллированной воды; 1 мл 0,5 моль/л солянокислого трис(гидроксиметил)аминометана, рН 6,8; 0,8 мл глицерина; 1,6 мл 10% раствора додецилсульфата натрия; 0,4 мл В-меркаптоэтанола; 0,2 мл 0,5% раствора бромфенолового синего).

Кипятите в колбе Эппендорфа в течение 10 мин, закрыв отверстие крышкой.

Охладите, процентрифугируйте при 10000 оборотов/мин в течение 10 мин. Декантируйте надосадочную жидкость в другую колбу Эппендорфа. Кипятите в течение 4 минут. Охладите.

ГЕЛИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАМИДНОМ ГЕЛЕ:

Кювета Mini-Protean II Dual Slab; 3,5 мл 10% акриламидного разделяющего буферного раствора для каждого геля. Сверху налить 4% концентрирующий буферный раствор. На гель подать рабочее напряжение 200 В постоянного тока.

10 х рабочий буферный раствор (250 ммоль/л трис(гидроксиметил)аминометан, 1,92 моль/л глицин, 1% додецилсульфат натрия, рН 8,3).

ИММОБИЛИЗОВАННАЯ СИНТЕТАЗА КРАХМАЛА

1. Приготовление экстракта

a) Концентрация ткани 100 мг/2 мл экстракционного буферного раствора.

b) Обработайте на гомогенизирующем устройстве Polytron при полной скорости в течение 20 секунд при температуре 4°С.

c) Центрифугируйте на роторной центрифуге SM24 при 17500 оборотов/мин и 4°С.

d) Сохраните экстракт для анализа растворимого фермента, ресуспендируйте таблетку в 2 мл экстракционного буферного раствора и обработайте, как это указано выше.

e) Повторите промывку еще два раза и ресуспендируйте в конечном объеме, равном 1 мл.

4. Методика

A) Прибавите в пробирку Эппендорфа 100 мкл буферного раствора (предварительно инкубированного при температуре проведения анализа)

25 мкл гликогена,

50 мкл экстракта.

B) Инкубируйте пробирки в течение 2 минут при требуемой температуре.

C) Начните реакцию путем прибавления 25 мкл аденозин-5’-дифосфат-глюкозы [меченой ¹⁴С].

D) Через 20 минут остановите реакцию путем прибавления

100 мкл 0,25 н. раствора NaOH,

1,0 мл метанола

Е) - Выдержите на льду в течение 5 минут,

- процентрифугируйте в микроцентрифуге на полной скорости в течение 5 минут при 4°С,

- отсосите отбрасываемую надосадочную жидкость,

- 2 раза промойте таблетку, растворяя ее в 300 мкл 0,1 н. раствора NaOH,

- повторно осадите с помощью 1,0 мл метанола.

F) Растворите таблетку в 1 мл 1 М растворе НСl и прокипятите в течение 10 минут.

G) Охладите раствор и поместите 0,9 мл реакционной смеси во флакон и прибавьте 10 мл смеси "Ready Safe".

5. Расчет

0,9 мл (радиоактивная порция) × 2 (коэффициент разбавления) х 1000 мкл (полный объем экстракта) × 1000 мг.

1,0 мл (полный объем) × 50 мкл (объем анализируемого экстракта) × 50 мг (масса ткани) × 20 (минут).

ДРУГИЕ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Частично восковидная пшеница - Описание

Известно несколько видов пшеницы с единичными нулевыми аллелями, и их можно обнаружить путем скрининга крахмалов на восковидные белки, полученные из геномов А, В или D гексаплоидной пшеницы. Такие генотипы с единичными нулевыми аллелями можно превратить в частично восковые типы посредством мутагенеза, осуществляемого с помощью таких же методов, что и описанные в настоящем патенте для генотипов с двойными нулевыми аллелями. Методика проведения мутаций единичного нулевого аллеля с получением двойного нулевого аллеля является такой же за тем исключением, что скрининг конечного продукта проводится по-другому. Эту изогенную линию с одной дополнительной крахмальной мутацией обычно нельзя идентифицировать посредством модифицированного SDS-PAGE. Новая изогенная линия с точечной мутацией образует крахмал, который обладает такими же зонами белков, что и крахмал растений, не обработанных с помощью ЭМС. Для идентификации единичного нулевого аллеля с точечной мутацией в восковидном аллеле другой хромосомы необходим другой тест. Для восковидной крахмальной мутации идентифицирующий тест базируется на уменьшении процентного содержания амилозы в крахмале растений, обработанных с помощью ЭМС и обладающих нужной мутацией. Разумеется, поскольку процесс на основе ЭМС используется для получения частичного мутанта, то частичный мутант можно использовать для получения полного восковидного мутанта. Частичный восковидный мутант подвергается мутагенезу и затем скринингу на просмотровом столе с подсветкой и йодному тесту, как это описано выше.

В соответствии с вышеизложенным можно видеть, что этот многократный способ приведет к получению различных видов пшеницы и низкого содержания амилозы. Такие крахмалы восковидной пшеницы полезны для использования в различных продуктах питания и кормах. Крахмал восковидной пшеницы может заменить восковую кукурузу в различных продуктах питания и кормах, например, для увеличения срока годности различных хлебобулочных изделий и при желировании пирожных.

Хотя приведенное выше описание содержит примеры, они не должны рассматриваться как ограничивающие цели настоящего изобретения. Они представляют собой иллюстрации некоторых предпочтительных в настоящее время способов реализации настоящего изобретения.

Изобретение относится к селекции растений. Растительный материал, содержащий неполный или единичный восковидный мутантный аллель, обрабатывают мутагеном, вызывающим точечную мутацию хотя бы одного восковидного аллеля. Обработка растительного материала мутагеном приводит к выработке в нем инактивированного иммобилизованного белка. В качестве мутагена может быть использован этилметансульфонат. 3 с. и 8 з.п. ф-лы.

1. Способ получения полиплоидного растительного материала с полным мутантным аллелем, производящим восковидный крахмал, включающий отбор растительного материала, содержащего неполный восковидный мутантный аллель, обработку указанного растительного материала мутагеном, вызывающим точечную мутацию хотя бы одного восковидного аллеля, приводящую к выработке инактивированного иммобилизованного белка, и скрининг потомства обработанного растительного материала для идентификации растительного материала с полным мутантным аллелем, производящим восковидный крахмал, содержащий инактивированный иммобилизованный белок.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что неполный восковидный мутантный аллель является двойным нулевым восковидным аллелем.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве мутагена используют этилметансульфонат (ЭМС).4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении скрининга используют тестирование на непрозрачность семян.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при проведении скрининга используют тестирование с помощью йода.6. Способ получения полиплоидного растительного материала с полным мутантным аллелем, производящим восковидный крахмал, включающий отбор растительного материала, содержащего единичный восковидный мутантный аллель, обработку указанного растительного материала мутагеном, вызывающим точечную мутацию хотя бы одного восковидного аллеля, скрининг потомства обработанного растительного материала для идентификации растительного материала с неполным восковидным мутантным аллелем, обработку указанного растительного материала мутагеном, вызывающим точечную мутацию хотя бы одного восковидного аллеля, приводящую к выработке инактивированного иммобилизованного белка, и скрининг потомства обработанного растительного материала для идентификации растительного материала с полным мутантным аллелем, производящим восковидный крахмал, содержащий инактивированный иммобилизованный белок.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что неполный восковидный мутантный аллель является двойным нулевым восковидным аллелем.8. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве мутагена используют этилметансульфонат (ЭМС).9. Способ по п.6, отличающийся тем, что при проведении скрининга используют тестирование на непрозрачность семян.10. Способ по п.6, отличающийся тем, что при проведении скрининга используют тестирование с помощью йода.11. Способ осуществления скрининга потомства обработанного растительного материала для идентификации растительного материала с полным мутантным аллелем, производящим восковидный крахмал, содержащий инактивированный иммобилизованный белок, включающий отбор растительного материала, содержащего восковидный крахмал, отделение восковидного крахмала, выделение инактивированного иммобилизованного белка из восковидного крахмала, определение положения инактивированного иммобилизованного белка в крахмале и идентификацию происхождения мутантного растительного материала и наличия необходимых крахмальных мутаций.