Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу лечения или снижения вероятности приобретения остеопороза, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии или атеросклероза с применением новой комбинированной терапии на чувствительных теплокровных животных, включая человека. В частности, комбинация включает введение селективного модулятора рецепторов эстрогенов (SERM) и повышение у пациента уровня предшественника половых стероидных гормонов, причем указанный предшественник выбран из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона (DHEA), дегидроэпиандростеронсульфата (DHEA-S) и андрост-5-ен-3β ,17β -диола (5-диола). Изобретение относится также к наборам и фармацевтической композиции для использования на практике вышеуказанной комбинации.
Предшествующий уровень техники
Человек, наряду с некоторыми другими приматами, является уникальным в том, что имеет надпочечники, которые секретируют большие количества предшественников стероидов дегидроэпиандростеронсульфата (DHEA-S) и дегидроэпиандростерона (DHEA), которые превращаются в андростендион (4-дион) и затем в активные андрогены и/или эстрогены в периферических тканях (Labrie et al., In: Important Advances in Oncology. Edited by V.T. de Vita, S. Hellman, S.A. Rosenberg, J.B. Lippincott, Philadelphia, 193-217, 1985; Labrie, Mol. Cell. Endocrinol., 78: C113-C118, 1991; Labrie et al., In Signal Transduction in Testicular Cells. Ernst Schering Research Foundation Workshop, Edited by V.Hansson, F.O. Levy, K. Tasken. Springer-Verlag, Berlin-New York (Suppl. 2), pp. 185-218, 1996; Labrie et al., Steroids, 62: 148-158, 1997). В недавней работе (Labrie et al., J.Clin. Endocrinol. Metab., 82: 2403-2409, 1997), заявители описали существенное падение уровней циркулирующих дегидроэпиандростерона (DHEA), DHEA-сульфата (DHEA-S), андрост-5-ен-3β ,17β -диола (5-диола), 5-диол-S (5-диолсульфата), эфиров 5-диола и жирных кислот и андростендиона у мужчин и женщин в возрасте от 20 до 80 лет.
Несмотря на заметное снижение эндогенных андрогенов у женщин с возрастом, применение андрогенов в период постменопаузы у женщин ограничено из-за опасения повышенного риска возникновения сердечно-сосудистого заболевания, что основано на результатах более ранних исследований, показывающих неблагоприятный липидный профиль с андрогенами. Однако в недавних исследованиях не было показано значительного воздействия комбинированной терапии эстрогенами и андрогенами на сывороточный уровень холестерина, триглицеридов, ЛПВП (HDL), ЛПНП (LDL) и на соотношение ЛПВП/ЛПНП по сравнению с одними эстрогенами (Sherwin et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 156: 414-419, 1987). В соответствии с этими наблюдениями заявители показали, что DHEA, соединение, обладающее преимущественно андрогенным влиянием, явно не оказывает пагубного влияния на профиль сывороточных липидов (Diamond et al., J. Endocrinol., 150: S43-S50, 1996). Аналогично не наблюдали изменения в концентрации холестерина, его субфракций или триглицеридов во время обработки одним эстрадиолом через 6 месяцев лечения имплантантами эстрадиол + тестостерон (Burger et al., Br. Med. J. Clin. Res. Ed., 294: 936-937, 1987). Следует отметить, что исследование на людях показало обратную корреляцию между сывороточным DHEA-S и липопротеидами низкой плотности (Parker et al., Science, 208: 512-514, 1980). Позднее установили корреляцию между низким уровнем тестостерона и DHEA в сыворотке крови и повышенным внутренним жиром, параметром повышенного риска для сердечно-сосудистой системы (Tchernof et al., Metabolism, 44: 513-519, 1995).
5-диол является соединением, биосинтезируемым из DHEA при участии восстанавливающего 17β -гидроксистероида дегидрогеназы (17β -HSD) и является слабым эстрогеном. Он имеет аффинность в 85 раз ниже, чем 17β -эстрадиол (Е2) для рецептора эстрогенов у крысы в цитозоле передней части гипофиза (Simard and Labrie, J. Steroid Biochem., 26: 539-546, 1987), дополнительно подтверждая данные, полученные с этим же параметром в миометрии человека и раковой ткани молочной железы (Kreitmann and Bayard, J. Steroid Biochem., 11: 1589-1595, 1979; Adams et al., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981;
Poulin and Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986). Однако при концентрациях, находящихся в пределах уровней в плазме крови, установленных у взрослых женщин, 5-диол увеличивает клеточную пролиферацию и уровни рецепторов прогестерона в опухолевых клетках ZR-75-1 молочной железы человека (Poulin and Labrie, Cancer Res., 46: 4933-4937, 1986) и усиливает зависимый от эстрогенов синтез гликопротеида размером 52 кДа в клетках MCF-7 (Adams et al., Cancer Res., 41: 4720-4926, 1981).
Как упоминалось выше, известно, что уровни DHEA, DHEA-S и 5-диола в сыворотке крови уменьшаются с возрастом и, соответственно, имеется существенное, зависимое от возраста снижение образования андрогенов и эстрогенов в периферических тканях-мишенях. Подобные изменения в секреции DHEA-S и DHEA приводят к заметному снижению биохимических и клеточных функций, стимулируемых половыми стероидными гормонами. В результате недавно DHEA и DHEA-S использовали для лечения разнообразных заболеваний, связанных с уменьшением и/или нарушением равновесия уровней половых стероидных гормонов.
Остеопороз, заболевание, которое поражает мужчин и женщщин, и связано со снижением уровня андрогенов и эстрогенов. Было показано, что эстрогены снижают скорость деградации костей, в то время как андрогены способствуют построению костной массы. Однако для заместительной терапии эстрогенами, обычно используемой при остеопорозе, необходимо добавление прогестинов для предупреждения пролиферации эндометрия и риска возникновения рака эндометрия, индуцируемого эстрогенами. Кроме того, поскольку полагается, что как эстрогены, так и прогестины увеличивают риск рака молочной железы (Bardon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 60: 692-697, 1985; Colditz et al., N. Engl. J. Med., 332: 1589-1593, 1995) применение заместительной терапии эстрогенами-прогестинами допускается у ограниченного числа женщин и, обычно в течение очень короткого периода времени.
На основе нескольких исследований было высказано предположение, что остеопороз является клиническим проявлением недостатка андрогенов у мужчин (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103-106, 1978; Odell and Swerdloff, West J. Med. 124: 446-475, 1976; Smith and Walker, Calif. Tissue Res. 22 (Suppl.): 225-228, 1976). Было установлено при наблюдении с нандролондеканоатом, что лечение андрогенами увеличивает минеральную плотность костей позвонков у женщин в период постменопаузы (Need et al., Arch. Intern. Med., 149: 57-60, 1989). Лечение женщин в постменопаузе нандролоном повысило содержание минеральных веществ в кортикальном слое костей (Need et al., Clin. Orthop. 225: 273-278, 1987). Однако побочные эффекты в результате применения андрогенов были зарегистрированы у 50% пациентов. Подобные данные представляют интерес, поскольку в то время, как все существующие виды терапии ограничиваются уменьшением потери костей, при применении анаболического стероида нандролона было обнаружено увеличение костной массы. Было высказано предположение о подобной стимуляции формирования костей под действием андрогенов у мужчин с гипогонадизмом (Baran et al., Calcif. Tissue Res. 26: 103, 1978). Labrie et al. сообщают о стимуляции формирования костей у женщин в постменопаузе при лечении DHEA в течение 12 месяцев (J. Clin. Endocrinol. 82: 3498-3505, 1997).
DHEA (450 мг/кг массы тела, 3 раза в неделю) заметно снижал появление рака молочной железы у мышей С3Н, которые имеют генетическую предрасположенность к развитию рака молочной железы (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979). Кроме того, было установлено, что риск развития рака мочевого пузыря увеличивается у мужчин, имеющих низкие уровни DHEA в сыворотке крови (Gordon et al., Cancer Res. 51: 1366-1369, 1991).
Патентная заявка США 5550107 относится к способу лечения рака молочной железы и эндометрия у чувствительных теплокровных животных, который может включать ингибирование гормональной секреции яичников хирургическими способами (овариэктомия) или химическими способами (применение агониста LHRH, например, [D-Trр6, дес-Gly-NН
Кроме того, сердечно-сосудистые заболевания связаны с пониженными сывороточными уровнями DHEA и DHEA-S, и как DHEA, так и DHEA-S были предложены для профилактики и лечения этих заболеваний (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315:1519-1524, 1986).
У взрослых крыс Sprague-Dawley, Schwartz (in Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982) наблюдал, что масса тела снижалась с 600 до 550 г под действием DHEA без влияния на потребление корма. Schwartz (Cancer 39: 1129-1132, 1979) наблюдал, что у мышей С3Н, которым вводили DHEA (450 мг/кг, 3 раза в день), значительно снизились прибавки в весе, они росли быстрее по сравнению с контрольными животными, имели меньшее количество жира в организме и были более активны. Снижение массы тела достигалось без потери аппетита или ограничения в корме. Кроме того, DHEA может предупреждать прибавки в весе у животных, выращиваемых для проявления ожирения в половозрелом возрасте (in Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982).
Введение DHEA истощенным крысам Zucher привело к снижению прибавок в весе, несмотря на повышенное потребление корма. У обработанных животных были меньшие жировые скопления, на основании чего в целом можно предположить, что DHEA усиливает метаболизм кормов, приводя к более низким прибавкам в весе и накоплению жира (Svec et al., Proc. 2nd Int. Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, p.56 abst., 1997).
Было установлено, что ожирение лечится у мышей-мутантов Аvy (Yen et al., Lipids 12: 409-413, 1977) и у крыс Zucher (Cleary and Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983). Обработанные DHEA мыши С3Н выглядели моложе по сравнению с контрольными животными (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979).
DHEA снижал частоту появления атеросклероза у кроликов, которым скармливали холестерин (Gordon et al., J.Clin. Invest. 82: 712-720, 1988; Arad et al., Arteriosclerosis 9: 159-166, 1989). Кроме того, было сообщение о том, что высокие концентрации DHEA-S в сыворотке крови защищают от смерти в результате сердечно-сосудистых заболеваний у людей (Barrett-Connor et al., N.Engl. J.Med. 315: 1519-1524, 1986). Было установлено, что уровни циркулирующих DHEA и DHEA-S обратно коррелируют со смертностью в результате сердечно-сосудистого заболевания (Barrett-Connor et al., N. Engl. J. Med. 315: 1519-1524, 1986) и снижаются параллельно с подавлением иммунной системы (Thoman and Weigle, Adv. Immunol. 46: 221-222, 1989). Исследование на человеке показало наличие обратной корреляции между уровнем DHEA-S в фетальной сыворотке и уровнем липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) (Parker et al., Science 208: 512, 1980).
Применение DHEA, а также положительные эффекты лечения андрогенами и эстрогенами обсуждаются в публикации международного патента WO 94/16709.
На основании корреляций, наблюдаемых в предыдущем уровне техники, нельзя было предположить способы лечения или профилактики, которые эффективны или не обладают нежелательными побочными эффектами, такие, как комбинированная терапия, раскрытая здесь.
Краткое описание изобретения
Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение эффективных способов лечения остеопороза, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, атеросклероза, рака молочной железы, рака эндометрия, рака яичников и рака матки, в то же время сводя до минимума нежелательные побочные эффекты.
Другой целью является обеспечение способов снижения риска приобретения вышеуказанных заболеваний.
Другой целью является обеспечение наборов и фармацевтических композиций, пригодных для применения в вышеуказанных способах.
В одном воплощении изобретение относится к способу лечения или снижения риска приобретения остеопороза, включающему повышение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона (DHEA), дегидроэпиандростеронсульфата (DHEA-S) и андрост-5-ен-3β ,17β -диола(5-диола), у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающему введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов (SERM), как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения гиперхолестеринемии, включающий повышение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения гиперлипидемии, включающий повышение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения атеросклероза, включающий увеличение уровней предшественника половых гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения рака молочной железы, включающий увеличение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения рака эндометрия, включающий повышение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения рака матки, включающий увеличение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ лечения или снижения риска приобретения рака яичников, включающий увеличение уровней предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, у пациента, нуждающегося в указанном лечении или указанном снижении, и далее включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов, как части комбинированной терапии.
В другом воплощении изобретение обеспечивает набор, включающий первый контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, и любого пролекарства, которое in vivo превращается в любой из вышеуказанных предшественников; и далее включающий второй контейнер, содержащий терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного селективного модулятора рецепторов эстрогенов.
В другом воплощении изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую: а) фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель; b) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата и андрост-5-ен-3β ,17β -диола, и пролекарство, которое in vivo превращается в любой из вышеуказанных предшественников половых стероидных гормонов; и с) терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного селективного модулятора рецепторов эстрогенов.
В другом воплощении изобретение обеспечивает способ снижения риска приобретения рака молочной железы, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком снижении, профилактически эффективного количества селективного модулятора рецепторов эстрогенов.
В одном воплощении снижения вероятности приобретения рака молочной железы, желательно объединить введение SERM с введением предшественника половых стероидных гормонов. Однако изобретение также включает введение одного SERM, которое показано, например, на фигурах 1 и 2, для обеспечения значительного профилактического эффекта, даже при отсутствии назначаемых предшественников. Предпочтительные SERM для этой цели являются такими же, как обсуждались здесь для других применений. Предпочтительные дозировки и способы введения также являются такими же.
Как здесь использовано, селективный модулятор рецепторов эстрогенов (SERM) является соединением, которое либо непосредственно, либо через его активный метаболит действует в качестве антагониста рецепторов эстрогенов (“антиэстроген”) в ткани молочной железы, и еще обеспечивает эстрогенный или эстрогенподобный эффект на костную ткань и на уровень холестерина в сыворотке крови (т.е. снижая сывороточный холестерин). Нестероидные соединения, которые действуют в качестве антагонистов рецепторов эстрогенов in vitro или в ткани молочной железы человека или крысы (особенно, если соединение ведет себя в качестве антиэстрогена в отношении раковых клеток молочной железы человека), вероятно, функционируют в качестве SERM. Напротив, стероидные антиэстрогены не имеют тенденции действовать в качестве SERM потому, что они не имеют тенденции проявлять какое-либо положительное действие на уровень холестерина в сыворотке крови. Заявители тестировали нестероидные антиэстрогены и установили, что они функционируют в качестве SERM, включая ЕМ-800, ЕМ-01538, ралоксифен, тамоксифен и дролоксифен. Заявители тестировали стероидный антиэстроген ICI 182780 и установили, что он не функционирует в качестве SERM. SERM по изобретению можно вводить в той же дозе, известной в данной области, когда указанные соединения применяются в качестве антиэстрогенов.
Заявители также отметили наличие корреляции между положительными эффектами SERM на уровень холестерина в сыворотке крови и положительными эстроген- и эстроген-подобными эффектами на кости и сывороточные липиды. В исследовании заявителей SERM, показали себя, как действующие положительно на все параметры, включая массу костей, уровни холестерина и триглицеридов. Не намереваясь быть связанными теорией, полагается, что SERM, многие из которых предпочтительно имеют два ароматических кольца, связанных одним-двумя атомами углерода, взаимодействуют, как ожидается, с рецептором эстрогенов через вышеуказанную часть молекулы, которая лучше всего распознается рецептором. Предпочтительные SERM имеют боковые цепи, которые могут избирательно вызвать антагонистические свойства в ткани молочной железы без проявления значительных антагонистических свойств в других тканях. Таким образом, SERM могут функционировать в желаемом направлении в качестве антиэстрогенов в молочной железе, в то же время удивительно функционируя в желаемом направлении в качестве эстрогенов (или обеспечивая эстрогенподобную активность) в костях и в крови (где они положительно влияют на концентрацию липидов или холестерина). Благоприятное действие на холестерин и липиды передается на благоприятное действие против атеросклероза, на развитие которого, как известно, отрицательно действуют несвойственные уровни холестерина и липидов.
Все заболевания, поддающиеся лечению по изобретению, обсуждаемому здесь, положительно реагируют на андрогены. В большей степени, чем применение андрогенов самих по себе, заявители используют предшественники половых стероидных гормонов такие, как DHEA, DHEA-S, 5-диол, или пролекарства, превращаемые в любые такие предшественники половых стероидных гормонов. In vivo DHEA-S превращается в DHEA, который в свою очередь, превращается в 5-диол. Полагается, что любая ткань, положительно реагирующая на один, вероятно, будет положительно реагировать на другие. Пролекарственные формы активных метаболитов хорошо известны в этой области. Смотри, например, H.Bundgaard “Design and Application of Prodrugs” (In.: A Textbook of Drug Design and Development. Edited by H.Bundgaard and P.Krogsgaard-Larsen; Harwook Academic Publishers GmfH, Chur: Switzerland, 1991), содержание которого включено здесь в качестве ссылки. В частности, смотри страницы 154-155, где описываются различные функциональные группы активных метаболитов и соответствующие группы пролекарств, которые превращаются in vivo в каждую функциональную группу. В случаях, когда уровень предшественников половых стероидных гормонов у пациентов повышается в соответствии с изобретением, этого обычно можно достичь при введении такого предшественника или при введении пролекарства такого предшественника. При применении предшественников вместо андрогенов снижается нежелательная андрогенная активность в тканях иных, чем мишеневая. Ткани превращают предшественники такие, как DHEA, в андрогены только посредством естественного и более регулируемого процесса. Большой процент андрогенов продуцируется локально в периферических тканях и в различных тканях в различной степени.
Виды рака, поддающиеся лечению в соответствии с изобретением, неблагоприятно отвечают на эстрогенную активность. С другой стороны, остеопороз, гиперхолестеринемия, гиперлипидемия и атеросклероз положительно отвечают на эстрогенную или эстрогенподобную активность. Используя SERM в соответствии с изобретением, желаемые эффекты обеспечиваются в тканях-мишенях без нежелательных эффектов в некоторых других тканях. Например, SERM могут обладать положительным эстрогенным действием в кости (или на липиды и холестерин), в то же время у них отсутствует неблагоприятный эстрогенный эффект в отношении молочной железы.
Следовательно, как предшественник, так и SERM, обеспечивают положительное действие в отношении тканей-мишеней, в то же время сводя до минимума неблагоприятные эффекты в некоторых других тканях. Более того, наблюдается существенный синергизм при использовании двух вместе в соответствии с изобретением. Например, эстрогены и андрогены обеспечивают положительное действие против остеопороза различными механизмами (эстроген-снижающим резорбцию костей, андроген-повышающим формирование костей). Комбинация по настоящему изобретению обеспечивает кость положительным эстрогенным или эстрогенподобным действием через активность SERM, и также обеспечивает положительным андрогенным действием через локальное превращение предшественника в андроген в кости. Предполагается, что предшественник также обеспечивает эстроген. То же самое справедливо в отношении регуляции липидов или холестерина (пригодной для лечения или профилактики атеросклероза). Аналогичный синергизм обеспечивается против рака молочной железы, эндометрия яичников или матки, где SERM обеспечивает желаемый антиэстрогенный эффект, а предшественник обеспечивает желаемый андрогенный эффект (при любом побочном превращении предшественника в эстроген, будучи смягченным антиэстрогеном). Нежелательные эффекты также ослабляются синергическим путем комбинацией, использованной по изобретению.
Для всех заболеваний, обсуждаемых здесь, любое другое действие на ткани молочной железы, которое может иначе возникнуть от эстрогенов, образовавшихся из предшественника (когда используется предшественник для обеспечения андрогенных эффектов по изобретению), ослабляется антиэстрогенным действием SERM в ткани молочной железы.
В некоторых воплощениях изобретения добавляются прогестины для обеспечения дополнительного андрогенного эффекта. Прогестины можно применять в низких дозах, известных в этой области, без отрицательного влияния на иные рецепторы, чем рецепторы андрогенов (например, рецепторы глюкокортикоидов).
Они также относительно свободны от нежелательных андрогенных побочных эффектов (таких, как рост волос на лице у женщин).
Предпочтительные SERM, обсуждаемые здесь, относятся 1) ко всем заболеваниям, указанным, как чувствительные к изобретению); 2) как к терапевтическим, так и профилактическим применениям и 3) к предпочтительным фармацевтическим композициям и наборам.
В одном воплощении предшественником является DHEA.
В другом воплощении предшественником является DHEA-S. В другом воплощении предшественником является 5-диол.
Пациентом, нуждающимся в лечении или снижении риска начала данного заболевания является субъект, которому либо был поставлен диагноз такого заболевания, либо субъект, который является чувствительным к приобретению такого заболевания.
За исключением, когда указано иное, предпочтительная доза активных соединений (концентрации и способы введения) по изобретению является одинаковой для терапевтических и профилактических целей. Дозировка каждого активного компонента, обсуждаемого здесь, является одной и той же независимо от заболевания, которое лечится (или заболевания, вероятность начала которого снижается).
За исключением, когда отмечено иное или когда это очевидно из контекста, дозы здесь относятся к весу активных соединений, не подвергающихся влиянию фармацевтических эксципиентов, разбавителей, носителей или других ингредиентов, хотя, желательно включать такие дополнительные ингредиенты, как показано здесь в примерах. Любая лекарственная форма (капсула, таблетка, инъекция или тому подобное), обычно используемая в фармацевтической промышленности, подходит здесь для применения, и термины “эксципиент”, “разбавитель” или “носитель” включают такие неактивные ингредиенты, которые обычно включаются вместе с активными ингредиентами в подобных лекарственных формах в промышленности. Например, могут быть включены обычные капсулы, пилюли, кишечные оболочки, твердые или жидкие разбавители или эксципиенты, ароматизаторы, консерванты и тому подобное.
Все из активных ингредиентов, использованных в любом из обсуждаемых здесь лечений, можно включить в состав фармацевтических композиций, которые также включают один или более других активных ингредиентов. Альтернативно каждый из них можно вводить по отдельности, но в достаточной мере одновременно так, чтобы у пациента в конечном итоге повысились уровни в крови, или иначе было получено положительное воздействие каждого из активных ингредиентов (или стратегий) одновременно. В некоторых предпочтительных воплощениях изобретения, например, один или более активных ингредиентов должны быть включены в состав одной фармацевтической композиции. В других воплощениях изобретения обеспечивается набор, который включает по меньшей мере два отдельных контейнера, где содержимое по меньшей мере одного контейнера отличается в целом или частично от содержимого по меньшей мере одного другого контейнера в отношении активных ингредиентов, содержащихся там.
Комбинированная терапия, обсуждаемая здесь, также включает применение одного активного ингредиента (из комбинации) в производстве лекарственного препарата для лечения (или снижения риска) данного заболевания, где лечение или профилактика дополнительно включает другой активный ингредиент комбинации по изобретению. Например, в одном воплощении изобретение обеспечивает применение SERM для получения лекарственного препарата для применения в комбинации с предшественником половых стероидных гормонов, выбранным из группы, состоящей из DHEA, DHEA-S, 5-диола, и пролекарствами, превращаемыми в любой из вышеуказанных предшественников половых стероидных гормонов in vivo, при лечении любого из заболеваний, для которых, как полагается, эффективна настоящая комбинированная терапия (т.е. рак молочной железы, рак эндометрия, рак матки, рак яичников, остеопороз, гиперхолестеринемия, гиперлипидемия и атеросклероз). В другом воплощении изобретение обеспечивает применение предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из DHEA, DHEA-S, 5-диола, и пролекарств, превращаемых в любой из вышеуказанных предшественников половых стероидных гормонов in vivo, для получения лекарственного препарата для применения в комбинации с SERM при лечении любого из этих же заболеваний.
В одном воплощении изобретения DHEA не используется в качестве предшественника. В другом воплощении ЕМ-800 не используется в качестве SERM. В другом воплощении не используется комбинация DHEA с ЕМ-800.
В предпочтительном воплощении DHEA используется в сочетании с ЕМ-1538.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показано влияние обработки DHEA (10 мг чрескожно, один раз в день) или ЕМ-800 (75 мкг перорально, один раз в день) по отдельности или в комбинации в течение 9 месяцев на частоту индуцируемой DMBA карциномы молочной железы у крыс в течение 279-дневного периода наблюдения. Данные выражаются в виде процента от общего числа животных в каждой группе.
На фигуре 2 показано влияние обработки DHEA (10 мг чрескожно, один раз в день) или ЕМ-800 (75 мкг перорально, один раз в день) по отдельности или в комбинации в течение 9 месяцев на среднее число опухолей у животных-опухоленосителей (А) и на средний размер опухолей на крысу-опухоленоситель (В) в течение 279-дневного периода наблюдения. Данные выражаются в виде средних значений ± средняя ошибка среднего значения.
На фигуре 3 показано влияние обработки DHEA (10 мг чрескожно, один раз в день) или ЕМ-800 (75 мкг перорально, один раз в день) по отдельности или в комбинации в течение 9 месяцев на уровни триглицеридов (А) и холестерина (В) в сыворотке крови крыс. Данные выражаются в виде средних значений ± средняя ошибка среднего значения. * * : р&λτ; 0,01 опытные против соответствующего контроля.
На фигуре 4 показано: А) влияние возрастающих доз DHEA (0,3 мг, 1,0 мг или 3,0 мг), вводимых чрескожно, дважды в день, на средний размер опухолей ZR-75-1 у голых мышей с удаленными яичниками (OVX), обработанных эстроном. Контрольных OVX мышей, получавших один носитель, использовали в качестве дополнительного контроля. Первоначальный размер опухолей был принят за 100%. DHEA вводили чрескожно (ч.к.) в 0,02 мл раствора 50% этанол, 50% пропиленгликоль на кожу спины. В) влияние лечения возрастающими дозами DHEA или ЕМ-800 по отдельности или в комбинации в течение 9,5 месяцев на вес опухолей ZR-75-1 у OVX голых мышей, обработанных эстроном. * * : р&λτ; 0,01, обработанные против контрольных OVX мышей с добавлением эстрона.
На фигуре 5 показано влияние возрастающих пероральных доз антиэстрогена ЕМ-800 (15 мкг, 50 мкг или 100 мкг) (А) или чрескожного введения в возрастающих дозах DHEA (0,3, 1,0 или 3,0 мг) в сочетании с ЕМ-800 (15 мкг) или одного ЕМ-800 (В) в течение 9,5 месяцев на средний размер опухолей ZR-75-1 у голых мышей с удаленными яичниками (OVX), обработанных эстроном. Первоначальный размер опухолей был принят за 100%. Контрольных OVX мышей, получавших один носитель, использовали в качестве дополнительного контроля. Эстрон вводили подкожно в дозе 0,5 мкг, один раз в день, в то время как DHEA растворяли в смеси 50% этанол, 50% припиленгликоль и наносили на кожу спины дважды в день в объеме 0,02 мл. Сравнение также проводили с OVX животными, получавшими один носитель.
На фигуре 6 показано влияние 12-месячной обработки только дегидроэпиандростероном (DHEA) или в комбинации с флутамидом или ЕМ-800 на объем губчатого вещества костей у крыс с удаленными яичниками. Интактные животные были добавлены в качестве дополнительного контроля. Данные представляются в виде средних значений ± средняя ошибка среднего значения. * * р&λτ; 0,01 против OVX контроля.
На фигуре 7 показано влияние 12-месячной обработки только дегидроэпиандростероном (DHEA) или в комбинации с флутамидом или ЕМ-800 на число трабекул у крыс с удаленными яичниками. Интактные животные были добавлены в качестве дополнительного контроля. Данные выражаются в виде средних значений ± средняя ошибка среднего значения. * * р&λτ; 0,01 против OVX контроля.
На фигуре 8 показаны метафизы в проксимальной части большеберцовой кости от интактных контрольных животных (А), контрольных крыс с удаленными яичниками (В) и у крыс с удаленными яичниками, обработанными одним DHEA (С) или в сочетании с флутамидом (D) или ЕМ-800 (Е). Отмечается пониженное количество губчатого вещества костей (Т) у контрольных животных с удаленными яичниками (В) и значительное повышение объема губчатого вещества костей (Т), индуцированного после введения DHEA (С). Добавление флутамида к DHEA частично блокировало действие DHEA в отношении объема губчатого вещества костей (D), в то время как сочетание DHEA и ЕМ-800 обеспечило полную защиту от потери кости, связанной с овариэктомией. Модицифированный трехцветный Masson-GoIdner, увеличение × 80. Т-губчатое вещество; GP-ростовая пластинка.
На фигуре 9 показано влияние возрастающих доз (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 и 1 мг/кг) ЕМ-800, ЕМ-1538 и ралоксифена (ЕМ-1105), вводимых перорально ежедневно в течение 4 дней на уровень холестерина у крыс с удаленными яичниками.
На фигуре 10 показано влияние 34-недельного введения только дегидроэпиандростерона (DHEA) или в комбинации с ЕМ-1538 (ЕМ-652· НСl) на минеральную плотность костей (BMD) в поясничных позвонках у крыс с удаленными яичниками. Интактные животные были добавлены в качестве дополнительного контроля. Данные выражаются в виде среднего значения±средняя ошибка среднего значения. * * р&λτ; 0,01 против OVX контроля.
На фигуре 11 показано комбинированное влияние SERM (ЕМ-652) и DHEA на параметры менопаузы. Отрицательного действия не предполагается.
На фигуре 12 показана концентрация DHEA в плазме крови (нг/мл) (ось Y) как функция от времени (ось X) после однократного перорального введения предпочтительных предшественников половых стероидных гормонов по изобретению (150 мкмоль/крысу) у крыс-самцов. В прямоугольнике представлены AUC DHEA за 24 ч, индуцированного этими соединениями.
ЕМ-760 дегидроэпиандростерон
ЕМ-900 андрост-5-ен-3β ,17β -диол
ЕМ-1304 андрост-5-ен-3β ,17β -диол 3-ацетат
EM-1305-CS андрост-5-ен-3β ,17β -диол диацетат
ЕМ-1397 андрост-5-ен-3β ,17β -диол 3-ацетат 17-бензоат
ЕМ-1400 андрост-5-ен-3β ,17β -диол дибензоат
ЕМ-1410 андрост-5-ен-3β ,17β -диол дипропионат
EM-1474-D андрост-5-ен-3β ,17β -диол дигемисукцинат
На фигуре 13 показана концентрация в плазме крови андрост-5-ен-3β ,17β -диола (нг/мл) (ось Y), как функция от времени (ось X), после однократного перорального введения предшественника половых стероидных гормонов по изобретению (150 мкмоль/крысу) у крыс-самцов. В прямоугольнике представлена AUC андрост-5-ен-3β ,17β -диола за 24 ч, индуцированного этими соединениями.
ЕМ-760 дегидроэпиандростерон
ЕМ-900 андрост-5-ен-3β ,17β -диол
ЕМ-1304 андрост-5-ен-3β ,17β -диол 3-ацетат
EM-1305-CS андрост-5-ен-3β ,17β -диол диацетат
ЕМ-1397 андрост-5-ен-3β ,17β -диол 3-ацетат 17-бензоат
ЕМ-1400 андрост-5-ен-3β ,17β -диол дибензоат
ЕМ-1410 андрост-5-ен-3β ,17β -диол дипропионат
EM-1474-D андрост-5-ен-3β ,17β -диол дигемисукцинат.
Детальное описание изобретения
Хорошо известно, что эстрогены стимулируют пролиферацию эпителиальных клеток молочной железы, и предлагается, что сама по себе пролиферация клеток увеличивает риск возникновения рака при накоплении случайных генетических ошибок, которые могут привести к неоплазии (Preston Martin et al., Cancer. Res. 50: 7415-21, 1990). Основываясь на этой концепции, антиэстрогены вводили для профилактики рака молочной железы с целью снижения скорости деления клеток, стимулированной эстрогенами.
Потеря цикличности яичников, установленная у крыс-самок Sprague-Dawley после 10-месячного возраста, сопровождается повышенными уровнями эстрогена и пролактина и пониженными концентрациями андрогенов и прогестерона в сыворотке крови (Lu et al., 61st Annual Meeting of the Endocrine Society 106 (abst. # 134), 1979; Tang et al., Biol. Reprod. 31: 399-413, 1984; Russo et al., Monographs on Pathology of Laboratory Animals: Integument and Mammary Glands 252-266, 1989; Sortino and Wise, Endocrinology 124: 90-96, 1989; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991). Эти гормональные изменения, которые спонтанно происходят у стареющих крыс-самок, связаны с многоочаговой пролиферацией и повышенной секреторной активностью ацинарной/альвеолярной ткани, а также расширением протоков молочной железы и образованием цист (Boorman et al., 433, 1990; Cardy, Vet. Pathol. 28: 139-145, 1991).
Следует отметить, что гиперпластические и неопластические изменения молочной железы у крыс часто сопровождаются повышенными уровнями эстрогенов и пролактина (Meites, J. Neural. Transm. 48: 25-42, 1980). Обработка ЕМ-800, SERM по настоящему изобретению индуцирует атрофию молочной железы, которая характеризуется снижением размера и числа дольковых структур, и без признаков секреторной активности, что указывает на сильную антиэстрогенную активность ЕМ-800 в молочной железе (Luo et al. Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).
Обработка DHEA, предшественником половых стероидных гормонов по настоящему изобретению, приводит к повышению сывороточных DHEA и 5-диола, в то время, как уровни 4-диона, тестостерона, дигидротестостерона и эстрадиола в сыворотке крови увеличиваются только в средней степени или чаще остаются без изменений, подтверждая таким образом внутриклеточную биотрансформацию этого предшественника стероидных гормонов в периферических тканях (Labrie et al., Mol. Cell. Endocrinol. 78: C113-C118, 1991). Однако имеет место стимулирующий эффект перорально введенного DHEA на сывороточные андрогены, такие, как тестостерон и дигидротестостерон, большего диапазона, чем его влияние на сывороточные эстрогены, на основании чего можно предположить, что у этих животных DHEA предпочтительно превращается в андрогены. Это наблюдение согласуется с данными, полученными на женщинах, у которых образование андрогенов из DHEA было более важным путем, чем превращение DHEA в эстрогены (Morales et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 78: 1360-1367, 1994; Labrie et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 774: 16-28, 1995; Labrie et al., Steroids 62: 148-158, 1997).
При известности вышеописанной сильной антиэстрогенной активности, приводящей к атрофии молочной железы, и преобладающего андрогенного эффекта DHEA на молочную железу, гистоморфологические изменения, установленные на животных, обработанных комбинацией SERM и предшественника половых стероидных гормонов, наилучшим образом объясняются единственным андрогенным действием DHEA в молочной железе крыс.
Более важно наблюдение, что андрогены проявляют прямую антипролиферативную активность на рост ZR-75-1 в раковых клетках молочной железы человека in vitro и, что это тормозящее действие андрогенов является аддитивным к таковому антиэстрогену (Poulin and Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225, 1988). Подобные ингибирующие эффекты наблюдали in vivo на ксенотрансплантатах ZR-75-1 у голых мышей (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Было также показано, что андрогены тормозят рост индуцируемой DMBA карциномы молочной железы у крыс, причем это тормозящее действие снимается при одновременном введении чистого антиандрогена флутамида (Dauvois et al., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299-306, 1989). Взятые вместе, настоящие данные указывают на участие рецепторов андрогенов в ингибирующем действии DHEA на рак молочной железы.
Поскольку антиэстрогены и предшественники половых стероидных гормонов проявляют тормозящее действие в отношении рака молочной железы посредством различных механизмов, настоящее изобретение показывает, что комбинация SERM (ЕМ-800) и предшественника половых стероидных гормонов (DHEA) проявляет более сильные ингибирующие эффекты, чем каждое соединение само по себе, на развитие индуцированной DMBA карциномы молочной железы, что хорошо показано на фигурах 1 и 2. Фактически не было обнаружено индуцированной DMBA опухоли в конце опыта у животных, которые получали как DHEA, так и ЕМ-800.
Настоящее изобретение описывает, что комбинация предшественника половых стероидных гормонов (DHEA) и SERM (ЕМ-800) сохраняла стимулирующее действие DHEA на формирование костей и усиливала ингибирующее действие только SERM (ЕМ-800) на обмен и резорбцию костей, что было показано дополнительным снижением выделения гидроксипролина и кальция с мочой, когда объединялись оба соединения.
Заявители показали, что DHEA имеет положительное воздействие на кости у крыс-самок (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997) и у женщин в постменопаузе (Labrie et al., J.Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3498-3505, 1997). Так, у интактных крыс-самок обработка DHEA увеличивает минеральную плотность костей (BMD) всего скелета, поясничных позвонков и бедренной кости (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).
С другой стороны, обработка ЕМ-800 не имела достоверного воздействия на BMD у интактных животных, хотя наблюдали сильные стимулирующие эффекты у крыс с удаленными яичниками (Martel et al., неопубликованные данные). Поскольку ЕМ-800 проявляет подобное стимулирующее действие на BMD всего скелета, поясничных позвонков и бедренной кости у крыс, отсутствие достоверного стимулирующего действия ЕМ-800 у интактных животных может быть результатом того факта, что половые стероидные гормоны, присутствующие у интактных крыс-самок, проявляют максимальное действие на BMD (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). Аналогично отсутствие достоверного эффекта ЕМ-800 у крыс с удаленными яичниками, уже получивших DHEA, вероятно, имеет место за счет максимальных стимулирующих эффектов, проявляемых андрогенами (и, возможно, эстрогенами), синтезированными в костных клетках из экзогенного DHEA.
Известно, что эстрогены снижают уровень холестерина в сыворотке крови, но увеличивают или не оказывают эффекта на уровни триглицеридов в сыворотке крови (Love et al., Ann. Intern. Med. 115: 860-864, 1991; Walsh et al., New Engl. J. Med. 325: 1196-1204, 1991; Barrett-Connor, Am. J.Med. 95 (Suppl. 5A): 40S-43S, 1993; Russell et al., Atherosclerosis 100: 113-122, 1993; Black et al., J.Clin. Invest. 93: 63-69, 1994; Dipippo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995). На фигуре 3 показано, что ЕМ-800 обладает как гипохолестеринемическим, так и гипотриглицеридемическим эффектами у крыс, демонстрируя таким образом его уникальное действие на профиль сывороточных липидов, которое явно отличается от других SERM, таких как тамоксифен (Bruning et al., Br. J.Cancer 58: 497-499, 1988; Love et al., J.Natl. Cancer Inst. 82: 1327-1332, 1990; Dipippo et al., Endocrinology 136: 1020-1033, 1995; Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995), дролоксифен (Ke et al., Endocrinology 136: 2435-2441, 1995) и ралоксифен (Black et al., J.Clin. Invest. 93: 63-69, 1994). Комбинация DHEA и ЕМ-800 сохраняет гипохолестеринемический и гипотриглицеридемический эффекты ЕМ-800, на основании чего можно предположить, что подобная комбинация может проявлять положительные эффекты на сывороточные липиды.
Следует заметить, что профиль сывороточных липидов заметно различается у крыс и людей. Однако поскольку в гипохолестеринемическом действии эстрогенов, а также антиэстрогенов участвует механизм, осуществляемый через рецепторы эстрогенов (Lundeen et al., Endocrinology 138: 1552-1558, 1997), крыса остается пригодной моделью для изучения холестеринснижающего действия эстрогенов и “антиэстрогенов” у людей.
Кратко, вышеописанные данные четко показывают действие комбинации SERM (ЕМ-800) и предшественника половых стероидных гормонов (DHEA) на развитие карциномы молочной железы, индуцированной DMBA, а также защитные эффекты подобной комбинации на массу костей и сывороточные липиды. На основании этих данных можно предположить, что имеются дополнительные положительные эффекты такой комбинации для лечения и профилактики остеопороза, при одновременном улучшении профиля липидов.
Заявители также изучили потенциальное взаимодействие ингибирующего действия нового антиэстрогена (ЕМ-800) с таковым предшественника половых стероидных гормонов (DHEA) на рост человеческих ксенотранслантатов ZR-75-1 рака молочной железы у голых мышей при комбинированном введении двух препаратов. На фигурах 4 и 5 показано, что DHEA сам по себе в использованных дозах вызывает 50-80% торможение роста опухоли, в то время, как на почти полное торможение роста опухоли, достигнутое с низкой дозой антиэстрогена, DHEA не оказывал влияния.
Ограничения при определении минеральной плотности костей (BMD) хорошо известны. В качестве примера, определения BMD не показали различий у крыс, обработанных стероидным антиэстрогеном ICI 182780 (Wakeling, Breast Cancer Res. Treat. 25: 1-9, 1993), в то время как ингибирующие изменения были установлены гистоморфометрией (Gallagher et al., Endocrinology 133: 2787-2791, 1993). Сообщалось о подобных различиях с тамоксифеном (Jordan et al., Breast Cancer Res. Treat. 10: 31-35, 1987; Sibonga et al., Breast Cancer Treatm. 41: 71-79, 1996).
Следует указать, что пониженная минеральная плотность костей является не единственной аномалией, связанной с пониженной прочностью костей (Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis. Division of Metabolism and Endocrine Drug Products, FDA, May, 1994). Таким образом, важно анализировать изменения в биохимических параметрах метаболизма костей, индуцированные различными соединениями и обработками, чтобы получить больше знаний об их действии.
Особенно важно указать, что комбинация DHEA и ЕМ-800 проявила неожиданные положительные эффекты на важные биохимические параметры метаболизма костей. Фактически DHEA сам по себе не влиял на соотношение гидроксипролин/креатинин в моче, являющееся маркером резорбции костей. Более того, нельзя было детектировать воздействие DHEA на суточное выделение с мочой кальция или фосфора (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997). ЕМ-800, с другой стороны, уменьшал соотношение гидроксипролин/креатинин в моче на 48%, в то время, как аналогично DHEA, не было установлено эффекта у ЕМ-800 на выделение кальция или фосфора с мочой. Кроме того, ЕМ-800 не оказывал эффекта на активность сывороточной щелочной фосфотазы, маркера формирования костей, в то время, как DHEA увеличивал значение параметра примерно на 75% (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).
Один из неожиданных эффектов комбинации DHEA и ЕМ-800 относится к соотношению гидроксипролин/креатинин в моче, маркера резорбции костей, которое снизилось на 69%, когда сочетались вместе DHEA и ЕМ-800, этот показатель достоверно отличался (р&λτ; 0,01) от 48% ингибирования, достигаемого одним ЕМ-8 00, в то время, как сам по себе DHEA не показывал какого-либо действия. Таким образом, добавление DHEA к ЕМ-800 увеличивает на 50% ингибирующее действие ЕМ-800 на резорбцию костей. Более важным другим неожиданным действием добавления DHEA к ЕМ-800 было уменьшение на 84% кальция в моче (с 23,17± 1,55 до 3,71± 0,75 мкмоль/24 ч/100 г (р&λτ; 0,01)) и уменьшение на 55% фосфора в моче (с 132,72± 6,08 до 59,06± 4,76 мкмоль/24 ч/100 г (р&λτ; 0,01)) соответственно (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).
Таблица 1
Также представляет интерес отметить, что сильное ингибирующее действие ЕМ-800 на сывороточный холестерин не снимается при одновременном введении с DHEA (Luo et al., Endocrinology 138: 4435-4444, 1997).
Несмотря на то, что ралоксифен и подобные соединения предупреждают потерю костей и снижение сывороточного холестерина (подобно эстрогенам), следует заметить, что, когда ралоксифен сравнили с премарином по влиянию на BMD, действие ралоксифена на BMD было менее сильным, чем таковое у премарина (Minutes of the Endocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee, FDA Thursday, Meeting # 68, November 20th 1997).
Настоящие данные, полученные на крысах, четко показывают, что DHEA может обеспечить положительные эффекты, которые отсутствуют при использовании одного селективного модулятора рецепторов эстрогенов (SERM) такого, как ЕМ-800, ралоксифен и т.д. В то время как SERM обладает действием, ограниченным ингибированием резорбции костей, полагается, что добавление DHEA, 5-диола, DHEA-S стимулирует формирование костей (действие, не обнаруженное с SERM или эстрогеном) и дополнительно снижает резорбцию костей в большей степени, чем эффект, достигаемый с ЕМ-800.
Важно, что комбинированное применение ЕМ-800 и DHEA в течение 12 месяцев у крыс с удаленными яичниками оказало положительное действие на морфометрию костей. Объем губчатого вещества костей является особенно важным для прочности костей и для предупреждения переломов. Так, в вышеуказанном опыте объем губчатого вещества костей увеличился с 4,1± 0,7% у крыс с удаленными яичниками до 11,9± 0,6% (р&λτ; 0,01) при введении только DHEA, в то время как добавление ЕМ-800 к DHEA дополнительно повысило объем губчатого вещества костей до 14,7± 1,4%, значения близкого к установленному у интактных контрольных животных (фиг.6).
Со значения 0,57± 0,08 на мм у крыс с удаленными яичниками лечение DHEA привело к увеличению на 137% числа трабекул кости по сравнению с контрольными крысами с удаленными яичниками. Таким образом, при стимулирующем действии DHEA этот показатель достиг 1,27± 0,1 на мм, в то время как одновременная обработка ЕМ-800 и DHEA привела к дополнительному увеличению числа трабекул кости на 28% (р&λτ; 0,01) по сравнению с достигаемым только DHEA (фиг.7). Аналогично, добавление ЕМ-800 к введению DHEA привело к дополнительному 15% снижению (р&λτ; 0,05) разъединения трабекул кости по сравнению с достигаемым только DHEA, приводя таким образом к значениям, не отличающимся от установленных у интактных контрольных животных.
В качестве дополнения к многочисленным данным, представленным на фигурах 6 и 7, фигура 8 показывает увеличение объема губчатого вещества костей в метафизе проксимальной части большеберцовой кости, индуцированного DHEA у животных с удаленными яичниками (С), по сравнению с контрольными крысами с удаленными яичниками (В), а также частичное ингибирование стимулирующего действия DHEA после добавления флутамида к обработке DHEA (D). С другой стороны, введение DHEA в комбинации с ЕМ-800 привело к полному предупреждению индуцируемой овариэктомией остеопении (Е), при объеме губчатого вещества костей, сравнимого с таковым, установленным у интактных контрольных крыс (А).
Полагается, что потеря костной ткани, наблюдаемая в менопаузе у женщин, связана с увеличением скорости резорбции костей, которая полностью не компенсируется вторичным возрастанием формирования костей. Фактически параметры как формирование костей, так и резорбции костей увеличиваются при остеопорозе, и как резорбция, так и формирование костей ингибируются при заместительной терапии эстрогенами. Предполагается, таким образом, что ингибирующее действие замещения эстрогенами на формирование костей является результатом связанного механизма между резорбцией костей и формированием костей так, что первичное эстрогениндуцированное снижение резорбции костей влечет за собой снижение в формировании костей (Parfitt, Calcified Tissue International 36 Suppl. 1: S37-S45, 1984).
Прочность губчатых костей и последующая резистентность к перелому зависят не только от общего количества губчатого вещества костей, но также от микроструктуры трабекул, что определяется числом, размером и распределением трабекул. Потеря функции яичников у женщин в постменопаузе сопровождается значительным снижением общего объема губчатого вещества костей (Melsen et al., Acta Pathologica &αμπ; Microbiologica Scandinavia 86: 70-81, 1978; Vakamatsou et al., Calcified Tissue International 37: 594-597, 1985), в основном связанным с уменьшением числа и, в меньшей степени, ширины трабекул (Weinstein and Hutson, Bone 8: 137-142, 1987).
В настоящем исследовании андрогенный стимулирующий эффект DHEA наблюдался почти на всех изучаемых гистоморфометрических параметрах костей. Так, DHEA приводил к достоверному увеличению объема губчатого вещества костей, а также числа трабекул, в то время, как он снижал межтрабекулярную площадь.
Для того чтобы способствовать аспекту комбинированной терапии по изобретению для любого обсуждаемого здесь указания, изобретение предусматривает фармацевтические композиции, которые включают SERM или бисфосфонатное соединение и предшественник половых стероидных гормонов (DHEA, DHEA-S, 5-диол) в одной композиции для одновременного введения. Композиция может быть пригодна для введения любым традиционным способом, включая, но не ограничиваясь пероральным введением, подкожной инъекцией, внутримышечной инъекцией или чрескожным введением. В других воплощениях обеспечивается набор, где такой набор включает один или более SERM или бисфосфонат и предшественники половых стероидных гормонов в отдельных или одном контейнере. Набор может включать соответствующие материалы для перорального введения, например, таблетки, капсулы, сиропы и тому подобное, и для трансдермального введения, например, мази, лосьоны, гели, кремы, кусочки пластыря с непрерывным высвобождением и тому подобное.
Заявители полагают, что введение SERM и предшественников половых стероидных гормонов применимы для лечения и/или профилактики развития остеопороза, рака молочной железы, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии или атеросклероза. Активные ингредиенты по изобретению (SERM или предшественник, или бисфосфонат, или другие) могут быть включены в состав композиции и введены различными способами.
Активный ингредиент для доставки через кожу и слизистые предпочтительно находится на уровне от 0,5% до 20% по весу по отношению к общему весу фармацевтической композиции, более предпочтительно между 2 и 10%. Необходимо, чтобы DHEA или 5-диол находились в концентрации по меньшей мере 7% для чрескожного введения. Альтернативно активный ингредиент можно включать в пластырь для трансдермальной доставки, имеющий структуры, известные в этой области, например, структуры такие, как в Европейском патенте №0279982.
При включении в состав мази, лосьона, геля или крема или тому подобное, активное соединение смешивается с пригодным носителем, который совместим с кожей или слизистыми человека, и который увеличивает проникновение соединения через кожу или слизистые. Пригодные носители известны в этой области и включают, но не ограничиваются, клуцелем HF и глаксалем основанием. Некоторые имеются в продаже, например, глаксаль основание предоставляет Glaxal Canada Limited Company. У Koller и Buri, S.T.P. Pharma 3(2), 115-124, 1987 можно найти другие пригодные носители. Носитель предпочтительно является таковым, в котором растворяется (растворяются) активный ингредиент(ты) при температуре окружающей среды при концентрации активного ингредиента, в которой он используется. Носитель должен иметь достаточную вязкость для сохранения предшественника на ограниченном участке кожи или слизистой, на которую наносится композиция, без стекания или испарения в течение периода времени, достаточного для основного проникновения предшественника через ограниченный участок кожи или слизистой и в кровоток, где он вызовет желаемый клинический эффект. Носитель обычно является смесью нескольких компонентов, например, фармацевтически приемлемых растворителей и сгустителей. Смесь органических и неорганических растворителей может помочь для гидрофильной и липофильной растворимости, например, вода и спирт, такой, как этанол.
Предпочтительными предшественниками половых стероидных гормонов являются дегидроэпиандростерон (DHEA) (предоставляет Diosynth Inc., Chicago, Illinois, США), его пролекарства (предоставляет Steraloids, Wilton, New Hampshire, США), 5-андростен-3β ,17β -диол и его пролекарства ЕМ-1304 и ЕМ-01474-D (предоставляет Steraloids, Wilton, New Hampshire США).
ЕМ-01474-D
Предпочтительно, чтобы предшественник половых стероидных гормонов входил в состав спиртового геля, содержащего 2,0-10% каприл-капринового триглицерида (Neobee-М-5); 10-20% гексиленгликоля; 2,0-10% диэтиленгликоля монометилового эфира (Transutol); 2,0-10% циклометикона (Dow Corning 345); 1,0-2% бензилового спирта и 1,0-5,0% гидроксипропилцеллюлозы (Klucel HF).
Носитель может включать различные добавки, обычно используемые в мазях и лосьонах, и хорошо известные в области косметологии и медицины. Например, могут присутствовать отдушки, антиоксиданты, ароматизаторы, желирующие агенты, сгустители такие, как карбоксиметилцеллюлоза, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, смягчающие вещества, красители и другие подобные агенты. При использовании для лечения системных заболеваний, место для аппликации на кожу следует изменить, чтобы избежать избыточной локальной концентрации активного ингредиента и возможной гиперстимуляции кожи и сальных желез андрогенными метаболитами предшественника половых стероидных гормонов.
В фармацевтической композиции для перорального введения DHEA или другой предшественник присутствует предпочтительно в концентрации между 5 и 98% по весу относительно общего веса композиции, более предпочтительно между 50 и 98%, особенно между 80 и 98%. Отдельный предшественник такой, как DHEA, может быть только одним активным ингредиентом, или альтернативно можно использовать множество предшественников и/или их аналогов (например, комбинацию DHEA, DHEA-S, 5-диола или комбинацию двух или более соединений, превращаемых in vivo в DHEA, DHEA-S или 5-диол, или комбинацию DHEA или 5-диола и одного или более их аналогов, которые превращаются в DHEA или 5-диол in vivo, и т.д. Уровень DHEA в крови является конечным критерием адекватной дозировки с учетом индивидуальных различий во всасывании и метаболизме.
Предпочтительно, чтобы лечащий врач, особенно в начале лечения, следил за общей индивидуальной реакцией пациента и уровнем DHEA в сыворотке крови (в сравнении с предпочтительными сывороточными концентрациями, обсужденными выше) и следил за общей ответной реакцией у пациента на лечение, при необходимости регулируя дозы там, где метаболизм или реакция на лечение у данного пациента являются атипичными.
Лечение в соответствии с изобретением является пригодным для неограниченного продолжения. Предполагается, что лечение DHEA и/или 5-диолом будет просто поддерживать уровни DHEA внутри предела, подобного тому, что обычно имеет место у женщин перед менопаузой (концентрация в сыворотке крови между 4 и 10 микрограммами на литр), или обычно у молодых взрослых мужчин (концентрация в сыворотке крови между 4 и 10 микрограммами на литр).
Соединение SERM или бисфосфонат и/или предшественник половых стероидных гормонов можно также вводить пероральным путем и оно может быть составлено в смеси с обычными фармацевтическими эксципиентами, например, высушенной распылением лактозой, микрокристаллической целлюлозой и стеаратом магния, в таблетки или капсулы для перорального введения.
Активное вещество можно включать в ядро таблеток или драже, смешанным с твердыми порошкообразными носителями такими, как цитрат натрия, карбонат кальция или дикальций фосфат, связующими веществами такими, как поливинилпирролидон, желатин или производные целлюлозы, возможно, при добавлении также смазывающих веществ таких, как стеарат магния, лаурилсульфат натрия, “карбовакс” или полиэтиленгликоль. Конечно, в случае форм для перорального введения можно добавить улучшающие вкус вещества.
В качестве дополнительных лекарственных форм, можно использовать капсулы, например, твердые желатиновые, а также закрытые мягкие желатиновые капсулы, включающие смягчитель или пластификатор, например, глицерин. Закрытые капсулы содержат активное вещество предпочтительно в форме гранулята, например, в смеси с наполнителями такими, как лактоза, сахароза, маннит, крахмалы такие, как картофельный крахмал или амилопектин, производные целлюлозы или высокодисперсные кремниевые кислоты. В мягких желатиновых капсулах активное вещество предпочтительно находится в растворенном или суспендированном виде в пригодных жидкостях таких, как растительные масла или жидкие полиэтиленгликоли.
Лосьон, мазь, гель или крем следует тщательно втирать в кожу так, чтобы не было четко видно избытка, и кожу следует не мыть в этом участке, пока не произойдет основное проникновение через кожу, предпочтительно в течение по меньшей мере 4 ч, более предпочтительно по меньшей мере 6 ч.
Трансдермальные пластыри можно использовать для доставки предшественника в соответствии с известными способами. Он обычно наносится на более длительный период времени, например, 1-4 дня, но обычно активный ингредиент контактирует с меньшей площадью поверхности, предоставляя возможность для медленной и непрерывной доставки активного ингредиента.
Ряд систем для доставки лекарственных препаратов через кожу, которые были разработаны и используются, пригодны для доставки активного ингредиента по настоящему изобретению. Скорость высвобождения обычно регулируется диффузией матрицы или прохождением активного ингредиента через регулирующую мембрану.
Механические аспекты трансдермальных устройств хорошо известны в данной области и разъясняются, например, в патентах США 5162037, 5154922, 5135480, 4666441, 4624665, 3742951, 3797444, 4568343, 5064654, 5071644, 5071657, содержание которых здесь включено в качестве ссылки. Дополнительные предпосылки представлены в Европейском патенте 0279982 и Патентной заявке Великобритании 2185187.
Устройство может быть общих типов, известных в данной области, включая устройства для трансдермальной доставки с клейкой матрицей или резервуарного типа. Устройство может включать содержащие лекарственный препарат матрицы, включающие волокна, которые абсорбируют активный ингредиент и/или носитель. В устройстве резервуарного типа резервуар может быть отделен полимерной мембраной, непроницаемой для носителя и активного ингредиента.
В трансдермальном устройстве устройство само по себе поддерживает активный ингредиент в контакте с желаемой локальной поверхностью кожи. В подобном устройстве вязкость носителя для активного ингредиента имеет меньшее значение, чем для крема или геля. Система растворителей для трансдермального устройства может включать, например, олеиновую кислоту, лактат нормального спирта и дипропиленгликоль или другие системы растворителей, известные в данной области. Активный ингредиент может быть растворен или суспендирован в носителе.
Для прикрепления к коже трансдермальный пластырь можно вставить в хирургическую клейкую ленту, имеющую отверстие, проделанное в середине. Клейкая лента предпочтительно покрывается снимающейся прокладкой для защиты до использования. Обычные материалы, пригодные для снижающейся прокладки включают полиэтилен и покрытую полиэтиленом бумагу и предпочтительно покрытую силиконом для простоты удаления. Для нанесения устройства снимающаяся прокладка легко удаляется, и клейкую ленту прикрепляют к коже пациента. В патенте США 5135480, содержание которого включено в качестве ссылки, Bannon et al. описывают альтернативное устройство, имеющее неприклеивающиеся средства фиксации устройства на коже.
Можно также использовать систему для доставки через кожу или слизистые по изобретению в качестве новой и усовершенствованной системы доставки для профилактики и/или лечения остеопороза или других заболеваний, которые благоприятно отвечают на лечение андрогенами и/или эстрогенами.
Селективный модулятор рецепторов эстрогенов по изобретению имеет молекулярную формулу со следующими признаками: а) два ароматических кольца, разделенные 1-2 промежуточными атомами углерода, причем оба ароматических кольца являются незамещенными или замещенными гидроксильной группой или группой, превращаемой in vivo в гидроксил и b) боковая цепь, имеющая ароматическое кольцо и функцией третичного амина или его соль.
Одним предпочтительным SERM по изобретению является ЕМ-800, о котором сообщается в РСТ/СА 96/00097 (WO 96/26201). Молекулярной структурой ЕМ-800 является:
Другим предпочтительным SERM по изобретению является ЕМ-01538:
ЕМ-1538 (также называемый ЕМ-652· НСl) является гидрохлоридом сильного антиэстрогена ЕМ-652 по сравнению с ЕМ-800, ЕМ-1538 является более простой или легкой для синтеза солью. Ее также легко выделить, очистить, она кристаллизуется и проявляет хорошую стабильность в твердом состоянии. Предполагается, что введение как ЕМ-800, так и ЕМ-1538 приводит к образованию одного и того же активного вещества in vivo.
Другие предпочтительные SERM по изобретению включают тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенил-1-бутенил)]-N,N-диметил-этанамин) (предоставляет Zeneca, Великобритания), торемифен (предоставляет Orion-Farmos Pharmaceuicia, Финляндия или Schering-Plough), дролоксифен и СР-336156 (цис-1R-[4′ -пирролидиноэтоксифенил]-2S-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин D-(-)-тартрат) (Pfizer Inc., США), ралоксифен (Eli Lilly and Co., США), LY 335563 и LY 353381 (Eli Lilly and Co., США), йодоксифен (SmithKline Beecham, США), левормелоксифен (3,4-транс-2,2-диметил-3-фенил-4-[4-(2-(2-(пирролидин-1-ил)этокси)фенил]-7-метоксихроман) (Novo Nordisk, A/S, Дания), который раскрывается у Shalmi и др. в WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; и Korsgaard и др. в WO 97/25036), GW 5638 (описанный у Willson et al., Endocrinology, 138(9), 3901-3911, 1997) и производные индола (раскрытые Miller и др. в Европейском патенте 0802183 А1) и TSE 424, разработанный Wyeth Ayers (США) и раскрытый в патенте Японии 10036347 (American home products corporation) и нестероидные эстрогенные производные, раскрытые в WO 97/32837.
Можно применять любой SERM, использованный, как требуется для проявления эффективности, как рекомендуется производителем. Соответствующие дозы известны в данной области. Можно использовать в соответствии с изобретением любой другой нестероидный антиэстроген, имеющийся в продаже; любое соединение, имеющее активность, подобную SERM (пример: можно использовать ралоксифен).
SERM, в соответствии с изобретением, предпочтительно вводят в дозе в пределах 0,01-10 мг/кг массы тела в день (предпочтительно 0,05-1,0 мг/кг) при 5 мг в день, особенно 10 мг в день, в двух равно разделенных дозах являются предпочтительными для человека со средней массой тела при пероральном введении, или в дозе в пределах 0,003-3,0 мг/кг массы тела в день (предпочтительно 0,015-0,3 мг/кг) при 1,5 мг в день, особенно 3,0 мг в день, в двух равно разделенных дозах являются предпочтительными для человека со средней массой тела при парентеральном введении (т.е. внутримышечном, подкожном или чрескожном введении). Предпочтительно SERM назначают вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, как описано ниже.
Предпочтительные бисфосфонаты по изобретению включают алендронат [гидрат динатриевой соли (4-амино-1-гидроксибутилиден)бисфосфоновой кислоты], предоставляет Merck Shape and Dohme под торговым названием Фозамакс; этидронат [(1-гидроксиэтилиден)бисфосфоновая кислота 2,2'-иминобисэтанол], предоставляет Procter and Gamble под торговыми названиями Дидрокал и Дидронел; клодронат [динатриевая соль (дихлорметилен)бисфосфоновой кислоты], предоставляет Rhone-Poulenc Rorer под торговым названием Бонефос или предоставляет Boehringer Mannheim под торговым названием Остак и памидронат (динатриевая соль 3-амино-1-гидроксипропилиден)бисфосфоновой кислоты), предоставляет Geigy под торговым названием Аредиа. Ризедронат (мононатриевая соль 1-гидрокси-2-(3-пиридил)этилиден-бисфосфоновой кислоты) сейчас находится на клиническом изучении. Можно использовать в соответствии с изобретением другие бисфосфонаты, имеющиеся в продаже, все в рекомендуемых производителем дозах. Также предшественники половых стероидных гормонов можно использовать в дозах, рекомендованных предшествующим уровнем техники, предпочтительно в дозах, которые восстанавливают циркулирующие уровни до таковых, как у здоровых мужчин 20-30-летнего возраста или у взрослых женщин в пременопаузе.
В отношении всех рекомендованных здесь доз лечащий врач должен следить за индивидуальной реакцией у пациента и соответственно регулировать дозу.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Крыс-самок Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] получали в возрасте 44-46 дней из Charles River Canada Inc. (St. Constant, Quebec) и распределяли по 2 в клетку в контролируемых условиях по свету (12 ч свет/день; свет в 07:15 ч) и температуре (22± 2° С). Животные получали корм Пурина для грызунов и водопроводную воду без ограничений. Исследования на животных проводили с оборудованием, одобренным Канадским советом по уходу за животными (ССАС), в соответствии с указаниями ССАС по уходу и использованию опытных животных.
Индукция опухолей молочной железы с помощью DMBA
Карциному молочной железы индуцировали при однократном внутрижелудочном введении 20 мг DMBA (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в 1 мл кукурузного масла самкам в возрасте 50-52 дней. Через 2 месяца дважды в неделю проводили измерения опухолей. Фиксировали с помощью штангенциркуля два самых больших перпендикулярных диаметра для установления размера опухоли, как описано (Asselin et al., Endocrinology 101: 666-671, 1977). Регистрировали локализацию, размер и число опухолей.
Обработка
Животных произвольно разделяли на группы, каждая содержащая 20 крыс, за исключением 40 животных в контрольной группе. Животных обрабатывали в течение 282 дней следующим образом: (1) контроль на носители как для DHEA, так и ЕМ-800; (2) ЕМ-800 ((+)-7-пивалоилокси-3-(4′ -пивалоилоксифенил)-4-метил-2-(4″ -(2′ ″ -пиперидиноэтокси) фенил)-2Н-бензопиран) (75 мкг перорально, один раз в день) в 0,5 мл суспензии из 4% этанола, 4% полиэтиленгликоля-600, 1% желатина, 0,9% NaCl); (3) DHEA (10 мг чрескожно, один раз в день) в 0,5 мл 50% этанола, 50% пропиленгликоля и (4) как ЕМ-800, так и DHEA. Лечение начали за 3 дня до перорального введения DMBA. ЕМ-800 синтезировали в отделе медицинской химии лаборатории заявителей, в то время как DHEA закупили в Steraloids Inc., Wilton, NH.
Многие из контрольных животных и некоторые обработанные ЕМ-800 или DHEA были умерщвлены смещением шейных позвонков под анестезией изофлураном через 6 месяцев после введения DMBA вследствие большого размера опухолей. Значения размера и числа опухолей у этих крыс при убое вместе с таковыми, определенными в более поздние интервалы времени у выживших животных, использовали для анализа, проведенного в более поздние сроки, частоты опухолей, среднего числа опухолей на крысу-опухоленоситель и среднего размера опухолей на животное-опухоленоситель. Оставшиеся животные (9 крыс из контроля и 13-19 крыс из каждой другой группы) продолжали получать лечение еще 3 месяца для того, чтобы наблюдать долгосрочную профилактическую эффективность DHEA и ЕМ-800 по отдельности или в комбинации. Крыс умерщвляли через 279 дней после введения DMBA. Сразу же извлекали матку, влагалище и яичники, освобождали от соединительной и жировой ткани и взвешивали.
Отбор и обработка проб
В конце опыта собирали 24-часовые пробы мочи от первых 9 крыс из каждой группы после их пересадки в метаболические камеры (Allentown Caging Equipment Co., Allentown, NJ). Отбирали две пробы мочи и анализировали в различные дни для каждого животного, чтобы свести до минимума влияние суточных вариаций. Следовательно, каждое показанное значение представляет среднее значение из двух определений, проведенных в два различных дня. В пробирки для сбора мочи добавляли 0,5 мл толуола для предотвращения испарения мочи и роста бактерий и регистрировали объем мочи. Кровь из туловища собирали при умерщвлении и давали свернуться при 4° С в течение ночи перед центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин.
Анализ мочи и биохимических показателей сыворотки крови
Свежие пробы использовали для определения креатинина, кальция и фосфора в моче, а также активности общей сывороточной щелочной фосфатазы (оЩФ), холестерина и триглицеридов. Эти биохимические параметры определяли автоматически на химической системе Monarch 2000 (Instrumentation Laboratory Co. Lexington, MA) в условиях доброкачественной лабораторной практики. Гидроксипролин мочи определяли, как описано (Роdenphant et al., Clinica Chimica Acta 142: 145-148, 1984).
Определение кассы костей
Крыс анестезировали вн.бр инъекцией кетамингидрохлорида и диазепама в дозах 50 и 4 мг/кг массы тела, соответственно. Весь скелет и правую бедренную кость сканировали, используя двуэнергетическую рентгеновскую абсорбциометрию (DEXA; QDR 2000-7.10С, Hologic, Waltham, MA), снабженную программным обеспечением Regional High Resolution. Размеры полей равнялись 28,110× 17,805 см и 5,0× 1,902 см, и разрешающая способность составила 0,1511× 0,0761 см и 0,0254× 0,0127 см, в то время как скорости сканирования равнялись 0,3608 и 0,0956 мм/сек для всего скелета и бедренной кости соответственно. Содержание минеральных веществ в костях (ВМС) и минеральную плотность костей (BMD) всего скелета, поясничных позвонков и бедренной кости определяли на снимках, полученных при сканировании.
Статистический анализ
Статистическую значимость определяли по тесту множественных рядов Данкан-Крамера (Biometrics 12: 307-310, 1956). Анализ частоты развития опухолей молочной железы проводили по точному тесту Фишера (Conover, Practical nonparametric statistics, 2nd Edition 153-170, 1980). Данные представляются в виде средних значений±средняя ошибка среднего значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Действие на развитие карциномы молочной железы, индуцированной DMBA
Как показано на фигуре 1 у 95% контрольных мышей развились пальпируемые опухоли молочной железы через 279 дней после введения DMBA. Обработка DHEA или ЕМ-800 частично предотвращала развитие индуцированной DMBA карциномы молочной железы, и частота, таким образом, снизилась до 57% (р&λτ; 0,01) и 38% (р&λτ; 0,01), соответственно. Интересно, что комбинация двух соединений привела к достоверно более высокому тормозящему эффекту, чем таковые, полученные с каждым соединением в отдельности (р&λτ; 0,01 против только DHEA или только ЕМ-800). Фактически только две опухоли, развившиеся в группе животных, обработанных обоими соединениями, исчезли перед окончанием опыта.
Обработка DHEA или ЕМ-800 снизила среднее число опухолей на животное-опухоленоситель с 4,7± 0,5 опухолей у контрольных животных до 3,4± 0,7 (незначимо) и 1,4± 0,3 (р&λτ; 0,01) опухолей/животное, соответственно, в то время как у животных, получавших оба препарата, не обнаружили опухолей в конце опыта (р&λτ; 0,01 против трех других групп) (фиг.2А). Одна из двух опухолей, которая позднее исчезла, имелась с 79 по 201 день после введения DMBA, в то время как другая опухоль пальпировалась с 176 по 257 день. На фиг.2В видно, что только DHEA или только ЕМ-800 снижали среднюю площадь опухоли в расчете на животное-опухоленоситель с 12,8± 1,3 см2 в конце опыта до 10,2± 2,1 см2 (незначимо) и 7,7± 1,8 см2 (незначимо), соответственно, в то время как комбинированное лечение привело к 0-значению (р&λτ; 0,01 против трех других групп). Две опухоли, развившиеся в группе животных, обработанных как DHEA, так и ЕМ-800, не выросли больше, чем 1 см2. Следует отметить, что реальные значения средней площади опухолей, а также среднее число опухолей на животное-опухоленоситель в контрольной группе должны быть выше, чем значения, представленные на фигуре 2, поскольку многие крысы были вынужденно умерщвлены перед концом опыта вследствие избыточного размера опухолей. Значения, определенные во время умерщвления, были таким образом включены как таковые в расчеты, сделанные в более поздние периоды времени для того, чтобы свести до минимума смещения в контрольной группе, которые в любом случае оставались достоверно выше по сравнению с другими группами.
Действие на кости
Длительное чрескожное введение DHEA крысам-самкам приводило к повышению на 6,9% (р&λτ; 0,01), 10,6% (р&γτ; 0,05) и 8,2% (р&λτ; 0,01) минеральной плотности костей (BMD) всего скелета, поясничных позвонков и бедренной кости, соответственно (таблица 2). С другой стороны, не было установлено достоверных изменений у животных, которым вводили ЕМ-800. Кроме того, когда одновременно вводили оба соединения, полученные значения были сравнимы с одним DHEA.
Обработка DHEA увеличивала активность общей щелочной фосфатазы в сыворотке крови (оЩФ) на 74% (р&λτ; 0,05), но не оказала эффекта на суточное выделение кальция и фосфора с мочой и на соотношение гидроксипролина к креатинину (таблица 3). С другой стороны, обработка ЕМ-800 снизила соотношение гидроксипролина к креатинину в моче на 48% (р&λτ; 0,01), но не имела значимого влияния на суточное выделение кальция или фосфора с мочой и активность оЩФ в сыворотке крови. Комбинация DHEA и ЕМ-800 привела к повышению активности сывороточной оЩФ (р&λτ; 0,01) аналогично эффекту, достигаемому только DHEA, и уменьшила соотношение гидроксипролина к креатинину на 69%, значение достоверно более низкое (р&λτ; 0,01), чем таковое, достигнутое только ЕМ-800. Кроме того, комбинация двух препаратов значимо снизила суточное выделение кальция и фосфора, соответственно, на 84% (р&λτ; 0,01) и 56% (р&λτ; 0,01), в то время как достоверного изменения не наблюдали с каждым препаратом по отдельности (таблица 3).
Действие на уровни липидов в сыворотке крови
Длительное введение ЕМ-800 привело к снижению уровней триглицеридов и холестерина в сыворотке крови на 72% (р&λτ; 0,01) и 45% (р&λτ; 0,01) соответственно, в то время как длительное введение DHEA уменьшило уровни триглицеридов в сыворотке крови на 60% (р&λτ; 0,01), концентрации холестерина остались без изменений. Более того, у животных, обработанных обоими ЕМ-800 и DHEA, было установлено, что концентрации триглицеридов и холестерина снизились на 42% (р&λτ; 0,01) и 52% (р&λτ; 0,01) (фигура 3).
Пример 2
Резюме
В молочной железе андрогены образуются из предшественника стероидов дегидроэпиандростерона (DHEA). Клинические данные указывают, что андрогены оказывают тормозящее действие на рак молочной железы. Эстрогены, с другой стороны, стимулируют развитие и рост рака молочной железы. Заявители изучали действие только DHEA или в сочетании с вновь описанным чистым антиэстрогеном, ЕМ-800, на рост опухолевых ксенотрансплантатов, развившихся из линии раковых клеток молочной железы человека ZR-75-1 у голых мышей с удаленными яичниками.
Мышам ежедневно вводили подкожно 0,5 мкг эстрона (эстрогенного гормона) сразу же после овариэктомии. ЕМ-800 вводили перорально, один раз в день (15, 50 и 100 мкг).
Дважды в день (общая доза 0,3, 1,0 или 3,0 мг) на кожу спины наносили либо только DHEA, либо в сочетании с 15 мкг ежедневно пероральной дозой ЕМ-800. Изменения в размере опухолей в ответ на лечение оценивали периодически по отношению к измерениям, проведенными в первый день. В конце опытов опухоли извлекали и взвешивали.
У мышей с удаленными яичниками, получавшими только эстрон, наблюдали увеличение размера опухолей в 9,4 раза в течение 9,5 месяцев по сравнению с мышами, не получавшими эстрон. Введение мышам с удаленными яичниками ЕМ-800 в дозах 15, 50 или 100 мкг при добавлении эстрона привело к уменьшению размера опухоли соответственно на 88%, 93% и 94%. С другой стороны, DHEA в дозах 0,3, 1,0 или 3,0 мг снизил конечную массу опухолей, соответственно, на 67%, 82% и 85%. Сравнимое уменьшение размера опухолей получали с ЕМ-800 в его суточной дозе 15 мкг перорально с или без DHEA в различных дозах чрескожно.
DHEA и ЕМ-800 независимо подавляли рост стимулированных эстроном мышиных ксенотрансплантантных опухолей ZR-75-1 у голых мышей. Введение DHEA в определенных дозах не изменило тормозящего действия ЕМ-800.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки ZR-75-1
Раковые клетки молочной железы человека ZR-75-1 получали из Американской типовой культурной коллекции (Rockville, MD) и обычно культивировали в виде монослоев в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ME пенициллина/мл, 100 мкг стрептомицина/мл и 10% фетальной бычьей сыворотки во влажной атмосфере 95% воздуха/5% CO2 при 37° С, как описано (Poulin and Labrie, Cancer Res. 46: 4933-4937, 1986; Poulin et al., Breast Cancer Res. Treat. 12: 213-225, 1988). Клетки пассажировали каждую неделю после обработки смесью 0,05% трипсин: 0,02% ЭДТА (вес/объем). Клеточные культуры, использованные для опытов, описанных в этом отчете, получали с 93 пассажа клеточной линии ZR-75-1.
Животные
Мышей-самок атимусных гомозиготов Харлан Sprague-Dawley (ну/ну) (в возрасте 28-42 дней) получали от HSD (Indianapolis, Indiana, США). Мышей размещали в виниловые клетки с крышками, снабженными воздушным фильтром, и содержали в условиях с ограниченным доступом патогенов. Клетки, подстилки и корма автоклавировали перед использованием. Воду автоклавировали, подкисляли до рН 2,8 и обеспечивали ею животных без ограничений.
Перевивка клеток
Мышам проводили двухстороннюю овариэктомию (OVX) за неделю до инокуляции опухолевых клеток под анестезией, проводимой внутрибрюшинной инъекцией 0,25 мл/животное авертина (амиловый спирт:0,8 г/100 мл 0,9% NaCl и трибромэтанол:2 г/100 мл 0,9% NaCl). В логарифмической фазе роста собирали 1,5× 106 клеток ZR-75-1 после обработки монослоя составом 0,05% трипсин/0,02% ЭДТА (вес/объем), суспендировали в 0,1 мл культуральной среды, содержащей 25% матригеля, и инокулировали подкожно в оба бока животных, используя длинную 1-дюймовую иглу размера 20, как описано ранее (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Для того чтобы облегчить рост опухолей, каждому животному ежедневно подкожной инъекцией вводили 10 мкг эстрадиола (Е2) на носителе, состоящем из 0,9% NaCl, 5% этанола, 1% желатина, в течение 5 недель. После появления пальпируемых опухолей ZR-75-1 с помощью штангенциркуля измеряли диаметр опухолей и отбирали для этого опыта мышей, имеющих диаметр опухолей между 0,2 и 0,7 см.
Обработка гормонами
Все животные, за исключением контрольной группы с удаленными яичниками OVX, получали ежедневно подкожной инъекцией по 0,5 мкг эстрона (E1) в 0,2 мл 0,9% NaCl, 5% этанола, 1% желатина. В указанных группах DHEA вводили подкожно дважды в день в дозах 0,3, 1,0 или 3,0 мг/животное, нанося в объеме 0,02 мл на кожу спины с наружной стороны участка роста опухоли. DHEA растворяли в смеси 50% этанол-50% пропиленгликоль. ЕМ-800 ((+)-7-пивалоилокси-3-(4'-пивалоилоксифенил)-4-метил-2-(4″ -(2′ ″ -пиперидиноэтокси) фенил)-2Н-бензопиран) синтезировали, как описано ранее (Gauthier et al., J.Med. Chem. 40: 2117-2122, 1997), в отделе медицинской химии лаборатории молекулярной эндокринологии исследовательского центра CHUL. ЕМ-800 растворяли в смеси 4% (объем/объем) этанол, 4% (объем/объем) полиэтиленгликоль (ПЭГ) 600, 1% (вес/объем) желатин, 0,9% (вес/объем) NaCl. Животные указанных групп ежедневно получали перорально только ЕМ-800 в дозах 15 мкг, 50 мкг или 100 мкг или в сочетании с DHEA, в то время как группа животных с удаленными яичниками получала толко носитель (0,2 мл 4% этанол, 4% ПЭГ 600, 1% желатин, 0,9% NaCl). Опухоли измеряли один раз в неделю с помощью штангенциркуля Вернье. Регистрировали два перпендикулярных диаметра в см (L и W) и высчитывали площадь опухоли (см2) по формуле: L/2× W/2× π (Dauvois et al., Cancer Res. 51: 3131-3135, 1991). Площадь, определенная в первый день лечения, была принята за 100%, и изменения в размере опухоли выражали в виде процента от первоначальной площади. В целом в случае подкожных опухолей невозможно точно оценить трехмерный объем опухоли, следовательно, определяли только площадь опухолей. Через 291 день (или 9,5 месяцев) лечения животных умертвляли.
Категории ответных реакций оценивали, как описано (Dauvois et al., Breast Cancer Res. Treat. 14: 299-306, 1989; Dauvois et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 25: 891-897, 1989; Labrie et al., Breast Cancer Res. Treat. 33: 237-244, 1995). Кратко: частичная регрессия соответствует опухолям, у которых регрессия равнялась или составила более 50% от их исходного размера, стабильная ответная реакция относится к опухолям, которые регрессировали менее, чем на 50% от их исходного размера или прогрессировали менее, чем на 50% от их исходного размера, в то время как полная регрессия относится к тем опухолям, которые не детектировались в конце лечения. Прогрессирование относится к опухолям, которые прогрессировали более, чем на 50% по сравнению с исходным размером. В конце опыта всех животных умертвляли декапитацией. Сразу же извлекали опухоли, матку и влагалище, освобождали от соединительной и жировой ткани и взвешивали.
Статистический анализ
Статистическую значимость воздействия обработок на размер опухолей оценивали, используя дисперсионный анализ (ANOVA), оценивая действие DHEA, ЕМ-800 и время, и повторные измерения, проведенные у одних и тех же животных в начале и конце обработки (субъекты внутригруппового фактора). Повторные измерения на время 0 и через 9,5 месяцев лечения составляют рандомизированные группы животных. Таким образом, время анализировали, как внутригрупповой эффект, в то время как два вида обработок оценивали, как межгрупповые эффекты. Все взаимодействия между основными эффектами были включены в модель. Значимость факторов обработки и их взаимодействия анализировали, используя субъекты внутри группы в качестве ошибки. Данные переводили в логарифмические значения. В гипотезах, лежащих в основе ANOVA, принимается нормальный характер разности и однородности изменений.
Последующие парные сравнения проводили, используя тест Фишера для наименьшего значимого различия. Основные эффекты и воздействия обработок на вес тела и вес органов анализировали стандартным двусторонним ANOVA с обменом данными. Все ANOVA проводили, используя программу SAS (Институт SAS, NC, США). Значимость различий находили, используя 2-концевой тест с общим уровнем 5%.
Данные по категориям анализировали тестом Kruskall-Wallis для изменений упорядоченных по категориям ответных реакций (полная ответная реакция, частичная ответная реакция, стабильная ответная реакция и прогрессирование опухоли). После полной оценки эффектов обработок, субряды результатов, представленные в таблице 4, анализировали, подводя критическое р-значение для множественных сравнений. Точные р-значения высчитывали, используя программу StatXact (Cytel, Cambridge, МА, США).
Данные выражаются в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего значения (SEM) из 12-15 мышей в каждой группе.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как показано на фигуре 4А, опухоли человека ZR-75-1 увеличились в 9,4 раза в течение 291 дня (9,5 месяцев) у голых мышей с удаленными яичниками, которым ежедневно вводили 0,5 мкг подкожно эстрона, в то время как у контрольных мышей с удаленными яичниками, получавшими только носитель, размер опухолей снизился на 36,9% от исходного размера во время опыта.
Лечение возрастающими дозами DHEA чрескожно вызвало прогрессивное торможение роста опухолей ZR-75-1, стимулированных E1. В течение 9,5 месяцев лечения торможение составило 50,4%, 76,8% и 80,0% соответственно с дозами DHEA 0,3 мг, 1,0 мг и 3,0 мг ежедневно на животное (фиг.4А). Согласуясь со снижением общей опухолевой нагрузки, обработка DHEA привела к заметному снижению среднего веса опухолей, оставшихся в конце опыта. Фактически средний вес опухолей уменьшился с 1,12± 0,26 г в контроле у голых мышей с удаленными яичниками при добавлении E1 до 0,37± 0,12 г (р=0,005), 0,20± 0,06 г (р=0,001) и 0,17± 0,06 г (р=0,0009) в группах животных, получавших ежедневно 0,3, 1,0 и 3,0 мг DHEA, соответственно (фиг.4В).
При ежедневных дозах 15 мкг, 50 мкг и 100 мкг антиэстроген ЕМ-800 уменьшил размер опухолей, стимулированных эстрогеном, соответственно, на 87,5% (р&λτ; 0,0001), 93,5% (р&λτ; 0,0001) и 94% (р=0,0003) (фиг.5А) по сравнению с размером опухолей у контрольных животных за 9,5 месяцев.
Снижение размера опухолей, достигаемое с тремя дозами ЕМ-800, не различалось значимо друг от друга. Как показано на фиг.4В, вес опухолей в конце 9,5-месячного опыта снизился с 1,12± 0,26 г у контрольных мышей с удаленными яичниками при добавлении E1 до 0,08± 0,03 г, 0,03± 0,01 г и 0,04± 0,03 г у животных, получавших ЕМ-800 в ежедневных дозах 15 мкг, 50 мкг и 100 мкг соответственно (р&λτ; 0,0001 для всех доз ЕМ-800 против OVX с добавлением E1).
Как упоминалось выше, антиэстроген ЕМ-800 в ежедневной пероральной дозе 15 мкг привел к 87,5% торможению стимулированного эстроном роста опухолей за 9,5 месяцев. Добавление DHEA в трех использованных дозах не имело значимого эффекта на уже заметное снижение размера опухолей, достигнутое антиэстрогеном ЕМ-800, в ежедневной дозе 15 мкг (фиг.5В). Таким образом, вес опухолей заметно снизился с 1,12± 0,26 г у контрольных мышей с добавлением эстрона до 0,08± 0,03 г (р&λτ; 0,0001), 0,11± 0,04 г (р=0,0002), 0,13± 0,07 г (р=0,0004) и 0,08± 0,05 г (р&λτ; 0,0001) у животных, получавших ежедневно дозу 15 мкг одного антиэстрогена или в сочетании с 0,3, 1,0 и 3,0 мг дозами DHEA, соответственно (не было отмечено значимого различия между 4 группами) (фиг.4В).
Также представляется интересным оценить категории ответных реакций, достигаемых при вышеуказанных обработках. Так, обработка возрастающими дозами DHEA снизила, хотя, и не до уровня статистической значимости (р=0,088), число прогрессирующих опухолей с 87,5% у контрольных OVX животных с добавлением эстрона до значений 50,0%, 53,3% и 66,7% у животных, обработанных DHEA в ежедневных дозах 0,3, 1,0 и 3,0 мг (таблица 4). С другой стороны, полные ответные реакции увеличились с 0% у мышей с добавлением эстрона до 28,6%, 26,7% и 20,0% у животных, получавших чрескожно DHEA в ежедневных дозах 0,3, 1,0 и 3,0 мг. Стабильные ответные реакции, с другой стороны, определяли на уровне 12,5%, 21,4% и 13,3% у контрольных мышей при добавлении E1 и в трех группах животных, получавших вышеуказанные дозы DHEA, соответственно. У контрольных мышей с удаленными яичниками доли полной, частичной и стабильной ответных реакций определяли на уровне 68,8%, 6,2% и 18,8%, соответственно, в то время как прогрессирование было найдено только у 6,2% опухолей (таблица 4).
Полные ответные реакции или исчезновение опухолей было достигнуто у 29,4%, 33,3%, 26,7% и 35,3% опухолей у животных, которые получали только антиэстроген ЕМ-800 (р=0,0006) (15 мкг) или в сочетании с DHEA в дозах 0,3 мг, 1,0 мг или 3,0 мг, соответственно (таблица 4). С другой стороны, прогрессирование было обнаружено у 35,3%, 44,4%, 53,3% и 17,6% опухолей, соответственно, в тех же группах животных. Отсутствует статистически значимое различие между группами, получавшими только ЕМ-800 или в сочетании с DHEA.
Не наблюдали значимого эффекта обработки DHEA или ЕМ-800 на вес тела по отношению к весу опухолей. Обработка OVX мышей эстроном увеличила вес матки с 28± 5 мг у OVX контрольных мышей до 132± 8 мг (р&λτ; 0,01), в то время как возрастающие дозы DHEA вызвали прогрессивное, но относительно незначительное торможение стимулирующего эффекта эстрона, который достиг 26% (р=0,0008) при самой высокой использованной дозе DHEA. На той же фигуре можно увидеть, что вес стимулированной эстроном матки снизился со 132± 8 мг у контрольных мышей с добавлением эстрона до 49± 3 мг, 36± 2 мг и 32± 1 мг (р&λτ; 0,0001 при всех дозах против контроля) при ежедневном пероральном введении ЕМ-800 в дозах 15 мкг, 50 мкг или 100 мкг (общее значение р&λτ; 0,0001) соответственно. При пятнадцати микрограммах (15 мкг) ЕМ-800 в сочетании с 0,3 мг, 1,0 мг или 3,0 мг ежедневными дозами DHEA, вес матки равнялся, соответственно, 46± 3 мг, 59± 5 мг и 69± 3 мг.
С другой стороны, обработка эстроном увеличила вес влагалища с 14± 2 мг у OVX животных до 31± 2 мг (р&λτ; 0,01), в то время как добавление DHEA не имело значимого эффекта. Вес влагалища затем снизился до 23± 1 мг, 15± 1 мг и 11± 1 мг после обработки ЕМ-800 в ежедневных дозах 15 мкг, 50 мкг или 100 мкг, соответственно (общее значение р и парное р&λτ; 0,0001 при всех дозах против контроля). В комбинации DHEA с ЕМ-800 в дозах 0,3 мг, 1,0 мг или 3,0 мг вес влагалища составил 22± 1 мг, 25± 2 мг и 23± 1 мг, соответственно (недостоверно для всех групп против 15 мкг ЕМ-800). Следует отметить, что при самой высокой использованной дозе, а именно 100 мкг в день, ЕМ-800 уменьшил вес матки у OVX животных с добавлением эстрона до значения, не отличавшегося от такового у OVX контроля, в то время как вес влагалища снизился до значения ниже такового у OVX контрольных мышей (р&λτ; 0,05). DHEA, возможно, за счет андрогенного эффекта, частично снимает действие ЕМ-800 на вес матки и влагалища.
E1 - эстрон; DHEA - дегидроэпиандростерон; OVX - с удаленными яичниками
Пример 3
Действие предпочтительного соединения по изобретению на уровни холестерина у крыс-самок с удаленными яичниками
Животные и обработка
Использовали крыс-самок Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Канада) 50-60-дневного возраста с весом примерно 190 г на время овариэктомии. Животных акклиматизировали к окружающим условиям (температура: 22± 3° С, влажность: 50± 20%, циклы 12 ч свет - 12 ч темнота, свет в 07:15 ч) в течение 1 недели перед операцией. Животных разместили по три в клетку и вволю давали водопроводную воду и гранулированный сертифицированный корм для грызунов (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, МО). Опыт проводили с оборудованием, одобренным Канадским советом по уходу за животными (ССАС), в соответствии с указаниями ССАС по уходу и использованию опытных животных.
136 крыс-самок подвергали овариэктомии под анестезией изофлураном на 0 день опыта и произвольно распределяли на 17 групп животных для проведения исследования, расписанного ниже:
Группа 1: с удаленными яичниками контроль
Группа 2: с удаленными яичниками + ЕМ-800 (0,01 мг/кг перорально, в день)
Группа 3: с удаленными яичниками + ЕМ-800 (0,03 мг/кг перорально, в день)
Группа 4: с удаленными яичниками + ЕМ-800 (0,1 мг/кг перорально, в день)
Группа 5: с удаленными яичниками + ЕМ-800 (0,3 мг/кг перорально, в день)
Группа 6: с удаленными яичниками + ЕМ-800 (1 мг/кг перорально, в день)
Группа 7: с удаленными яичниками + ЕМ-01538 (0,01 мг/кг перорально, в день)
Группа 8: с удаленными яичниками + ЕМ-01538 (0,03 мг/кг перорально, в день)
Группа 9: с удаленными яичниками + ЕМ-01538 (0,1 мг/кг перорально, в день)
Группа 10: с удаленными яичниками + ЕМ-01538 (0,3 мг/кг перорально, в день)
Группа 11: с удаленными яичниками + ЕМ-01538 (1 мг/кг перорально, в день)
Группа 12: с удаленными яичниками + ралоксифен (ЕМ-1105) (0,01 мг/кг перорально, в день)
Группа 13: с удаленными яичниками + ралоксифен (ЕМ-1105) (0,03 мг/кг перорально, в день)
Группа 14: с удаленными яичниками + ралоксифен (ЕМ-1105) (0,1 мг/кг перорально, в день)
Группа 15: с удаленными яичниками + ралоксифен (ЕМ-1105) (0,3 мг/кг перорально, в день)
Группа 16: с удаленными яичниками + ралоксифен (ЕМ-1105) (1 мг/кг перорально, в день)
Группа 17: интактный контроль.
Введение препаратов начинали на 10-й день опыта и проводили зондом для перорального введения один раз в день до 13-го дня опыта. Суспензии для введения готовили в 0,4% метилцеллюлозе и концентрацию доводили до среднего веса тела по группе, зарегистрированной на 10-й день опыта, для того, чтобы вводить по 0,5 мл суспензии на крысу. Примерно через 24 ч после последнего введения, выдержанных голодными в течение ночи животных, умерщвляли обескровливанием при венопункции брюшной аорты под анестезией изофлураном и пробы крови обрабатывали для получения сыворотки. Извлекали матку, освобождали от оставшегося жира и взвешивали.
Анализ уровней холестерина и триглицеридов в сыворотке крови
Общие концентрации холестерина и триглицеридов определяли, используя Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems.
Пример 4
Андростен-3β ,17β -диол (5-диол) обладает присущей эстрогенной активностью. Кроме того, как предшественник половых стероидных гормонов, он может превращаться в активные андрогены и/или другие эстрогены в периферических интракринных тканях. Для того чтобы оценить относительное значение андрогенных и эстрогенных составляющих действия 5-диола в отношении костной массы, крысы в возрасте 21 недели были подвергнуты овариэктомии и их обрабатывали чрескожно один раз в день 2,5 или 12,5 мг только 5-диола или в комбинации с антиандрогеном флутамидом (FLU, 10 мг, ч.к., один раз в день) и/или антиэстрогеном ЕМ-800 (100 мкг, ч.к., один раз в день) в течение 12 месяцев. Минеральную плотность костей (BMD) определяли через 11 месяцев обработки. Овариэктомия (OVX) привела к снижению на 12,8% BMD бедренной кости (р&λτ; 0,01), в то время как введение 5-диола в самой высокой дозе восстановило на 34,3% BMD для бедренной кости, претерпевшей снижение в течение 11 месяцев после OVX (р&λτ; 0,01). Одновременное введение с FLU полностью сняло стимулирующее действие 5-диола на BMD бедренной кости, в то время как добавление ЕМ-800 привело к дополнительной стимуляции на 28,4% по сравнению с действием одного 5-диола. При одновременном введении 5-диола, FLU и ЕМ-800 проявилось только действие ЕМ-800 (27%), поскольку эффект 5-диола был полностью блокирован FLU. Сравнимые результаты получили с BMD поясничных позвонков, хотя, BMD поясничных позвонков у OVX крыс, получавших 12,5 мг только 5-диола, 12,5 мг 5 диола+ЕМ-800 или 12,5 мг 5-диола+FLU+ЕМ-800, восстановилось до значений значимо не отличавшихся от таковых у интактных животных. Гистоморфометрический анализ показал, что стимулирующие эффекты 5-диола в отношении объема губчатого вещества костей, числа трабекул и ингибирующее действие на разъединение трабекул вторичного губчатого вещества в метафизе проксимальной части большеберцовой кости снимаются FLU, но дополнительно усиливаются ЕМ-800. Заметная стимуляция активности сывороточной щелочной фосфатазы, полученная после обработки 5-диолом, составила 57% (р&λτ; 0,01 против 12,5 мг только 5-диола) и снимается при одновременном введении с FLU. Лечение 5-диолом не имело статистически значимого ингибирующего действия на соотношение гидроксипролина к креатинину в моче. Самая высокая доза 5-диола вызывала значимое снижение на 23% (р&λτ; 0,01) сывороточного холестерина, в то время как добавление ЕМ-800 уменьшило концентрацию сывороточного холестерина на 62% (р&λτ; 0,01). Настоящие данные четко показывают стимулирующий эффект 5-диола на формирование костей, и на их основании можно предположить, что, несмотря на то, что 5-диол является слабым эстрогеном, его стимулирующее действие на формирование костей преимущественно осуществляется через андрогенный эффект. Кроме того, аддитивные стимулирующие эффекты ЕМ-800 и 5-диола на массу костей показывают костьсберегающее действие антиэстрогена ЕМ-800 у крыс. Холестерин-понижающая активность 5-диола и ЕМ-800 может быть интересной при использовании для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний.
Пример 6
Пример синтеза предпочтительного соединения по изобретению
Синтез (S)-(+)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -(2′ ″ -пиперидиноэтокси)фенил)-2Н-1-бенэопиран гидрохлорида ЕМ-01538 (ЕМ-652· НСl)
Стадия A: BF3·Et2O, толуол; 100° С; 1 ч.
Стадия С: 3,4-дигидропиран, п-толуолсульфоновая кислота моногидрат, этилацетат; 25° С в атмосфере азота, 16 ч и затем кристаллизация в изопропаноле.
Стадия D, Е и F:
1) пиперидин, толуол, аппарат Дин-Старка, кипячение с обратным холодильником в атмосфере азота; 2) 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундек-7-ен, ДМФА, кипячение с обратным холодильником в течение 3 ч; 3) СН3МgСl, ТГФ, -20 до 0° С и затем комнатная температура в течение 24 ч.
Стадия G, H: (1S)-(+)-10-камфорсульфоновая кислота, ацетон, вода, толуол, комнатная температура, 48 ч.
Стадия НН: 95% этанол, 70° С, затем комнатная температура в течение 3 дней.
Стадия HHR: рециркуляция маточного раствора и промывание продукта со стадии НН, (S)-10-камфорсульфоновая кислота, кипячение с обратным холодильником; 36 ч, затем комнатная температура в течение 16 ч.
Стадия I:
1) ДМФА водн., Na2CO3, этилацетат;
2) этанол, разбавленная НСl;
3) вода.
Синтез 2-тетрагидропиранилокси-4-гидрокси-2′ -(4′ ″ -тетра-гидропиранилоксифенил)ацетофенона (4). Суспензию 2,4-дигидрокси-2′ -(4″ -гидроксифенил)ацетофенона 3 (97,6 г, 0,4 моль) (предоставляет Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Канзас) в 3,4-дигидропиране (218 мл, 3,39 моль) и этилацетате (520 мл) обрабатывали моногидратом п-толуолсульфоновой кислотой (0,03 г, 0,158 ммоль) примерно при 25° С. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере азота без внешнего нагревания в течение примерно 16 ч. Затем смесь промывали раствором бикарбоната натрия (1 г) и хлоридом натрия (5 г) в воде (100 мл). Фазы разделяли и органическую фазу промывали рассолом (20 мл). Каждую промывную фракцию вновь экстрагировали 50 мл этилацетата. Все органические фазы объединяли и профильтровывали через сульфат натрия.
Растворитель (примерно 600 мл) удаляли отгонкой при атмосферном давлении и добавляли изопропанол (250 мл). Дополнительный растворитель (примерно 300 мл) отгоняли при атмосферном давлении и добавляли изопропанол (250 мл). Дополнительный растворитель (примерно 275 мл) отгоняли при атмосферном давлении и добавляли изопропанол (250 мл). Раствор охлаждали примерно до 25° С при перемешивании и примерно через 12 ч отфильтровывали кристаллическое твердое вещество, промывали изопропанолом и сушили (116,5 г, 70%).
Синтез 4-гидрокси-4-метил-2-(4′ -[2″ -пиперидино]этокси)фенил-3-(4′ ″ -тетрагидропиранилокси)фенил-7-тетрагидропиранилоксихромана (10). Раствор 2-тетрагидропиранилокси-4-гидрокси-2′ -(4″ -тетрагидропиранилоксифенил)ацетофенона 4 (1 кг, 2,42 моль), 4-[2-(1-пиперидино)этокси]бензальдегида 5 (594 г, 2,55 моль) (предоставляет Chemsyn Science Laboratories, Lenaxa, Канзас) и пиперидина (82,4 г, 0,97 моль) (предоставляет Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) в толуоле (8 л) кипятили с обратным холодильником в атмосфере азота с аппаратом Дин-Старка, пока не собрали один эквивалент воды (44 мл).
Толуол (6,5 л) удаляли из раствора отгонкой при атмосферном давлении. Добавляли диметилформамид (6,5 л) и 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен (110,5 г, 0,726 моль).
Раствор перемешивали примерно в течение 8 ч при комнатной температуре для изомеризации халкона 8 в хроманон 9 и затем добавляли смесь воды со льдом (8 л) и толуол (4 л). Фазы разделяли и толуольный слой промывали водой (5 л). Объединенные промывные водные фракции экстрагировали толуолом (3× 4 л). Объединенные толуольные экстракты окончательно промывали рассолом (3× 4 л), концентрировали при атмосферном давлении до 5,5 л и затем охлаждали до -10° С.
При непрерывном внешнем охлаждении и перемешивании в атмосфере азота добавляли 3 М раствор хлорметилмагния в ТГФ (2,5 л, 7,5 моль) (предоставляет Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.), поддерживая температуру ниже 0° С. После всего добавляли реактив Гриньяра, прекращали внешнее охлаждение и смеси давали нагреться до комнатной температуры. Смесь перемешивали при этой температуре в течение 24 ч.
Смесь снова охлаждали примерно до -20° С и при непрерывном внешнем охлаждении и перемешивании медленно добавляли насыщенный раствор хлорида аммония (200 мл), поддерживая температуру ниже 20°С. Смесь перемешивали в течение 2 ч и затем добавляли насыщенный раствор хлорида аммония (2 л) и толуола (4 л) и перемешивали в течение 5 мин. Фазы разделили и водный слой экстрагировали толуолом (2× 4 л). Объединенные толуольные экстракты промывали разбавленной соляной кислотой, пока раствор не становился гомогенным, и затем рассолом (3× 4 л). Толуольный раствор окончательно концентрировали при атмосферном давлении до 2 л. Этот раствор непосредственно использовали на следующей стадии.
Синтез соли (2R, S)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -[2′ ″ -пиперидино]этокси)фенил)-2Н-1-бензопиран (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты (± 12). К толуольному раствору 4-гидрокси-4-метил-2-(4′ -[2″ -пиперидино]этокси)фенил-3-(4′ ″ -тетрагидропиранилокси)фенил-7-тетрагидропиранилоксихромана (10) добавляли ацетон (6 л), воду (0,3 л) и (S)-10-камфорсульфоновую кислоту (561 г, 2,42 моль) (имеется у Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.). Смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 48 ч, после этого времени твердую соль (2R, S)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -[2′ ″ -пиперидино]этокси)фенил)-2Н-1-бензопиран (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты (12) отфильтровывали, промывали ацетоном и сушили (883 г). Это вещество использовали на следующей (НН) стадии без дополнительной очистки.
Синтез соли (2S)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -[2′ ″ -пиперидино]этокси)фенил)-2Н-1-бекзопиран (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты (13, (+)-ЕМ-652(1S)-CSA соль).
Суспензию соли (2R, S)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -[2′ ″ -пиперидино]этокси)фенил)-2Н-1-бензопиран (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты ± 12 (759 г) в 95% этаноле нагревали при перемешивании примерно до 70° С, пока не растворялось твердое вещество. Раствору давали охладиться до
комнатной температуры при перемешивании, затем вносили затравку из нескольких кристаллов соли (2S)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -[2′ ″ -пиперидино]этокси)фенил)-2Н-1-бензопиран (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты 13. Раствор перемешивали при комнатной температуре в целом в течение трех суток. Кристаллы отфильтровывали, промывали 95% этанолом и сушили (291 г, 76%). Выход продукта составил 94,2% и чистота 98,8%.
Синтез (S)-(+)-7-гидрокси-3-(4′ -гидроксифенил)-4-метил-2-(4″ -(2′ ″ -пиперидиноэтокси)фенил)-2Н-1-бензопирана гидрохлорида ЕМ-01538 (EM-652· HCl). Суспензию соли соединения 13 (ЕМ-652-(+)-CSA, соль, 500 мг, 0,726 ммоль) в диметилформамиде (11 мкл, 0,15 ммоль) обрабатывали 0,5 М водным раствором карбоната натрия (7,0 мл, 3,6 ммоль) и перемешивали в течение 15 мин. Суспензию обрабатывали этилацетатом (7,0 мл) и перемешивали в течение 4 ч. Органическую фазу затем промывали водным насыщенным раствором карбоната натрия (2× 5 мл) и рассолом (1× 5 мл), сушили над сульфатом магния и концентрировали. Раствор полученной розовой пены (ЕМ-652) в этаноле (2 мл) обрабатывали 2 N соляной кислотой (400 мкл, 0,80 ммоль), перемешивали в течение 1 ч, обрабатывали дистиллированной водой (5 мл) и перемешивали в течение 30 мин. Полученную суспензию профильтровывали, промывали дистиллированной водой (5 мл), сушили на воздухе и в глубоком вакууме (65° С) с получением кремового порошка (276 мг, 77%): мелкий, не совсем белый порошок; сканирующая калориметрия: начало пика плавления при 219° С, Δ Н=83 Дж/г; 
в метаноле 10 мг/мл; 1Н ЯМР (300 МГц, СD3OD) δ (м.д.) 1,6 (широкий, 2Н, Н-4′ ″ ), 1,85 (широкий, 4Н, Н-3″ ″ и 5″ ″ ), 2,03 (с, 3Н, СН3), 3,0 и 3,45 (широкий, 4Н, Н-2″ ″ и 6″ ″ ), 3,47 (т, J=4,9 Гц, 2Н, Н-3′ ″ ), 4,26 (т, J=4,9 Гц, 2Н, Н-2′ ″ ), 5,82 (с, 1Н, Н-2), 6,10 (д, J=2,3 Гц, 1Н, Н-8), 6,35 (дд, J=8,4, 2,43 Гц, 1Н, Н-6), 6,70 (д, J=8,6 Гц, 2Н, Н-3′ и Н-5′ ), 6,83 (д, J=8,7 Гц, 2Н, Н-3″ и Н-5″ ), 7,01 (д, J=8,5 Гц, 2Н, Н-2' и Н-6'), 7,12 (д, J=8,4 Гц, 1Н, Н-5), 7,24 (д, J=8,6 Гц, 2Н, Н-2″ и Н-6″ ); 13С ЯМР (СD3ОD, 75 МГц) δ м.д. 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33. Элементный состав: С, Н, N, Cl: теоретически: 70,51, 6,53, 2,84, 7,18%, найдено: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%.
Пример 7
Опыты in vivo no биодоступности пролекарств андрост-5-ен-3β ,17β -диола
1) Принцип
Опыты по биодоступности пролекарств предшественников половых стероидных гормонов проводили на крысах-самцах Sprague-Dawley при определении концентраций в плазме крови соединений после однократного перорального введения соединений.
а) Животные и обработка
Крыс-самцов Sprague-Dawley [Crl:CD(SD)Br] весом тела 275-350 г получали из Charles-River Canada Inc. и размещали по 2 в клетку во время периода акклиматизации и индивидуально во время опыта. Животных содержали в режиме 12 ч свет:12 ч темнота (свет в 08:00). Животные получали сертифицированный корм для грызунов (Lab. Diet # 5002, гранулы) и водопроводную воду без ограничений. Крыс держали голодными (давая доступ только к воде), начиная с вечера перед введением.
Каждое соединение, которое тестировалось, вводили трем животным в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе зондом для перорального введения в дозе 150 мкмг/крысу. Из яремной вены крыс брали одну пробу крови в объеме ≈ 0,7 мл под анестезией с изофлураном на 1, 2, 3, 4 и 7 ч после введения. Пробы крови сразу же переносили в охлаждаемый микроконтейнер емкостью 0,75 мл, содержащий ЭДТА, и хранили на ледяной бане до центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Быстро отделяли плазму (менее, чем в течение 50 мин) после отбора крови. Затем аликвоту плазмы в 0,25 мл переносили в боросиликатную пробирку (13× 100) и быстро замораживали на сухом льду. Пробы плазмы хранили при -80° С до определения концентрации предшественников половых стероидных гормонов в плазме ГХ-МС.
Результаты
Всасывание через рот и AUCs представлены на фигурах 12 и 13.
Примеры фармацевтических композиций
Ниже представлены в качестве примера, а не ограничения, несколько фармацевтических композиций, в которых используются предпочтительные активные SERM ЕМ-800 или ЕМ-1538 и предпочтительный активный предшественник половых стероидных гормонов DHEA, ЕМ-1304 или ЕМ-01474-D. Можно использовать другие соединения по изобретению или их комбинацию вместо (или в дополнение к) ЕМ-800 или ЕМ-1538, DHEA, ЕМ-1304 или ЕМ-01474-D. Концентрация активного ингредиента может варьировать в широких пределах, как здесь обсуждалось. Количества и типы других ингредиентов, которые можно включать, хорошо известны в данной области.
Пример 8
Таблетка
Пример 9
Желатиновые капсулы
Примеры наборов
Ниже представлены в качестве примера, а не ограничения, несколько наборов, в которых используются предпочтительные активные SERM ЕМ-800 или ЕМ-1538 и предпочтительный активный предшественник половых стероидных гормонов DHEA, ЕМ-1304 или ЕМ-01474-D. Можно, использовать другие соединения по изобре-тению или их комбинацию вместо (или в дополнение к) ЕМ-800 или ЕМ-1538, DHEA, ЕМ-1304 или ЕМ-01474-D. Концентрация активного ингредиента может варьировать в широких пределах, как здесь обсуждалось. Количества и типы других ингредиентов, которые можно включать, хорошо известны в данной области.
Пример 10
SERM вводят перорально, в то время как предшественник половых стероидных гормонов назначают чрескожно.
Композиция SERM для перорального введения (капсулы)
Композиция предшественника половых стероидных гормонов для местного нанесения (гель)
Пример 11
SERM и предшественник половых стероидных гормонов вводят перорально.
Композиция нестероидного антиэстрогена для перорального введения (капсулы)
Композиция предшественника половых стероидных гормонов для перорального введения (желатиновые капсулы)
Можно использовать другие SERM вместо ЕМ-800 или ЕМ-01538 в вышепредставленных композициях, а также другие предшественники половых стероидных гормонов вместо DHEA, ЕМ-1304 или EM-01474-D. Можно включить более, чем один SERM, или более, чем один предшественник, в этом случае общий весовой процент равен предпочтительно весовому проценту для одного предшественника или одного SERM, представленных в примерах выше.
Изобретение описано способами предпочтительных воплощений и примеров, но не ограничивается таким образом. Специалисты в данной области легко поймут более широкую применимость и объем изобретения, который ограничивается только формулой изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПОДАВЛЕНИЯ ПРИРОСТА МАССЫ | 2000 |
|
RU2519642C2 |
| СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПОДАВЛЕНИЯ ПРИРОСТА МАССЫ | 2000 |
|
RU2327461C2 |
| СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПОДАВЛЕНИЯ ПРИРОСТА МАССЫ | 2013 |
|
RU2636498C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНДРОСТ-5-ЕН-3-β, 17β -ДИОЛ, И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | 1999 |
|
RU2221569C2 |
| ФТОРИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 4-АЗАСТЕРОИДА В КАЧЕСТВЕ МОДУЛЯТОРОВ РЕЦЕПТОРА АНДРОГЕНА | 2003 |
|
RU2320670C2 |
| ПОЛУГИДРАТ 16 АЛЬФА-БРОМО-3 БЕТА-ГИДРОКСИ-5 АЛЬФА-АНДРОСТАН-17-ОН, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ | 2000 |
|
RU2295534C2 |
| СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЭСТРОГЕНЗАВИСИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ | 1998 |
|
RU2214236C2 |
| ГИДРОКСИМАТАИРЕЗИНОЛ В ПРОФИЛАКТИКЕ РАКА | 2000 |
|
RU2241453C2 |
| СИСТЕМЫ С РЕГУЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ И НИЗКИМИ ДОЗАМИ АНДРОГЕНОВ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ ЭТИХ СИСТЕМ | 1992 |
|
RU2142276C1 |
| ПРИМЕНЕНИЕ СОФОРИКОЗИДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ | 2009 |
|
RU2454236C1 |
Изобретение относится к способам медицинского лечения и/или ингибирования развития остеопороза, рака молочной железы, гиперхолестеринемии, гиперлипидемии или атеросклероза у чувствительных теплокровных животных, включая человека, включающие введение селективного модулятора половых стероидных гормонов, в частности соединения общей формулы (I) и количества предшественника половых стероидных гормонов, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростеронсульфата, андрост-5-ен-3β,17β-диола и соединений, превращаемых in vivo в один из вышеуказанных предшественников. Дополнительное введение бисфосфонатов в сочетании с селективными модуляторами рецепторов эстрогенов и/или предшественником половых стероидных гормонов раскрывается для медицинского лечения и/или ингибирования развития остеопороза. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям для доставки активного(ых) ингредиента(ов) и наборам, их содержащим. Изобретение эффективно в отношении указанных способов лечения, сводя до минимума нежелательные побочные эффекты. 5 н. и 36 з.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл.
где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила и группы, превращаемой in vivo в гидроксил;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из C1-C4 алкила или R3 и R4 и азот, с которым они связаны, вместе являются любой структурой, выбранной из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино и морфолино;
А выбран из группы, состоящей из -СО-,-СНОН и -СН2-;
В выбран из группы, состоящей из фенилена, пиридилидена и -циклоС4Н2N2-.
где D является -ОСН2CH2N(R3)R4 или -СН=СН-СООН (R3 и R4 или независимо выбраны из группы, состоящей из C1-C4 алкила, или R3, R4 и атом азота, с которым они связаны, вместе являются кольцевой структурой, выбранной из группы, состоящей из пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино и морфолино);
Е и К независимо являются водородом или гидроксилом;
J является водородом или галогеном.
где D выбран из группы, состоящей из -OCH2CH2N(R7)R8, -CH=CH-CON(R7)R8, -CC-(CH2)4-N(R7)R8 (R7 и R8 или независимо выбраны из группы, состоящей из C1-С6 алкила, или R7, R8 и атом азота, с которым они связаны, вместе образуют кольцевую структуру, выбранную из группы, состоящей из кольца пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино, морфолино);
Х выбран из группы, состоящей из водорода и C1-С6 алкила;
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила, C1-С6 алкила, и группы, превращаемой in vivo в гидроксил.
где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила и группы, превращаемой in vivo в гидроксил;
R5 и R6 независимо являются водородом или C1-С6 алкилом;
D является -ОСН2СH2N(R3)R4 (R3 и R4 или независимо выбраны из группы, состоящей из C1-C4 алкила, или R3, R4 и атом азота, с которым они связаны, вместе являются кольцевой структурой, выбранной из группы, состоящей из кольца пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино, морфолино).
где R1 и R2 независимо являются водородом, гидроксилом или группой, которая превращается in vivo в гидроксил;
Z является двухвалентной замыкающей группой;
R100 является двухвалентной группой, которая отделяет L от В-кольца 4-10 промежуточными атомами;
L является двухвалентной или трехвалентной полярной группой, выбранной из группы -SO-, -CON-, -N< и -SON<;
G1 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C5 углеводорода или двухвалентной группы, которая соединяется с G2 и L с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, и галогенсодержащих или ненасыщенных производных вышеуказанного;
G2 или отсутствует, или выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C5 углеводорода или двухвалентной группы, которая соединяется с G1 и L с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца, и галогенсодержащих или ненасыщенных производных вышеуказанного;
G3 выбран из группы, состоящей из водорода, метила и этила.
где D является -OCH2CH2N(R3)R4 (R3 и R4 или независимо выбраны из группы, состоящей из C1-C4 алкила, или R3, R4 и атом азота, с которым они связаны, вместе являются кольцевой структурой, выбранной из кольца пирролидино, диметил-1-пирролидино, метил-1-пирролидинила, пиперидино, гексаметиленимино, морфолино);
R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила и группы, превращаемой in vivo в гидроксил.
где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из гидроксила и группы, превращаемой in vivo в гидроксил;
R3 является группой, выбранной из группы, состоящей из насыщенного, ненасыщенного или замещенного пирролидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидино, насыщенного, ненасыщенного или замещенного пиперидинила, насыщенного, ненасыщенного или замещенного морфолино, азотсодержащей циклической группы, азотсодержащей полициклической группы, и NRaRb (Ra и Rb независимо являются водородом, прямым или разветвленным C1-С6 алкилом, прямым или разветвленным С2-С6 алкенилом и прямым или разветвленным С2-С6 алкинилом).
ЕМ-800
EM-01520
EM 01533
EM-01518
EM-L538
где Х выбран из группы, состоящей из Н-, ROC-, RCO2CHRa- и RbSO2- (R выбран из группы, состоящей из водорода, прямого или разветвленного (C1-C8) алкила, прямого или разветвленного (C2-C18) алкенила, прямого или разветвленного (С2-С18) алкинила, арила, фурила, прямого или разветвленного (C1-C18) алкокси, прямого или разветвленного (C2-C18) алкенилокси, прямого или разветвленного (C2-C18) алкинилокси, арилокси, фурилокси и галогенсодержащих или карбоксильных аналогов вышеуказанного; Ra является водородом или (C1-С6) алкилом и Rb выбран из группы, состоящей из гидроксила (или его солей), метила, фенила и п-толуила);
Y является карбонильным кислородом или Y представляет β-OX (X имеет то же значение, как указано выше) и α-Н.
ЕМ-1304
EM-01474-D
ЕМ-1538
и терапевтически эффективное количество андрост-5-ен-3β,17β-диола.
где Х выбран из группы, состоящей из Н-, ROC-, RCO2CHRa- и RbSO2- (R выбран из группы, состоящей из водорода, прямого или разветвленного (C2-C18) алкила, прямого или разветвленного (C2-C18) алкенила, прямого или разветвленного (C2-C18) алкинила, арила, фурила, прямого или разветвленного (C1-C18) алкокси, прямого или разветвленного (C2-C18) алкенилокси, прямого или разветвленного (C2-C18) алкинилокси, арилокси, фурилокси и галогенсодержащих или карбоксильных аналогов вышеуказанного; Ra является водородом или (C1-С6) алкилом и Rb выбран из группы, состоящей из гидроксила (или его солей), метила, фенила и п-толуила);
Y является карбонильным кислородом или Y представляет β-OX (X имеет то же значение, как указано выше) и α-Н, и Y не является карбонильным кислородом, когда Х представляет Н-.
ЕМ-1304
EM-01474-D
| RU 95101044, 27.11.1997 | |||
| US 4418068 А, 29.11.1983 | |||
| Приспособление в пере для письма с целью увеличения на нем запаса чернил и уменьшения скорости их высыхания | 1917 |
|
SU96A1 |
| ЕР 0747056 А2, 11.12.1996 | |||
| J | |||
| of the National Cancer Institute, vol 90, no 10, May 1998, pp.772-778. | |||
