Изобретение относится к способам получения и применения стероидов, в частности 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она (16α-бромо-эпиандростерона, обозначаемого далее как BrEA), и их новых аналогов. Стероиды используют для применения в терапевтических и нетерапевтических целях, включая их применение в качестве иммунных модуляторов. Настоящее изобретение относится также к способам получения соединений, композиций и составов.
BrEA и его получение из стероидного соединения 3β-гидроксиандрост-5-ен-17-она (дегидроэпиандростерон или DHEA) описаны в литературе (см., например, J. Org. Chem. 1962 27:2937-2938). Способы получения DHEA и других стероидов и их биологические свойства описаны, например, в патентах США №№2833793, 2911418, 3148198, 3471480, 3976691, 4268441, 4427649, 4542129, 4666898, 4956355, 5001119, 5043165, 5077284, 5028631, 5110810, 5157031, 5162198, 5175154, 5277907, 5292730, 5296481, 5372996, 5387583, 5407684, 5424463, 5461042, 5478566, 5506223, 5518725, 5527788, 5527789, 5532230, 5559107, 5562910, 5583126, 5585371, 5587369, 5591736, 5593981, 5610150, 5635496, 5641766, 5641768, 5656621, 5660835, 5686438, 5696106, 5700793, 5707983, 5709878, 5710143, 5714481, 5728688, 5736537, 5744462, 5753237, 5756482, 5776921, 5776923, 5780460, 5795880, 5798347, 5798348, 5804576, 5807848, 5807849, 5811418, 5824313, 5824668, 5824671, 5827841, 5837269, 5837700, 5843932, 5846963, 5859000, 5872114 и 5872147; в патентах Германии №№2035738 и 2705917; в публикациях РСТ №№ WO 95/21617, WO 97/48367, WO 98/05338, WO 98/50040, WO 98/50041, WO 98/58650; в Европейской публикации №0020029; Ben-David, et al., Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 1967 125:1136-1140, Coleman et al., Diabetes 1982 31:830, Oertel, et al., J. Steroid Biochem. 1972 3:493-496, Pashko, et al., Carcinogenesis 1981 2:717-721, Schwartz et al., Nutr. Cancer 1981 3:46-53; Dyner et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 1993 6:459-465; A.A. Afanasii and Y.A. Titov, Total Steroid Synthesis, Plenum Press, New York, 1970, см., например, р.1-304.
Различные варианты применения DHEA и других стероидов, например, модулирующие иммунные реакции, описаны, например, в патентах США №№5869090, 5863910, 5856340, 5824668, 5804576, 5753237, 5714481, 5709878, 5407684, 5206008, 5077284, 4978532, 4898694, 4542129, 3711606 and 3710795.
В патенте США 4956355 и публикации РСТ WO 97/48367 описано применение BrEA и некоторых стероидных соединений для лечения вирусных и бактериальных инфекций, в частности инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).
Различные биологические эффекты и метаболические превращения стероидных соединений описаны в литературе, например, Batta et al., J. Biol. Chem. 1986 25:127-133, Belli et al., Liver 1991 11:162-169, Bhattacharjee et al., Anal. Biochem. 1992 201:233-236, Blake et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1982 20:97-101, 1986 25:127-133, Bonaventura, Am. J. Obstet. Gynecol. 1978 131:403-409, Bucala et al., J. Steroid Biochem. 1986 25:127-133, Carey et al., Biochem. 1981 20:3637-3648, Chen et al., Carcinogenesis 1999 20:249-254, Chen et al., Carcinogenesis 1998 19:2187-2193, Chow et al., Antisense Res. Dev. 1994 4:81-86, Citro et al., Dis. Colon Rectum 1994 37(2 Suppl):S127-S132, Cleary, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1991 196:8-16, Cleary, Int. J. Biochem. 1990 22:205-210, Crawford et al., Lab. Invest. 1994 71:42-51, Danenberg et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1992 36:2275-2279, Dotzlaw et al., Cancer Res. 1999 59:529-532, Falany et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1994 48:369-375, Faredin et al., J. Investigative Dermatol. 1969 52:357-361, Galigniana et al., Mol. Pharmacol. 1999 55:317-323, Goto et al., J. Chromatogr. 1983 276:289-300, Grenot Biochem. 1992 31:7609-7621, Hofbauer et al., Life Sci. 1999 64:671-679, Huijghebaert et al., J. Lipid Res. 1986 27:742-752, Hurd et al., Oncogene 1999 18:1067-1072, Iida et al., J. Lipid Res. 1995 36:628-638, Jellinck et al., Steroids 1967 10:329-346, Jonsson et al., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1995 20:394-402, Kalimi et al., Mol. Cell. Biochem. 1994 131:99-108, Kramer et al., J. Biol. Chem. 1994 269:10621-10627, LaRochelle et al., Steroids 1984 43: 209-217, Liao et al., Carcinogenesis 1998 19:2173-2180, Lillienau et al., J. Clin. Invest. 1992 89:420-431, Loria, Psychoneuroendocrinology 1997 22:8103-8108, Luscher et al., Mol. Immunol. 1983 20:1099-1105, Manna et al., J. Biol. Chem. 1999 274:5909-5918, Marschall et al., J. Biol. Chem. 1989 264:12989-12993, Medh et al., Cancer Res. 1998 15:3684-3693, Mohan et al., Steroids 1992 57:244-247, Munoz de Toro et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998 67:333-339, Padgett et al., J. Neuroimmunol. 1998 84:61, Padgett et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1995 774:323, Padgett et al., J. Immunol. 1994 153:1544-1552, Pashko et al., Carcinogenesis 1984 5:463-466, Pashko et al., Carcinogenesis 1981 2:717, Petrylak et al., J. Clin. Oncology 1999 17:958-967, Podesta et al., Steroids 1996 61:622-626, Regelson et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994 719:564, Schmassmann et al., Gastroenterology 1993 104:1171-1181, Schmassmann et al., Hepatology 1990 11:989-996, Schreiber et al., Lancet 353:459-461, Schreiber, Neth. J. Med. 1998 53:S24-31, Schwartz et al., Cancer Res. 1988 48:4817, Shahidi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999 254:559-565, Steer et al., Ann. Rheum. Dis. 1998 57:732-737, Suzuki et al., Steroids 1998 63:672-677, Suzuki et al., Steroids 1996 61:296-301, Swaan et al., Bioconjugate Chem. 1997 8:520-525, Tang et al., Anticancer Drug Res. 1998 13:815-824, Thomas et al., J. Steroid Biochem. 1986 25:103-108, Utsumi et al.. Cancer Res. 1999 59:377-381, Vanden Heuvel. J. Nutr. 1999 129(2S Suppl.):575S-580S, Wang et al., Endocrinology 1998 139:3903-3912, Wong et al., J. Biol. Chem. 1999 274:5443-5453, Xie et al., Endocrinology 1999 140:219-227, Yen et al., Lipids 1977 12:409-413, Zackheim et al., Arch. Dermatology 1998 134:949-954, Zhang et al., Biochim. Biophys. Acta 1991 1096:179-186, Zhu et al., Carcinogenesis 1988 19:2101-2106.
Композиции BrEA, которые использовали для введения соединения в клетки или экстракты клеток, обычно включали большое количество воды. Такие композиции содержали растворители, в частности диоксан или диметилсульфоксид (DMSO), которые включали воду или водные растворы циклодекстрина, способствующие введению соединения в клетки, см., например, J. Pharmacol Exp. Ther. 1998, 285:876-83, Cancer Res. 1986 46:3389-95, Carcinogenesis 1985 6:333-35, Carcinogenesis 1981 2:717-721, Carcinogenesis 1981 2:683-86. Такие композиции обычно вводят животным путем инъекции или в клетки культуры тканей путем добавления в среду клеточной культуры. Европейская публикация ЕР 429187 описывает составы, которые содержат DHEA или BrEA и поливинилпирролидон, а также поливинилпирролидон с поперечными связями. Некоторые из этих составов могут иметь нежелательные или субоптимальные свойства. Так, например, растворители, в частности диоксан, DMSO или хлороформ, как правило, не являются предпочтительными или пригодными парентеральными наполнителями, в особенности для организма человека. Поэтому существует потребность в составах, которые содержат BrEA или родственные стероиды и обладают улучшенными свойствами, например, меньшей токсичностью, увеличенной химической устойчивостью или желательными характеристиками для промышленного синтеза.
Иммунные реакции млекопитающих на инфекции или иные условия часто характеризуются реакциями, которые опосредованы различными популяциями эффекторных клеток. В некоторых ситуациях хелперные Т-клетки, обозначаемые как Th1 в организме мышей, способствуют иммунным эффекторным функциям, которые обычно подавляются реакциями, опосредованными клетками. В других случаях хелперные Т-клетки, обозначаемые как Th2, способствуют иммунным эффекторным функциям, которые обычно подавляются гуморальными реакциями. Интенсивная реакция Th1 обычно необходима для устранения инфекций или замедления прогрессирования инфекции. Если на иммунную реакцию субъекта оказывает влияние или подавляет реакция типа Th2, то цитокинез, связанный с реакцией Th2, имеет тенденцию к подавлению в то же время способности иммунной системы вызывать интенсивную реакцию Th1. Обратное утверждение, как правило, также является справедливым. Когда иммунные реакции млекопитающего начинают вызывать усиление реакции Th2, реакция Th1 при тех же условиях имеет тенденцию к ослаблению. Слабые реакции Th1 могут быть связаны с прогрессированием каких-либо инфекций или с иными условиями, см. например, М.Clerici and G.M.Sheare, Immunol. Today 14:107-111, 1993; M.Clerici and G.M.Sheare, Immunol. Today 15:575-581, 1994. В изобретении предложены составы и композиции, полезные для усиления иммунных реакций Th1.
Композиции, составы или способы согласно изобретению выполняют одну или несколько из следующих задач.
Одной из задач настоящего изобретения является получение новых стероидных соединений или их аналогов, пригодных для терапевтических и иных применений, в частности в качестве иммунных модуляторов. Кроме того, в задачи изобретения входит получение полугидратных соединений BrEA (BrEA2·H2O), которые содержат полугидрат BrEA, а также способы его получения и применения. Следующей задачей изобретения является получение жидких композиций и составов, которые содержат соединения формулы 1 и включают воду в количестве 3% (по объему) или менее. Еще одной задачей изобретения является получение композиций, которые можно использовать в качестве промежуточных продуктов для получения фармацевтических составов для лечения человека и животных и которые содержат одно или несколько соединений формулы 1. Следующей задачей изобретения является создание способов прерывистого дозирования для введения субъекту соединения формулы 1 с целью усиления иммунных реакций Тh1. Следующей задачей является создание способов модулирования врожденного иммунитета или усиления иммунных реакций Th1 у субъекта путем введения указанному субъекту одного или нескольких соединений формулы 1, в частности BrEA. Следующие задачи включают создание способов замедления репликации патогена, например вируса, у субъекта путем введения указанному субъекту одного или нескольких соединений формулы 1, в частности BrEA. В задачи изобретения входит также получение соединений формулы 1 или составов, полезных для уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов патологического состояния, связанного с иммунной депрессией или с дефицитом иммунных реакций Th1. Кроме того, задачами изобретения являются способы получения и применения композиций и составов, содержащих одно или несколько соединений формулы 1.
На фиг. 1 показан полученный способом USP инфракрасный спектр с преобразованием Фурье (FTIR) <197> полугидрата BrEA, который приготовили путем осаждения BrEA из этанола и воды. На фиг. 2 показан полученный способом USP спектр FTIR <197> безводного BrEA, который приготовили путем осаждения BrEA из безводного метанола. На фиг. 3 показана эндотермическая кривая DSC полугидрата BrEA, который получили путем осаждения BrEA из этанола и воды. На фиг. 4 показана эндотермическая кривая DSC безводного BrEA, который получили путем осаждения BrEA из безводного метанола. На фиг. 5 показан спектр рентгеноскопической дифракции на порошке (XRD) полугидрата BrEA, который получили путем осаждения BrEA из этанола и воды. На фиг.6 изображен спектр FTIR, полученный способом USP <197> полугидрата BrEA, который приготовили путем осаждения BrEA из ацетона и воды.
Согласно настоящему изобретению в соответствии с его задачами предложен полугидрат BrEA
который может отличаться различными физическими свойствами, в частности точкой плавления, поглощением в инфракрасной области спектра или спектром рентгеновской дифракции на порошке.
Соответствующие варианты реализации включают полугидрат BrEA и один или несколько наполнителей, пригодных для применения в фармацевтических препаратах для лечения человека или животных. Еще один вариант реализации изобретения представляет собой способ получения полугидрата BrEA, включающий осаждение BrEA из раствора, содержащего этанол и воду.
Варианты изобретения включают композицию, содержащую соединение формулы 1
и один или несколько неводных жидких наполнителей, при этом состав содержит воду в количестве менее 3% по объему, где
R1, R2, R3, R4, R5, R6 и R10 независимо представляют собой -Н, -ORPR, -SRPR, -N(RPR)2, -O-Si-(R13)3, -CN, -NO2, сложный эфир, сложный тиоэфир, сложный фосфоэфир, сложный фосфотиоэфир, сложный фосфоноэфир, сложный фосфинэфир, сложный сульфитный эфир, сложный сульфатный эфир, амид, аминокислоту, пептид, простой эфир, простой тиоэфир, ацильную группу, тиоацильную группу, карбонат, карбамат, тиоацеталь, галоген, алкильную группу с возможным замещением, алкенильную группу с возможным замещением, алкинильную группу с возможным замещением, арильную группу с возможным замещением, гетероарильную группу с возможным замещением, моносахарид с возможным замещением, олигосахарид с возможным замещением, нуклеозид, нуклеотид, олигонуклеотид, полимер или один или несколько радикалов из группы R1, R2, R3, R4, R5, R6, R10, R15, R17 и R18 представляет собой =O или =S, а атом водорода, который соединен с тем же атомом углерода, отсутствует, или
R3 и оба R4 вместе представляют собой структуру формулы D
R7 представляет собой -CHR10-, -CHR10-CHR10-, -CHR10-CHR10-CHR10-, -CHR10-O-CHR10-, -CHR10-S-CHR10-, -CHR10-NRPR-CHR10-, -O-, -O-CHR10-, -S-, -S-CHR10-, -NRPR- или -NRPR-CHR10-;
R8 и R9 независимо представляют собой -CHR10-, -CHR10-CHR10-, -О-, -О-CHR10-, -S-, -S-CHR10-, -NRPR- или -NRPR-CHR10-, либо R8 или R9 независимо отсутствуют, выходя из 5-членного кольца,
R13 - независимо представляет собой алкил C1-6,
R16 - независимо представляет собой -СН2-, -О-, -S- или -NH-,
D - гетероцикл или 4-, 5-, 6- или 7-членное кольцо, которое содержит насыщенные атомы углерода, при этом 1, 2 или 3 атома углерода кольца в 4-, 5-, 6- или 7-членном кольце могут быть независимо замещены -О-, -S- или NRPR-, или 1, 2 или 3 атома гетероцикла или 1 или 2 атома углерода кольца в 4-, 5-, 6- или 7-членном кольце замещены -ORPR-, -SRPR-, -N(RPR)2, -O-Si-(R13)3, -CN, -NO2, сложным эфиром, сложным тиоэфиром, сложным фосфоэфиром, сложным фосфотиоэфиром, сложным фосфоноэфиром, сложным фосфинэфиром, сложным сульфитным эфиром, сложным сульфатным эфиром, амидом, аминокислотой, пептидом, простым эфиром, простым тиоэфиром, ацильной группой, тиоацильной группой, карбонатом, карбаматом, тиоацеталем, галогеном, алкильной группой с возможным замещением, алкенильной группой с возможным замещением, алкинильной группой с возможным замещением, арильной группой с возможным замещением, гетероарильной группой с возможным замещением, моносахаридом с возможным замещением, олигосахаридом с возможным замещением, нуклеозидом, нуклеотидом, олигонуклеотидом или полимером или
один или несколько атомов углерода в кольце замещены =O или =S,
или D содержит два 5- или 6-членных кольца, при этом кольца слиты или соединены 1 или 2 связями.
Другие варианты реализации изобретения включают получение соединения формулы 1, в котором два или три радикала из R7, R8 и R9 независимо не являются -CHR10-, при этом соединение возможно входит в состав композиции, которая содержит один или несколько наполнителей, пригодных для применения в качестве фармацевтического средства для человека или животного.
Варианты реализации изобретения включают также соединение формулы 1
где R1, R2, R3, R4, R5, R6 и R10 независимо представляют собой -Н, -ORPR, -(RPR)2, -O-Si-(R13)3, -CN, -NO2, сложный эфир, сложный тиоэфир, сложный фосфоэфир, сложный фосфотиоэфир, сложный фосфоноэфир, сложный фосфинэфир, сложный сульфитный эфир, сложный сульфатный эфир, амид, аминокислоту, пептид, простой эфир, простой тиоэфир, ациловую группу, тиоациловую группу, карбонат, карбамат, тиоацеталь, галоген, алкильную группу с возможным замещением, алкенильную группу с возможным замещением, алкинильную группу с возможным замещением, арильную группу с возможным замещением, гетероарильную группу с возможным замещением, моносахарид с возможным замещением, олигосахарид с возможным замещением, нуклеозид, нуклеотид, олигонуклеотид, полимер или
один, два или более радикалов из группы R1, R2, R3, R4, R5, R6 и R10 независимо представляют собой =O или =S, а атом водорода, который соединен с тем же атомом углерода, отсутствует, или
R3 и R4 вместе представляют собой структуру формулы D
R7 представляет собой -CHR10-, -CHR10-CHR10-, -CHR10-CHR10-CHR10-, -CHR10-O-CHR10-, -CHR10-S-CHR10-, -CHR10-NRPR-CHR10-, -O-, -O-CHR10-, -S-, -S-CHR10-, -NRPR- или -NRPR-CHR10-;
R8 и R9 независимо представляют собой -CHR10-, -CHR10-CHR10-, -О-, -О-CHR10-, -S-, -S-CHR10-, -NRPR- или -NRPR-CHR10-, либо R8 или R9 независимо отсутствуют, выходя из 5-членного кольца,
R13 - независимо представляет собой алкил C1-6,
D - гетероцикл или 4-, 5-, 6- или 7-членное кольцо, которое содержит насыщенные атомы углерода, при этом 1, 2 или 3 атома углерода кольца в 4-, 5-, 6- или 7-членном кольце могут быть независимо замещены -О-, -S- или NRPR-, или 1, 2 или 3 атома гетероцикла или 1 или 2 атома углерода кольца в 4-, 5-, 6- или 7-членном кольце замещены -ORPR-, -SRPR-, -N(RPR)2, -O-Si-(R13)3, -CN, -NO2, сложным эфиром, сложным тиоэфиром, сложным фосфоэфиром, сложным фосфотиоэфиром, сложным фосфоноэфиром, сложным фосфинэфиром, сложным сульфитным эфиром, сложным сульфатным эфиром, амидом, аминокислотой, пептидом, простым эфиром, простым тиоэфиром, ацильной группой, тиоацильной группой, карбонатом, карбаматом, тиоацеталем, галогеном, алкильной группой с возможным замещением, алкенильной группой с возможным замещением, алкинильной группой с возможным замещением, арильной группой с возможным замещением, гетероарильной группой с возможным замещением, моносахаридом с возможным замещением, олигосахаридом с возможным замещением, нуклеозидом, нуклеотидом, олигонуклеотидом или полимером или
один или несколько атомов углерода в кольце замещены =O или =S,
или D содержит два 5- или 6-членных кольца, при этом кольца слиты или соединены 1 или 2 связями, а один, два или три радикала из группы, включающей R7 R8 и R9, не являются -CHR10-.
Другие варианты реализации изобретения включают способ увеличения экспрессии одного или нескольких цитокинов или интерлейкинов, которые усиливают иммунную реакцию Тh1 у субъекта, или уменьшения экспрессии одного или нескольких цитокинов или интерлейкинов, которые усиливают иммунную реакцию Th2 у субъекта, при этом указанный способ включает введение субъекту эффективной дозы композиции по п.32 формулы изобретения, что обеспечивает усиление иммунной реакции Тh1 или ослабление нежелательной иммунной реакции Th2 у субъекта.
Варианты реализации изобретения включают жидкие составы, которые содержат соединение с формулой 1, один или несколько наполнителей и менее 3% воды, при этом возможно хранение состава в контейнерах, которые исключают попадание воды.
Еще один вариант реализации изобретения представляет собой способ, который включает периодическое введение соединения с формулой 1 субъекту, имеющему патологическое состояние, в частности вирусную или паразитную инфекцию.
И еще один вариант реализации изобретения - способ модулирования врожденного иммунитета субъекта, иммунных реакций Тh1 или иммунных реакций Th2 путем введения указанному субъекту соединения формулы 1.
Другие варианты реализации изобретения представлены в описании, включая прилагаемый список вариантов реализации и формулу изобретения.
Определения. Если иного не указано или не подразумевается контекстом, следующие термины, употребляемые в данном описании, имеют значения, соответствующие приведенным здесь определениям.
"Состав согласно изобретению" или "состав" означает композицию согласно изобретению, которую можно парентерально вводить человеку или животному без дополнительных манипуляций, способных изменять присутствующие ингредиенты или их соотношение. Указанные составы пригодны для использования в медицине или ветеринарии.
"Композиция согласно изобретению" - композиция, которую можно использовать в качестве промежуточного продукта для получения составов согласно изобретению, т.е. для получения состава требуется изменение ингредиентов или их соотношения. Таким образом, композиции согласно изобретению включают такие композиции, которые требуют дополнительной обработки для получения из них состава, например смешивания или добавления желаемого количества определенного ингредиента.
"Наполнитель" означает компонент или ингредиент, приемлемый с точки зрения совместимости с другими ингредиентами композиций или составов согласно изобретению и не представляющий опасности для пациента или животного, которому должен быть введен указанный состав. Используемый здесь термин "наполнители" включает такие жидкости, как бензилбензоат, хлопковое масло, N,N-диметилацетамид, спирт С2-12 (например, этанол), глицерин, арахисовое масло, полиэтиленгликоль (PEG), витамин Е, маковое масло, пропиленгликоль, сафлоровое масло, кунжутовое масло, соевое масло и растительное масло. Наполнители, используемые в данном изобретении могут исключать хлороформ, диоксан, растительное масло, DMSO (диметилсульфоксид) или любые их сочетания. Наполнители содержат один или несколько компонентов, которые обычно используют для фармацевтических составов, например присадки, связующие, агенты, вызывающие дезинтеграцию и смазки.
"Субъект" означает человека или животное. Животное обычно относится к позвоночным, например приматы, грызуны, домашние и дикие животные. Приматы включают шимпанзе, cynomologous обезьян, паукообразных обезьян и макак, например Rhesus. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и дикие животные включают коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, семейство кошачьих, например домашнюю кошку, семейство псовых, например собаку, птиц, например цыпленка, эму, страуса, и рыб, например форель, сома и лосося. Субъект включает все подвиды указанных выше видов, например все из вышеуказанных, но за исключением одной или нескольких групп или видов, в частности человек, приматы или грызуны.
Выражения, которые относятся к "соединениям с формулой 1" или "соединению формулы 1" означают композиции или составы, в которых присутствуют одно или несколько соединений формулы 1, типично 1, 2, 3 или 4, обычно 1.
Используемый термин "алкил" означает связанные нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода, т.е. линейные, разветвленные или циклические цепи. Количество атомов углерода в алкильной группе или радикале составляет от 1 до примерно 20, если не указано иного, например, алкил C1-8 означает алкильную группу, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода. Примеры включают метил, этил, 1-пропил (n-пропил), 2-пропил (i-пропил), -СН(СН3)2, 1-бутил (n-бутил), 2-метил-1-пропил (i-бутил, -СН2СН(СН3)2), 2-бутил (s-бутил, -СН(СН3)СН2СН3), 2-метил-2-пропил (t-бутил, -С(СН3)3), 1-пентил (n-пентил), 2-пентил (-СН(СН3)СН2СН2СН3), 3-пентил (-СН(СН2СН3)2), 2-метил-2-бутил (-С(СН3)2СН2СН3), 3-метил-2-бутил (-СН(СН3)СН(СН3)2), 3-метил-1-бутил (-СН2СН2СН(СН3)2), 2-метил-1-бутил (-СН2СН(СН3)СН2СН3), 1-гексил, 2-гексил (-СН(СН3)СН2СН2СН2СН3), 3-гексил (-CH(CH2CH3)(СН2CH2СН3)), 2-метил-2-пентил (-С(СН3)2СН2СН2СН3), 3-метил-2-пентил (-СН(СН3)СН(СН3)СН2СН3), 4-метил-2-пентил (-СН(СН3)СН2СН(СН3)2), 3-метил-3-пентил (-С(СН3)(СН2СН3)2), 2-метил-3-пентил (-СН(СН2СН3)СН(СН3)2), 2,3-диметил-2-бутил (-С(СН3)2СН(СН3)2), 3,3-диметил-2-бутил (-СН(СН3)С(СН3)3), циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.
"Алкенил" означает нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода, связанные одной или несколькими двойными связями (например, -СН=СН-), типично 1, 2 или 3, обычно 1 или 2. Количество атомов углерода в алкенильной группе или радикале составляет от 2 до примерно 20, если не указано иного, например, алкенил C1-8 означает алкенильную группу, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода.
"Алкинил" означает нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода связанные одной или несколькими тройными связями (например, -С≡С-), типично 1, 2 или 3, обычно 1. Количество атомов углерода в алкинильной группе или радикале составляет от 2 до примерно 20, если не указано иного, например, алкинил С1-8 означает алкинильную группу, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода.
"Арил" означает фенил или нафтил.
"Замещенный алкил", "замещенный алкенил", "замещенный алкинил" означают алкильную, алкенильную или алкинильную группу, которая содержит один или несколько заместителей, соединенных с атомом водорода или заместителей, которые прерывают цепь атомов углерода. Заместители включают простые эфиры (-O-), кетоны (-С(О)-), -ORPR, -C(O)ORPR -C(O)O-, -C(S)ORPR, -C(S)O-, -OC(O)-, -C(O)H, -OCH2-, -ОСН2СН2-, -ОСН2O-, -ОСН2СН2O-, -NRPR-, -N(RPR)2, -NHRPR, -NHC(O)-, -CH2- NRPR-, -CH2-NHRPR, -CH2-NHC(O)-, -C(O)NH-, -C(O)NHRPR, -OC(O)NRPR-, -OC(O)NHRPR, -NRPRC(O)NRPR-, -NRPRC(O)NHRPR, -NRPRCH2-, -NRPRCH2CH2-, -S-, -SRPR, -S(O)-, -S(O)(O)-, -S(O)ORPR, -S(O)H, -CN, -NO2, галоген и сочетания этих групп, где RPR независимо являются водородом, защитной группой или оба RPR вместе являются защитной группой. Если присутствует несколько заместителей, то их выбирают независимо один от другого. Алкенильную и алкинильную группы, которые содержат один или несколько заместителей, обычно замещают в позиции атома углерода, который входит в одну или несколько метиленовых групп, удаленных из двойной связи, например отделенных по меньшей мере одной, двумя или несколькими группами -СН2-.
"Гетероцикл" или "гетероциклический" включают в качестве примера без ограничения гетероциклы, описанные Paquette, Leo A: "Principle of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A.Benjamin, New York, 1968), в частности, Chapters 1, 3, 4, 6, 7 и 9; "The Chemistry of heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), в частности, Volumes 13, 14, 16, 19 и 28, и J. Am. Chem. Soc. 1960, 82:5566.
Примеры гетероциклов включают, в частности и без ограничения, пиридил, тиазолин, тетрагидротиофенил, окисленный серный тетрагидротиофенил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, тетрагидрохинолил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6Н-1,2,5-тиадизинил, 2Н,6Н-1,5,2дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксатинил, 2Н-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3Н-индолил, 1H-индазолил, пуринил, 4Н-хинолизинил, фталазинил, нафтигиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4аН-карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензиоксазолил, оксидолил, бензоксазолинил и изатиноил.
В качестве примера и без ограничения, связанные с углеродом гетероциклы присоединены в позиции 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, в позиции 3, 4, 5 или 6 пиридазина, в позиции 2, 4, 5 или 6 пиримидина, в позиции 2, 3, 5 или 6 пиразина, в позиции 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрафурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, в позиции 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, в позиции 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, в позиции 2 или 3 азиридина, в позиции 2, 3 или 4 азетидина, в позиции 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или в позиции 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина. Еще более типично гетероциклы, соединенные с углеродом, включают 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6-пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3-пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4-тиазолил или 5-тиазолил.
В качестве примера и без ограничения, связанные с азотом гетероциклы присоединены в позиции 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1H-индазола, в позиции 2 изоиндола или изоиндолина, в позиции 4 морфолина и в позиции 9 карбазола или β-карболина.
Связанные с азотом гетероциклы типично включают 1-азиридил, 1-азетедил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.
"Гетероарил" означает одно ароматическое кольцо либо два или несколько слитых ароматических колец, при этом указанные кольцо или сопряженные кольца содержат 1, 2, 3 или более гетероатомов, обычно кислород (-O-), азот (-NX-) или серу, где Х означает -Н, защитную группу или алкил C1-6, обычно -Н. Соответствующие примеры описаны для гетероцикла.
Термин "спирт", используемый в данном описании обычно в контексте наполнителей, означает спирт, который содержит алкильную группу С2-12, замещенную в позиции атома водорода одной гидроксильной группой. Спирты включают этанол, н-пропанол, и-пропанол, н-бутанол, и-бутанол, с-бутанол, т-бутанол, н-пентанол, и-пентанол, н-гексанол, циклогексанол, н-гептанол, н-октанол, н-нонанол и н-деканол. Цепь атомов углерода в спиртах может быть прямой, разветвленной или циклической. Спирт включает все подгруппы из указанных выше, например спирты С2-4 (спирты, содержащие 2, 3 или 4 атома углерода).
"Галоген" означает фтор, хлор, бром или йод.
"Защитная группа" означает группу, которая предотвращает участие связанного с ней атома в нежелательных реакциях. Так, например, для -ORPR RPR может быть водородом или защитная группа для атома кислорода может быть гидроксилом, в то время как для -C(O)-ORPR RPR может быть водородом или карбоксильной защитной группой, для -SRPR RPR может быть водородом или, например, защитной группой для серы в тиолах, а для -NHRPR или -N(RPR)2- может быть водородом или защитной группой для атома азота в первичных или вторичных аминах. Гидроксил, амин и другие реактивные группы содержатся в соединениях с формулой 1, например в R1 или R2. Эти группы могут потребовать защиты от реакций, которые происходят в какой-либо части молекулы. Защитные группы для атомов кислорода, серы или азота обычно используют для предотвращения нежелательных реакций с электрофильными соединениями, в частности ацилирования, применяемого, например, в химии стероидов.
"Сложный эфир" означает группу, которая содержит структуру -С(O)-O-. Обычно используемые здесь сложные эфиры включают органическую группу, содержащую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 независимо выбранных гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), при этом органическая группа соединяется со стероидным ядром, имеющим формулу 1, например, в R1 или R2, посредством структуры -С(O)-O-, например, органическая группа-С(O)-O-стероид или органическая группа-O-С(O)-стероид. Органическая группа обычно включает одну или несколько органических групп, описанных выше, например алкильные группы C1-20, алкенильные группы С2-20, алкинильные группы С2-20, арильные группы, гетероциклы С2-9 или замещенные производные каких-либо из них, содержащие, например, 1, 2, 3, 4 или более заместителей, при этом каждый заместитель выбирают независимо. Типичные заместители атомов водорода или углерода в этих органических группах содержат 1, 2, 3, 4 или несколько, обычно 1, 2 или 3, -О-, -S-, -NRPR - (включая -NH-), -С(O), =O, =S, -N(RPR)2 (включая -NH2), -C(O)ORPR (включая -C(O)OH), -OC(O)RPR (включая -О-С(О)-Н), -ORPR (включая -ОН), -SRPR (включая -SH), NO2, -CN, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -ОС(O)-, -С(O)O-, -O-А8, -S-A8, -С(O)-А8, -ОС(O)-А8, -С(O)O-А8, =N-, -N=, =N-OH, -OPO3(RPR)2, -OSO3Н2 или галогенные группы или атомы, где каждый RPR представляет собой -Н, независимо выбранную защитную группу или оба RPR вместе содержат защитную группу, а А8 представляет собой алкил С1-8, алкенил С2-8, алкинил C2-8, алкил-арил С1-4 (например, бензил), арил (например, фенил) или алкил С0-4-гетероцикл С2-9. Заместителей выбирают независимо. Органическая группа включает соединения, определенные как переменные R4. Органические группы исключают заведомо неустойчивые группы, например, -O-O-, за исключением тех случаев, когда такие неустойчивые группы являются переходными группами, которые можно использовать для получения соединения с достаточной химической устойчивостью для применения с одной или несколькими описанными здесь целями. Перечисленные выше заместители являются типичными заместителями, которые можно использовать для замещения одного или нескольких атомов углерода, например, -О- или -С(O)- или одного или нескольких атомов водорода, например галоген, -NH2 или -ОН.
"Сложный тиоэфир" означает группу, которая содержит структуру -C(S)-O-. Обычно используемые здесь сложные тиоэфиры включают органическую группу, содержащую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), при этом органическая группа соединяется со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R2, посредством структуры -C(S)-O-, например, органическая группа-С(S)-O-стероид или органическая группа-O-С(S)-стероид. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Тиоацеталь" означает группу, которая содержит структуру -C(O)-S-. Обычно используемые здесь тиоацетали включают органическую группу, содержащую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), при этом органическая группа соединяется со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R2, посредством структуры -C(O)-S-, например органическая группа-С(O)-S-стероид или органическая группа-O-С(S)-стероид. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Сложный фосфоэфир" или "сложный фосфатный эфир" означает группу, которая содержит структуру -O-P(ORPR)(O)-O-, где RPR - водород (-Н), защитная группа или органическая группа, как описано для сложных эфиров. Обычно используемые здесь фосфоэфиры содержат атом водорода, защитную группу или органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединеных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -O-Р(O)(O)-O-, например, органическая группа-O-Р(O)(O)-O-стероид. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Сложный фосфотиоэфир" означает группу, которая содержит структуру -O-P(SRPR)(O)-O-, где RPR - водород (-Н), защитная группа или органическая группа, как описано для сложных эфиров. Обычно используемые здесь сложные фосфотиоэфиры содержат атом водорода, защитную группу или органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -O-Р(O)(O)-O-, например органическая группа-O-P(SH)-O-стероид. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Сложный фосфоноэфир" означает группу, которая содержит структуру -P(ORPR)(O)-O-, где RPR - водород (-Н), защитная группа или органическая группа, как описано для сложных эфиров. Обычно используемые здесь сложные фосфоноэфиры содержат атом водорода, защитную группу или органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -P(ORPR)(O)-O-, т.е., органическая группа-P(ORPR)(О)-О-стероид или стероид-P(ORPR)(O)-O-органическая группа. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Сложный фосфиноэфир" означает группу, которая содержит структуру -P(ORPR)-O-, где RPR - водород (-Н), защитная группа или органическая группа, как описано для сложных эфиров. Обычно используемые здесь сложные фосфоноэфиры содержат атом водорода, защитную группу или органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -P(ORPR)-O-, т.е. органическая группа-Р(ORPR)-О-стероид или стероид -P(ORPR)-O- органическая группа. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Сложный сульфатный эфир" означает группу, которая содержит структуру -O-S-(O)(O)-O-. Обычно используемые здесь сложные сульфатные эфиры содержат атом водорода, защитную группу или органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -O-S(O)(O)-O-, т.е. органическая группа-O-S(O)(O)-O-стероид. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Сложный сульфитный эфир" означает группу, которая содержит структуру -O-S(O)-O-. Обычно используемые здесь сложные сульфитные эфиры содержат органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -O-S(O)-O-, например, органическая группа-O-S(O)-O-стероид. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Тиоацеталь" означает группу, которая содержит структуру -S-C(O)-. Обычно используемые здесь тиоацеталевые группы содержат органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -S-C(O)-, например органическая группа-S-С(O)-стероид или стероид-S-С(O)-органическая группа. Органическая группа является такой же, как описано выше для сложных эфиров.
"Амид" означает органическую группу, как описано для сложного эфира, которая содержит 1, 2, 3, 4 или более групп -C(O)NRPR-, обычно 1 или 2, где RPR представляет собой -Н или защитную группу, обычно RPR является Н. В некоторых вариантах реализации группа -C(O)-NRPR- присоединена к стероидному ядру по R1-R6, R10, R15, R17 или R18, т.е. органическая группа-C(O)NRPR-стероид или стероид-C(O)NRPR-органическая группа.
"Простой эфир" означает органическую группу, как описано для сложного эфира, которая содержит 1, 2, 3, 4 или более групп -О-, обычно 1 или 2. В некоторых вариантах реализации группа -О- соединяется со стероидным ядром по R1-R6, R10, R15, R17 или R18, например органическая группа-O-стероид.
"Простой тиоэфир" означает органическую группу, как описано для сложного эфира, которая содержит 1, 2, 3, 4 или более групп -S-, обычно 1 или 2. В некоторых вариантах реализации группа -S- присоединена к стероидному ядру по R1-R6, R10, R15, R17 или R18, например органическая группа-S-стероид.
"Ацильная группа" означает органическую группу, как описано для сложного эфира, которая содержит 1, 2, 3, 4 или более групп -С(O)-. В некоторых вариантах реализации группа -С(O)- присоединена к стероидному ядру по R1-R6, R10, R15, R17 или R18, например органическая группа-С(O)-стероид.
"Тиоацил" означает органическую группу, как описано для сложного эфира, которая содержит 1, 2, 3, 4 или более групп -C(S)-. В некоторых вариантах реализации группа -C(S)- соединяется со стероидным ядром по R1-R6, R10, R15, R17 или R18, например органическая группа-С(S)-стероид.
"Карбонат" означает органическую группу, как описано для сложного эфира, которая содержит 1, 2, 3, 4 или более структур -O-С(O)-O-. Обычно используемые здесь карбонатные группы содержат органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -O-С(O)-O-, например органическая группа-S-C(O)-стероид.
"Карбамат" означает органическую группу, которая содержит 1, 2, 3,4 или более структур -O-C(O)NRPR, где RPR -H, защитная группа или органическая группа, как описано для сложного эфира. Обычно используемые здесь карбаматные группы содержат органическую группу, включающую примерно 1-50 атомов углерода (например, около 2-20 атомов углерода) и от 0 до примерно 10 гетероатомов (например, О, S, N, P, Si), соединенных со стероидным ядром, имеющим формулу 1, в R1-R6, R10, R15, R17 или R18, посредством структуры -O-C(О)NRPR, например органическая группа-О-С(O)NRPR-стероид или стероид-О-С(O)NRPR-органическая группа.
Используемый здесь термин "моносахарид" означает многоатомный альдегид или кетон, имеющий эмпирическую формулу (СН2O)n, где n 3, 4, 5, 6 или 7. Моносахарид включает формы с открытой и замкнутой цепью, однако обычно имеет формы с замкнутой цепью. Моносахарид включает такие сахара, как гексофураноза и пентофураноза, в частности 2'-деоксирибоза, рибоза, арабиноза, ксилоза, их 2'-деокси- и 3'-деоксипроизводные, а также их 2',3'-дидеоксипроизводные. Моносахарид включает также 2',3'-дидеоксидидегидропроизводное соединение рибозы. Кроме того, моносахариды включают D-, L- и DL-изомеры глюкозы, фруктозы, маннозы, идозы, галактозы, аллозы, гулозы, альтрозы, талозы, фукозы, эритрозы, треозы, ликсозы, эритрулозы, рибулозы, ксилулозы, рибозы, арабинозы, ксилозы, псикозы, сорбозы, тагатозы, глицеральдегида, дигидроксиацетона и их монодеоксипроизводных, в частности рамнозу. Моносахариды могут быть полностью или частично защищенными.
Возможное замещение алкильной группы, возможное замещение алкенильной группы, возможное замещение алкинильной группы, возможное замещение арильной группы и возможное замещение гетероцикла означают замещения, которые включают алкильные группы C1-20, алкенильные группы С2-20, арильные группы, гетроциклы С2-9 или замещенные производные каких-либо из указанных групп. Типичные замещения для этих органических групп включают 1, 2, 3, 4 или более, обычно 1 или 2, -О-, -S-, -NRPR-, -C(O)-, -N(RPR)2, -C(O)ORPR, -ORPR, -SRPR, -NO2, -CN, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -C(O)O-, -J-A8, -S-A8, -C(O)-A8, -OC(O)-A8, -C(O)O-A8, =N-, -N=, -OPO2RPR, -OSO3H или галогенные группы или атомы, где RPR независимо представляет собой -Н, защитную группу или оба RPR вместе содержат защитную группу, а А8 представляет собой алкил C1-8, алкенил C1-8, алкинил C1-8, алкил-арил C1-4 (например, бензил), арил (например, фенил) или алкил C1-4-гетероцикл C1-5. Заместителей выбирают независимо. Органические радикалы, описанные здесь, исключают заведомо неустойчивые группы, например -O-O-, за исключением тех случаев, когда такие неустойчивые группы являются переходными группами, которые можно использовать для получения соединения с достаточной химической устойчивостью для применения с одной или несколькими описанными здесь целями.
"Моносахарид" с возможным замещением содержит какой-либо сахар С3-С7 с конфигурациями D-, L- или DL-, например эритрозу, глицерин, рибозу, деоксирибозу, арабинозу, глюкозу, маннозу, галактозу, фукозу, маннозу, глюкозамин, N-ацетилнейроминовую кислоту, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, который может быть замещен одной или несколькими гидроксильными группами. Пригодные заместители включают водород, защищенный гидроксил, карбоксил, азидо-, циано-, алкил -O-C1-6, алкил -S-C1-6, алкенил -O-С2-6, алкенил -S-C1-6, амин с возможным замещением, карбоксил с возможным замещением, галоген, тиол или защищенный тиол. Связь между сахаридом и стероидом - α или β.
"Олигосахарид" с возможным замещением содержит два, три, четыре или более сахаров С3-С7, которые ковалентно связаны один с другим. Связанные сахара могут иметь конфигурации D-, L- или DL-. Пригодные сахара и заместители - такие же, как описаны для моносахаридов. Связь между олигосахаридом и стероидом - α или β. Такими же являются связи между моносахаридами, которые содержат олигосахарид.
Нуклеозид включает 3ТС, AZT, ddl, ddC, G, A, U, С, Т, Dg, dA, dT и dC.
Полимер включает биологически совместимые полимеры, например PEG и полиоксиалкильные полимеры.
PEG означает полимер этиленгликоля, который содержит примерно от 20 до 2000000 связанных мономеров, типично - примерно 50-1000 связанных мономеров, обычно - примерно 100-300. Полиэтиленгликоли включают PEG, содержащие различное количество связанных мономеров, например PEG 20, PEG 30, PEG 40, PEG 60, PEG 80, PEG 100, PEG 115, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 500, PEG 600, PEG 1000, PEG 1500, PEG 2000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 4600, PEG 5000, PEG 6000, PEG 8000, PEG 11000, PEG 12000, PEG 2000000 и их смеси.
Аминокислота. "Аминокислота" означает аминокислотную группу, которая содержит радикал какой-либо природной или синтетической аминокислоты, т.е. группу, содержащую по меньшей мере один карбоксил и по меньшей мере один радикал аминокислоты, непосредственно связанный с одним, двумя, тремя или более атомами углерода, обычно - с одним (α) атомом углерода. Природа и идентичность промежуточной структуры, расположенной между карбоксильной и аминной группами, может включать множество структур, в том числе описанных здесь. Обычно аминокислоты, связанные со стероидом аминной группой, имеют достаточную конформацию и длину, чтобы обеспечить автокаталитический гидролиз связи между аминокислотой и стероидом и выделить стероид. Это может произойти, если свободный карбоксил образуется в живом организме путем деэтерификации, деамидирования или пептического гидролиза предшественника, содержащего связь между аминной группой аминокислоты и стероидом. Гидролиз связи между карбоксильной или аминной группой аминокислоты и стероидом может также происходить в результате химических или ферментативных процессов, например расщепления эстеразы или неферментативного гидролиза.
В общем, аминокислоты, которые соответствуют радикалам, используемым в составах согласно настоящему изобретению, имеют природное происхождение и по сути не обладают значительной фармакологической активностью. Однако оптимальную фармако-кинетическую активность (практически полный гидролиз по гидролизу дистальной связи амида или сложного эфира) можно получить с помощью радикалов синтетических аминокислот. Промежуточная структура может быть простой и представлять собой, в частности, метилен, если радикалом аминокислоты является глицил, или замещенный метилен для других α-аминокислот. Структура обычно содержит примерно до 5 атомов углерода или гетероатомов, непосредственно связанных с карбоксильным атомом углерода аминокислоты и атомом азота амина. Так, аминокислоты могут содержать промежуточные группы этилена, пропилена, бутилена или пентилена или их замещенных аналогов, например сложных оксиэфиров или простых эфиров, в которых кислород замещает углерод и в определенных случаях - водород. Примером такой промежуточной структуры может быть -CH-O-C(R22)(R23)-, где R22 и R23 - независимо выбранные водород или органические группы, как описано выше для сложных эфиров. В некоторых вариантах реализации один из R22 и R23 является водородом, а другой - органической группой С2-20. Типичные органические радикалы содержат примерно 1-20 атомов углерода и 0, 1, 2, 3, 4 или 5 независимо выбранных гетероатомов, которые обычно выбирают из группы, включающей кислород, азот, серу и фосфор. В общем случае используют меньшее количество промежуточных атомов, когда желателен ускоренный гидролиз, однако, более крупные структуры пригодны, если они обладают, например, достаточной гибкостью или имеют конформации, позволяющие позиционировать карбоксильную группу в непосредственной близости от связи между аминокислотой и стероидом.
Обычно R22 представляет собой -Н, метил, или гидроксиметил, обычно -Н, а R23 - боковую цепь или группу природной аминокислоты. Боковые цепи аминокислот включают аналоги, при этом боковая цепь - гомолог C1-15 соответствующего природного соединения, например, метилен, этилен, пропилен, бутилен или их замещенное производное, например, алкил, простой эфир или алкокси (например, метокси, этокси, пропокси) замещенное производное. В общем случае, для боковых цепей, содержащих карбоксил, если атом С карбоксила боковой цепи присоединен 5 или меньшим количеством атомов к атому N, то карбоксил может быть заблокирован, например, путем этерификации или амидирования, при этом эфирные или амидные связи могут гидролизоваться в живом организме. R22 также используют вместе с R30 для получения радикала (-СН2-)3 пролина. При этом R23, как правило, является боковой группой, в частности, -Н, -СН3, -СН(СН3)2, -СН2-СН(СН3)2, -СНСН3-СН2-СН3, -СН2-С6Н5, -CH2CH2-S-CH3, -СН2OH, -СН(ОН)-СН3, -CH2-SH, -СН2-С6Н4OH, -СН2-СО-NH2, -CH2-CH2-CO-NH2, -СН2-СООН, -СН2-СН2-СООН, -(CH2)4-NH2 и -(CH2)3-NH-C(NH2)-NH2. R23 также включает 1-гуанидинопроп-3-ил, бензил, 4-гидроксибензил, имидазол-4-ил, индол-3-ил, метоксифенил и этоксифенил. Оптимальную группу R30 легко подбирают с помощью обычных анализов.
Радикал аминокислоты, как правило, имеет структуру, соответствующую приведенным ниже формулам. Обычно n равно 1 или 2, R22 -Н, а R23 - радикал, содержащий одну или несколько из следующих групп: амино, карбоксил, амид, карбоксильный сложный эфир, гидроксил, арил С6-С7, простой эфир (-O-), простой тиоэфир (-S-), n-, s- или t-алкил (C1-С6), гуандинил, имидазолил, индолил, сульфогидрил, сульфоксид и фосфорил. R22 и R23 могут иметь самые разнообразные структуры, включая описанные здесь, например сложные эфиры, простые эфиры или карбонаты.
Если радикалы аминокислот содержат один или несколько хиральных центров, D, L, мезо-, трео- или эритро- (в соответствующих случаях), рацематы или их смеси включены в настоящее изобретение. В общем случае, если желательно использовать неферментативные средства гидролиза, следует применять D-изомеры. С другой стороны, L-изомеры могут быть более универсальными, поскольку они могут быть чувствительными как к неферментативному, так и к потенциально целевому ферментативному гидролизу, и более эффективно транспортируются аминокислотой или дипептидильными транспортными системами в гастроинтестинальный тракт.
Примеры пригодных радикалов аминокислот включают следующие: глицил; радикалы аминополикарбоновых кислот, например аспарагиновой кислоты, β-гидроксиаспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, β-гидроксиглутаминовой кислоты, β-метиласпарагиновой кислоты, β-метилглутаминовой кислоты, β,β-диметиласпарагиновой кислоты, γ-гидроксиглутаминовои кислоты, β,γ-дигидроксиглутаминовой кислоты, β-фенилглутаминовой кислоты, γ-метиленглутаминовой кислоты, 3-аминоадипиновой кислоты, 2-аминопимелиновой кислоты, 2-аминопробковой кислоты и 2-аминосебациновой кислоты; амиды аминокислот, в частности глутаминил и аспарагинил; радикалы полиамино- или многоосновных монокарбоновых кислот, в частности аргинина, лизина, β-аминоаланина, γ-аминобутирина, орнитина, цитрулина, гомоаргинина, гомоцитрулина, 5-гидрокси-2,6-диаминокапроновой кислоты (обычно - гидроксилизина, включая аллогидроксилизин) и диаминомасляной кислоты; радикалы других основных аминокислот, в частности гистидинила; диаминокарбоновых кислот, в частности α,α'-диаминоянтарной кислоты, α,α'-диаминоглутаровой кислоты, α,α'-диаминоадипиновой кислоты, α,α'-диаминопимелиновой кислоты, α,α'-диамино-β-гидроксипимелиновой кислоты, α,α'-диаминопробковой кислоты, α,α'-диаминоазепаиновой кислоты, α,α'-диаминосебациновой кислоты; иминокислот, в частности пролина, 4- или 3-гидрокси-2-пирролидинкарбоновой кислоты (обычно гидроксипролина, включая аллгидроксипролин), γ-метилпролинапипеколиновой кислоты, 5-гидроксипипеколиновой кислоты, -N([CH2]nCOORPR)2, где n равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, a RPR представляет собой -Н или защитную группу, и радикалы ацетидин-2-карбоновой кислоты; радикалы моно- или диалкил- (обычно разветвленной или нормальной C1-C8) аминокислоты, в частности аланина, валина, лейцина, аллиглицина, бутирина, норвалина, норлейцина, гептилина, α-метилсерина, α-амино-α-метил-γ-гидроксивалериановой кислоты, α-амино-α-метил-δ-гидроксивалериановой кислоты, α-амино-α-метил-ε-гидроксикапроновой кислоты, изовалина, α-метилглутаминовой кислоты, α-аминоизомалсяной кислоты, α-аминодиэтилуксусной кислоты, α-аминодиизопропилуксусной кислоты, α-аминоди-n-пропилуксусной кислоты, α-аминодиизобутилуксусной кислоты, α-аминоди-n-бутилуксусной кислоты, α-аминоэтилизопропилуксусной кислоты, α-амино-n-пропилуксусной кислоты, α-аминодиизоамиуксусной кислоты, α-метиласпарагиновой кислоты, α-метилглутаминовой кислоты, 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты; изолейцина, аллоизолейцина, третичного лейцина, β-метилтриптофана и α-амино-β-этил-β-фенилпропионовой кислоты; β-фенилсеринила; радикалы алифатических α-амино-β-гидроксикислот, в частности серина, β-гидроксилейцина, β-гидроксинорлейцина, β-гидроксинорвалина и α-амино-β-гидроксистеариновой кислоты; радикалы α-амино, α-, γ-, δ- или ε-гидроксикислот, в частности гомосерина, γ-гидроксинорвалина, δ- гидроксинорвалина и эпсилонгидроксинорлейцина: канавинил и каналинил; γ-гидроксиорнитинил; радикалы 2-гексозаминовых кислот, в частности D-глюкозаминовой кислоты или D-галактозаминовой кислоты; радикалы α-амино-β-тиолов, в частности пеницилламина, β-тиолнорвалина или β-тиолбутирина; радикалы других аминокислот, содержащих серу, включая цистеин; гомоцистин; β-фенилметионин; метионин; S-аллил-L-цистеинсульфоксид; 2-тиолгистидин; цистатионин, и простые тиоловые эфиры цистеина или гомоцистеина; фенилаланин, триптофан и замещенные в ядре α-аминокислоты, в частности фенил- или циклогексиламинокислоты α-аминофенилуксусной кислоты, α-аминофенилуксусную кислоту и α-амино-β-циклогексилпропионовую кислоту; аналоги и производные фенилаланина, содержащие арил, низший алкил, гидрокси-, гуанидино-, оксиалкилэфир-, нитро-, сульфо- или галозамещенный фенил (например, тирозин, метилтирозин и o-хлоро, p-хлоро-, 3,4-дихлоро, о-, m- или p-метил-, 2,4,6-триметил-, 2-этокси-5-нитро, 2-гидрокси-5-нитро и p-нитрофенилаланин); фурил-, тиенил-, пиридил-, пиримидинил-, пурин или нафтилаланины; радикалы аналогов и производных триптофана, включая кинуренин, 3-гидроксикинуренин, 2-гидрокситриптофан и 4-карбоситриптофан; радикалы α-аминозамещенных аминокислот, включая саркозин (N-метилглицин), N-бензилглицин, N-метилаланин, N-бензилаланин, N-метилфенилаланин, N-бензилфенилаланин, N-метилвалин, N-бензилвалин и радикалы α-гидрокси- и замещенных α-гидроксиаминокислот, включая радикалы серина, треонина, аллотреонина, фосфосерина и фосфотреонина.
Все из вышеуказанных и другие известные аминокислоты пригодны для применения согласно настоящему изобретению. Обычно аминокислоты способны обеспечивать автокаталитический гидролиз связи между аминокислотой и стероидом. Таким образом, они обычно содержат в исходном состоянии или после гидролиза в живом организме свободную карбоксильную группу или аминную группу.
Кроме того, интерес представляют гидрофобные аминокислоты, в частности моно- или ди- алкиловые или ариловые аминокислоты, циклоалкиламинокислоты и т.п. Их радикалы вместе с R29-R34 (R31-R34 определены ниже) могут вносить вклад в проницаемость клетки за счет модуляции липофильности соединения, имеющего формулу 1 или формулу 2. Обычно радикал не содержит сульфогидрильного или гуанидинового заместителя.
Пептид. Один, два, три или более R1-R4 могут содержать "пептид", т.е. две или более аминокислоты, как определено выше. Обычно аминокислоты связаны нормальными пептидными связями, т.е. -CO-NH-, которые расположены между соседними радикалами аминокислот. Пептиды включают дипептиды (димеры), трипептиды (тримеры), короткие пептиды из 4, 5, 6, 8, 10 или 15 радикалов и более длинные пептиды или белки, которые содержат примерно 100 и более радикалов. Соединения согласно изобретению, которые содержат пептид, можно использовать в качестве иммуногенов, пролекарств или синтетических предшественников для получения других стероидных производных. В одном из вариантов реализации пептид содержит сайт пептидолитического ферментативного гидролиза на пептидной связи, соединяющей первый радикал с последующим радикалом, дистальным относительно стероидного радикала. Такие гидролизные сайты могут располагаться между структурами, распознаваемыми ферментами, например особые радикалы, распознаваемые гидролитическим ферментом, в частности пептидаза, расположенная в сыворотке или в клетках.
Пептидолитические ферменты хорошо известны и включают, в частности, карбоксипептидазы. Карбоксипептидазы переваривают полипептиды путем удаления С-терминальных радикалов и во многих случаях являются специфическими для особых С-терминальных последовательностей. В общем случае требования к таким ферментам и их субстратам хорошо известны. Так, например, дипептид, имеющий данную пару радикалов и свободное карбоксильное окончание, ковалентно связан своей α-аминогруппой со стероидным ядром. При этом ожидается, что пептид будет расщеплен соответствующей дипептидазой, протеазой или путем химического гидролиза, в то время как проксимальный радикал останется для автокаталитического гидролиза амидированной связи.
Примеры пригодных дипептидильных групп (обозначенных их однобуквенными символами) представлены в приведенной ниже таблице 1.
Дипептиды
Такие дипептиды включают виды, в которых обе аминокислоты имеют конфигурацию L, конфигурацию D или смеси конфигураций.
Трипептиды, т.е. 3 связанных радикала аминокислот, также полезны для реализации изобретения. Указанные трипетиды включают такие, в которых А, С, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, Р, Q, R, S, Т, V, W или Y присоединен стандартной пептидной связью к аминному или карбоксильному окончанию какого-либо из дипептидов, перечисленных выше. Последовательности -Х1-про-Х2- (где X1 - аминокислота, а Х2 - водород, радикал аминокислоты или сложный карбоксильный эфир пролина) гидролизуется луминальной карбоксипептидазой для образования XI со свободным карбоксилом, который в свою очередь автокаталитически гидролизует амидированную связь. Х2 обычно представляет собой сложный бензиловый эфир карбоксильной группы Х2. Другие варианты реализации включают тетрапептиды, в частности, такие, где два из вышеперечисленных дипептидов, которые могут быть одинаковыми или различными дипептидами (например, АА и АА, связанные вместе или, например, АА и GI, связанные вместе), соединены один с другим пептидной связью посредством аминного или карбоксильного окончания. Один, два или несколько тетрапептидов могут быть связаны с соединением, имеющим формулу 1 или формулу 2, посредством аминного или карбоксильного окончания тетрапептида.
В некоторых вариантах реализации соединение, имеющее формулу 1 или формулу 2, содержит одну или несколько аминокислот или пептидов со структурой (А), (В), или (С):
(A) R32-NH-{[C(R29)(R30)]b-C(O)-N(R31)}f-[C(R29)(R30)]a-C(O)-O-стероид,
(B) R33-O-{C(O)-[C(R29)(R30)]d-N(R31)}g-C(O)-[C(R29)(R30)]c-N(R31)-O-стероид или
(C) R33-O-{C(O)-[C(R29)(R30)]d-N(R31)}e-C(O)-[C(R29)(R30)]c-N(R31)-C(O)-O-стероид,
где (А), (В), или (С) выбирают независимо и они связаны с одним, двумя, тремя или большим количеством радикалов R1-R4, при этом каждый из R29-R31 выбирают независимо; R29 независимо являются -Н или органическим радикалом С1-20 (например, алкил C1-6, в частности -СН3 или -C2H5); R30 независимо являются боковой цепью аминокислоты, включая боковую цепь природных аминокислот, как описано выше, например, -Н, -СН3, -СН2С6Н5; R31 представляет собой -Н или защитную группу; R32 и R33 независимо содержат -Н, защитную группу, сложный эфир или амид, при этом каждый атом или группу выбирают независимо; а, b, с и d независимо равны 1, 2, 3, 4 или 5, обычно 1; e, f и g - целые числа от 0 до примерно 1000, обычно они независимо равны 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; a, b, с и d независимо равны 1 или 2; e, f и g независимо равны 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
Если аминокислота (аминокислоты) или радикал (радикалы) содержат две или более аминные группы, например, радикал лизинил, аргинил или орнитинил, то R29 - обычно -Н, а R30 может включать -[C(R34)2]n2N(RPR), где n2 равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, RPR представляет собой -Н или защитную группу, а каждый R34 независимо является -Н, алкилом C1-C20 с возможным замещением, арилом С6-С20 с возможным замещением, алкиларилом С7-C20 с возможным замещением, алкокси C1-С20 с возможным замещением, арилокси С6-С20 с возможным замещением или гидроксилом. Такие соединения содержат множество стероидных радикалов. Так, например, если аминогруппы эпсилон (ε) или дельта (δ) и альфа (α) лизина или орнитина замещены стероидными радикалами, предполагается, что амидат будет способен выделять две молекулы активного препарата, каждая из которых появится при различных фармакокинетических условиях и, следовательно, будет и далее поддерживать выделение лекарственного препарата.
Соль. Варианты реализации изобретения включают соли и комплексы соединений согласно изобретению (соединения с формулой 1), включая фармацевтически допустимые, или соли, которые являются относительно нетоксичными. Некоторые из соединений согласно изобретению содержат один или несколько радикалов, которые в водных растворах переносят, по меньшей мере частично, положительный или отрицательный заряд обычно при рН примерно 4-10 и которые могут участвовать в образовании соли, комплекса или соединения, обладающего частично свойствами соли, а частично свойствами комплекса, или других нековалентных соединений, все из которых мы называем "солями". Соли обычно являются биологически совместимыми или фармацевтически допустимыми или нетоксичными, в особенности для клеток млекопитающих. Биологически токсичные соли могут использоваться с синтетическими промежуточными продуктами соединений согласно изобретению. В тех случаях, когда требуется получить водорастворимое соединение, обычно используют одновалентные соли.
Соли металлов обычно получают в результате реакции гидроксида металла с соединением согласно настоящему изобретению. Примерами солей металлов, которые можно получать таким способом, являются соли, содержащие Li+, Na+ и К+. Менее растворимую соль металла можно осаждать из раствора более растворимой соли путем добавления соответствующего соединения металла. Соли согласно изобретению можно получать путем добавления определенных органических кислот, в частности органических карбоновых кислот, и неорганических кислот, например алкилсульфокислот или галоидно-водородных кислот, к кислотным или основным центрам соединений согласно изобретению, например, к основным центрам основных аналогов пиримидина согласно изобретению. Соли металлов включают соли, содержащие Na+, Li+, К+, Са++ или Mg++. Другие соли металлов могут содержать ион алюминия, бария, стронция, кадмия, висмута, мышьяка или цинка.
Соли соединений согласно изобретению могут содержать комбинацию соответствующих катионов, в частности ионов щелочных и щелочноземельных металлов или ионов аммония и четвертичного аммония, с кислотным анионным радикалом группы фосфорной или фосфиновой кислот, которые могут быть представлены в полимерах или мономерах согласно изобретению.
Соли получают стандартными способами, в том числе растворением свободного основания в водном, водно-спиртовом или водно-органическом растворе, содержащем выбранную кислоту, с возможным последующим испарением раствора. Свободное основание реагирует с органическим раствором, содержащим кислоту, в этом случае соль обычно непосредственно отделяется, либо раствор можно сконцентрировать.
Пригодные аминные соли включают амины, имеющие достаточную основность для образования устойчивой соли, обычно амины с низкой токсичностью включают триалкиламины (трипропиламин, триэтиламин, триметиламин), прокаин, дибензиламин, N-бензил-бета-фенэтиламин, эфенамин, N,N'-дибензилэтилендиамин, N-этилпиперидин, бензиламин и дициклогексиламин.
Соли включают также соли органических сульфокислот и органических карбоновых кислот, полученные, например, путем добавления кислот к основным центрам, обычно к аминам. Примеры сульфокислот включают ариловые сульфокислоты С6-16, гетероариловые сульфокислоты С6-16 и алкильные сульфокислоты C1-16, в частности фенилсульфокислоту, α-нафталинсульфокислоту, β-нафталинсульфокислоту, (S)-камфорсульфокислоту, метил-(СН3SO3Н), этил-(С2Н5OH), n-пропил-, i-пропил-, n-бутил-, s-бутил-, i-бутил-, t-бутил-, пентил- и гексилсульфокислоты. Примеры органических карбоновых кислот включают алкиловые карбоновые кислоты C1-16, ариловые карбоновые кислоты С6-16 и гетероариловые карбоновые кислоты C4-16, в частности уксусную, гликолевую, молочную, пировиноградную, малоновую, глутаровую, винную, лимонную, фумаровую, янтарную, яблочную, малеиновую, оксалиновую, гидроксималеиновую, бензойную, гидроксибензойную, фенилуксусную, коричную, салициловую, никотиновую и 2-фенгидроксибензойную.
Соли согласно изобретению включают соли, полученные из неорганических кислот, например HF, HCl, HBr, HI, H2SO4, Н3PO4, Na2CO3, К2СО3, СаСО3, MgCO3 и NaClO3. Пригодные анионы, которые могут присутствовать с такими катионами, как Са++, Mg++, Li+, Na+ или К+, включают арсенат, арсенит-формиат, сорбат, хлорат, перхлорат, перйодат, дихромат, гликодеоксихолат, холат, деоксихолат, таурохолат, тауродеоксихолат, тауролитохолат, тетраборат, нитрат, нитрит, сульфит, сульфамат, гипосульфит, бисульфит, метабисульфит, тиосульфат, тиоцианат, силикат, метасиликат, CN-, глюконат, гулькуронат, гиппурат, пикрат, гидросульфид, гексафторфосфат, гипохлорит, гипохлорат, борат, метаборат, вольфрамат и урат.
Соли включают также соли соединений согласно изобретению с одной или несколькими аминокислотами. Многие аминокислоты являются пригодными, в особенности природные аминокислоты, которые являются компонентами белка, однако, аминокислота обычно имеет боковую цепь с основной или кислотной группой, например лизин, аргинин, гистидин или глутаминовая кислота, или нейтральную группу, в частности глицин, серии, треонин, аланин, изолейцин или лейцин.
Композиции согласно изобретению включают соединения в их неионизованной форме, а также в амфионной форме и в сочетании со стехиометрическим количеством воды, соответствующим составу гидратов.
Стереоизомеры. Соединения согласно изобретению (соединения с формулой 1) включают обогащенные или разделенные оптические изомеры в каких-либо или во всех асимметричных атомах, как видно на прилагаемых чертежах. Как рацемические, так и диастеромерические смеси, а также отдельные оптические изомеры можно выделить или синтезировать практически свободными от их энантиомерных или диастереомерных партнеров, при этом все они включены в настоящее изобретение. Хиральные центры могут быть найдены в соединениях согласно изобретению, например, в R1, R2, R3 и R4.
При этом используют один или несколько следующих способов для получения энантиомерно обогащенных или чистых изомеров. Указанные способы перечислены в убывающем порядке их примерной предпочтительности, т.е. обычно следует применять стереоспецифический синтез из хиральных предшественников перед хроматографическим разделением и перед спонтанной кристаллизацией.
Стереоспецифический синтез описан в примерах. Способы такого типа обычно используют при наличии соответствующего хирального исходного материала и выбирают этапы реакции таким образом, чтобы исключить нежелательную рацемизацию в хиральных участках. Одно из достоинств стереоспецифического синтеза заключается в том, что он не создает нежелательных энантиомеров, которые приходится удалять из готового продукта, снижая тем самым общий выход синтеза. Для специалистов в данной области очевидно, что соответствующие исходные материалы и условия реакции следует использовать для получения способом стереоспецифического синтеза желаемых обогащенных или чистых изомеров.
Если адекватный стереоспецифический синтез невозможно эмпирически смоделировать или определить с помощью обычных опытов, то специалистам следует обратиться к другим способам. Один из способов общего применения заключается в хроматографическом разделении энантиомеров на хиральных хроматографических смолах. Такие смолы размещают в серийно выпускаемых колонках, которые обычно называют колонками Пиркле. Колонки содержат хиральную стационарную фазу. Рацемат помещают в раствор и загружают в колонку, а затем отделяют способом жидкостной хроматографии высокого разрешения. См., например. Proceedings Chromatographic Society - International Symposium on Chiral Separations, Sept. 3-4, 1987. Примеры хиральных колонок, которые можно использовать для обеспечения оптимальной технологии отделения, включают Diacel Chriacel OD, Regis Pirkle Covalent D-phenylglycine, Regis Pirkle Type 1A, Astec Cyclobond II, Astec Cyclobond III, Serva Chiral D-DL=Daltosil 100, Bakerbond DNBLeu, Sumipax OA-1000, Merck Cellulose Triacetate column, Astec Cyclobond I-Beta или Regis Pirkle Covalent D-Naphthylalanine. He все из этих колонок, вероятно, будут эффективными для любой рацемической смеси. Однако специалисты понимают, что потребуется провести определенные исследования в обычном режиме для определения наиболее эффективной стационарной фазы. При использовании таких колонок желательно применять такие варианты соединений согласно данному изобретению, в которых заряды не нейтрализованы, например, где кислотные функциональные группы, в частности, карбоксил, не этерифицированы или амидированы.
Другой способ использует превращение энантиомеров в смесь диастериомеров с хиральными дополнениями, а затем отделение сопряженных соединений с помощью обычной хроматографической колонки. Этот способ является весьма пригодным особенно в тех случаях, когда вариант реализации включает свободный карбоксил, аминогруппу или гидроксил, которые образуют соль или ковалентную связь с хиральным дополнением. Хирально чистые аминокислоты, органические кислоты или органосульфокислоты, хорошо известные специалистам, заслуживают исследования в качестве хиральных дополнений. С такими дополнениями можно получить соли или их можно ковалентно (но обратимо) соединить с функциональной группой. Так, например, чистые аминокислоты L или D можно использовать для амидирования карбоксильной группы соединений согласно изобретению, которые содержат карбоксильную группу, а затем отделить с помощью хроматографии.
Еще один способ, имеющий потенциальное значение, представляет собой ферментное расщепление. При использовании таких способов получают ковалентные производные энантиомеров в рацемической смеси, обычно низшие алкильные эфиры (например, карбоксильные), а затем подвергают производное ферментному расщеплению обычно гидролизу. Для успешной реализации этого способа необходимо выбирать фермент, способный к стереоспецифическому расщеплению, поэтому часто оказывается необходимым провести отделение нескольких ферментов по обычной технологии. Если расщеплению подлежат сложные эфиры, то выбирают группу эстераз, фосфотаз и липаз и определяют их активность по отношению к производному. Типичные эстеразы получают из печени, поджелудочной железы и других органов животных, в том числе эстеразу свиной печени.
Если энантиометрическую смесь отделяют от раствора или расплава в виде конгломерата, т.е. смесь энантиометрически чистых кристаллов, то кристаллы можно отделить механически, получив при этом энантиометрически обогащенный препарат. Однако такой способ нецелесообразен для крупномасштабного производства и имеет ограниченную ценность для истинно рацемических соединений.
Асимметричный синтез - еще один способ, обеспечивающий энантиометрическое обогащение. Так, например, хиральная защитная группа реагирует с группой, которой требуется защита, при этом реакционную смесь выдерживают до достижения равновесия. Если реакция является энантиометрически специфической, то продукт будет обогащен соответствующим энантиомером.
Дополнительные указания по разделению энантиометрических смесей можно найти, например, в следующей литературе, список которой приведен без ограничения:
"Enantiomers, Racemates, and resolutions", Jean Jacques, Andre Collet, and Samuel H. Wilen (Krieger Publishing Company, Malabar, FL, 1991, ISBN 0-89464-618-4): Part 2, Resolution of Enantiomer Mixture, pages 217-435; more particularly, section 4, Resolution by Direct Crystallization, pages 217-251, section 5, Formation and Separation of Diastereomers, pages 251-369, section 6, Crystallization-Induced Asymmetric Transformations, pages 369-378, and section 7, Experimental Aspects and Art of Resolutions, pages 378-435; still more particularly, section 5.1.4, Resolution of Alcohols, Transformation of Alcohols into Salt-Forming Derivatives, pages 263-266, section 5.2.3, Covalent Derivatives of Alcohols, Thiols, and Phenols, pages 332-335, section 5.1.1, Resolution of Acids, pages 257-259, section 5.1.2, Resolution of Bases, pages 259-260, section 5.1.3, Resolution of Amino Acids, page 261-263, section 5.2.1, Covalent Derivatives of Acids, page 329, section 5.2.2, Covalent derivatives of Amines, pages 330-331, section 5.2.4, Covalent Derivatives of Aldehydes, Ketones, and Sulfoxides, pages 335-339, and section 5.2.7, Chromatographic Behavior of Covalent Diastereomers, pages 348-354.
Если иного не указано и не предполагается в контексте, процентное содержание жидкого ингредиента, например наполнителя, в композициях или составах согласно изобретению означает объемные проценты (объем/объем) ингредиента. Так, например, 20% пропиленгликоль означает 20% по объему пропиленгликоля, представленного в композиции или составе согласно изобретению. Количество наполнителя, указанное в композициях согласно изобретению, не зависит от применяемой формы, например, от марки растворителя или наполнителя NF или USP. В частности, композиция согласно изобретению, которая содержит около 30% полиэтиленгликоля 300 NF, вместо этого может содержать аналог USP при условии соответствия других ограничений, например присутствующего количества воды.
Используемый здесь термин "врожденный иммунитет" относится к одному или нескольким компонентам, обычно связанным с неспецифическими иммунными защитными механизмами субъекта. Эти компоненты включают различные дополнительные элементы, например В-клеточный фактор, фактор дифференцировки и пропердин; естественные клетки-киллеры, фагоциты (моноциты, макрофаги), нейтрофилы, эозинофилы, дендритные клетки, фиброциты; противомикробные химикаты, например дефензины; физические барьеры - кожа, слизистый эпителий, а также определенные интерлейкины, хемокины и цитокины. Врожденный иммунитет играет роль в сопротивлении внутриклеточным паразитным инфекциям, например инфекция белых кровяных телец, инфекция печени и другие инфекции, в частности инфекция лимфатических узлов. Усиление механизма врожденного иммунитета за счет соединений с формулой 1 или описанного здесь способа может ускорять фаголисосомное слияние или движение, которые замедляют некоторые патогены, например внутриклеточные бактерии, в частности микобактерии или Listeria.
В приводимых в данном тексте ссылках на молекулы CD, специфические иммунные клеточные подгруппы, иммунные реакции и т.п., в общем случае используется номенклатура, которая применима к молекулам, клеткам и т.п., содержащихся в организме человека. Аналоги или дубликаты таких молекул, клеток и т.п. у других видов могут иметь отличную номенклатуру, однако, они включаются в данное изобретение. Описание номенклатуры и функции различных молекул CD и иммунных клеточных подгрупп соответствует принятому в научной литературе. Ссылки на клетки Th0, Th1 или Th2, а также ссылки на иммунные реакции Тh1 или Th2 в контексте организма человека относятся к аналогам иммунных клеток Th0, Тh1 или Th2 или реакций в организме мышей или крыс. Соответствующие материалы приведены в литературе, см., например, А.К.Abbas et al., editors. Cellular and Molecular Immunology, W.B.Saunders Company, third edition, 1997, ISBN 0-7216-4024-9, pages 4-469, and I.Kimber and M.K.Selgrade, editors, Т Lymphocyte Subpopulations in Immunotoxicology, John Wiley & Sons Ltd., 1998, ISBN 0-471-97194-4, pages 1-53.
"Иммунодепрессивная молекула" означает такие молекулы, как циклоспорин, циклогексамид, митомицин С, адриамицин, таксол и амфотерицин В. Эти молекулы имеют тенденцию проявлять токсичность по отношению к иммунной системе и являются прямо или косвенно иммуннодепрессивными, т.е. токсичными для деления клеток, или могут подавлять иммунность.
"Стероидный рецептор" означает генный продукт, обычно белковый мономер или димер, который может присоединяться к лиганду, например природный стероид или его аналог, в частности соединения с формулой 1. Стероидные рецепторы включают одиночные стероидные рецепторы. Одиночные стероидные рецепторы являются белками, природный лиганд для которых или биологическая функция по меньшей мере частично неизвестны. Используемые здесь стероидные рецепторы включают гомодимеры, например, SXR и (CARβ)2, и гетеродимеры, например, PXR-CARβ. Стероидные рецепторы включают также изоформы, например, PXR.1 и PXR.2 для рецептора PXR, и гомологи для стероидных рецепторов, например, гомолог CARβ, известный как МВ67. Изоформы обычно получают различными способами сплайсинга для ядерной РНК из одного гена, в то время как гомологи обычно представляют собой отличную копию гена стероидного рецептора, при этом указанная копия кодирует только относительно малые отличия по сравнению с базовым продуктом гена стероидного рецептора. Такие отличия наиболее часто находят в зонах, отличных от зоны димеризации и зоны стероидной связи структуры стероидного рецептора. Обычно изоформы и гомологи связывают одинаковые или схожие лиганды, в частности базовый генный продукт или стероидный рецептор. Источником стероидных рецепторов может быть организм человека или животного, например, такие рецепторы можно получать из клеток, тканей или библиотек экспрессируемых последовательностей кДНК, в свою очередь полученных из клеток или тканей представителей семейств приматов, грызунов (включая мышей и крыс), птиц, овец, коров, лошадей, собак или кошек или каких-либо других видов или какого-либо вида в группе (например, семейства или класса) видов, указанных в данном описании или в какой-либо из приведенных здесь ссылок.
В контексте комбинации молекул, которая включает стероидный рецептор и соединение с формулой 1 термин "комплексы согласно изобретению" или "комплексы" означает комплекс, который содержит стероидный рецептор, соединение с формулой 1 и, возможно, другие молекулы. Указанные другие молекулы включают (1) последовательность распознавания ДНК (далее обозначаемую как ПРДНК), т.е. последовательность, которую специфически распознает и с которой соединяется стероидный рецептор, и (2) транскрипционный фактор, который может присоединяться к комплексу стероидного рецептора и соединения с формулой 1. Такие комплексы, используемые в данном изобретении, могут возникать в клетках в лабораторных условиях или в живом организме или в системах, не содержащих клеток. Комплексы включают, например, комбинации гетеродимера стероидного рецептора и соединения с формулой 1, комбинации гомодимера стероидного рецептора и соединения с формулой 1, комбинации мономера стероидного рецептора и соединения с формулой 1, комбинации гетеродимера стероидного рецептора, соединения с формулой 1 и ДНК (или ПРДНК), комбинации гомодимера стероидного рецептора, соединения с формулой 1 и ДНК (или ПРДНК), комбинации гетеродимера стероидного рецептора, соединения формулы 1 и транскрипционного фактора, комбинации гомодимера стероидного рецептора, соединения формулы 1 и транскрипционного фактора, комбинации гетеродимера стероидного рецептора, соединения формулы 1, ДНК (или ПРДНК) и транскрипционного фактора, а также комбинации гомодимера стероидного рецептора, соединения формулы 1, ДНК (или ПРДНК) и транскрипционного фактора.
"Агонист" или "антагонист" - соединение или композиция, которая, соответственно, увеличивает или уменьшает активность рецептора, способного приводить к увеличению или уменьшению транскрипции регулируемого гена. Рецепторы (и факторы транскрипции) могут модулировать транскрипцию их генов-мишеней путем увеличения или уменьшения транскрипции.
Общие способы. Описаны способы, например способ Карла Фишера (КФ) и способ потери при сушке (ППС) для определения содержания воды или растворителей в различных композициях. Способ ППС позволяет определить содержание всех летучих компонентов в образце, в то время как способ КФ обычно используют для определения общего содержания воды. Если вода является единственным присутствующим летучим компонентом, значения результатов, полученных способом ППС, равны или меньше результатов полученных способом КФ для данной композиции. Способ КФ измеряет содержание воды в гидратах соединений, а ППС определяет содержание как воды, так и других летучих компонентов, которые могут присутствовать. Композиции и составы согласно изобретению обычно анализируют на содержание влаги путем титрования способом КФ (используя, например, кулонометр Metrohm 684 KF или его аналог) в соответствии с опубликованной процедурой (U.S. Pharmacopoeia, vol. 23, 1995, chapter <921>, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD) и инструкциями изготовителя кулонометра. Количество материала, используемого при анализе, примерно 50-100 мг, взвешивают с помощью аналитических весов с точностью до пятого знака (Sartorius, Model RC210D, или пригодный аналог). Количество воды, задаваемое в соединениях и составах согласно изобретению, соответствует количеству, которое получают с помощью анализа КФ.
Способы рентгеновской дифракции на порошке (XRD) используют для исследования различных кристаллических соединений (см., например, U.S. Pharmacopoeia, volume 23, 1995, <941>, р.1843-1845, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD; Stout et al., X-Ray Structure Determination; A Practical Guide, MacMillan Co., New York, N.Y., 1986). Дифракционная картина или ее части, полученные для кристаллического соединения, обычно является средством диагностики для данной формы кристалла, однако, слабые или очень слабые дифракционные пики могут не всегда появляться в реплицированных дифракционных картинах, полученных в результате последовательных опытов с кристаллами. Кроме того, относительная интенсивность полос XRD, в особенности при низких значениях угла падения рентгеновских лучей (низкая тета), может изменяться вследствие эффектов предпочтительной ориентации, возникающих вследствие различия, например, габитуса кристаллов, размера частиц или других условий измерения. Пики в спектре XRD обычно определяют при данном значении тета +/- примерно от 0,1 до 0,2. Информация, полученная с помощью из 1, 2, 3, 4, 5 или большего количества пиков XRD основной интенсивности, возможно, связанная с одним или несколькими диагностическими параметрами (точка плавления, DSR, IR) обычно пригодна для того, чтобы описать или отличить кристаллический материал, в частности полугидрат BrEA, от других полукристаллических форм, которые содержат то же самое соединение.
Другие способы, которые используют для идентификации или описания кристаллического материала, в частности полугидрата BrEA, включают точку плавления (МР), дифференциальную сканирующую калориметрию (DSR) и инфракрасную абсорбционную спектроскопию (IR). DSC измеряет температуру теплового перехода, при которой кристалл поглощает или выделяет тепло, когда его кристаллическая структура изменяется или расплавляется. Данные о МР и температурах тепловых переходов DSC обычно являются воспроизводимыми в диапазоне примерно 1 или 2°С при последовательных анализах. IR измеряет поглощение инфракрасного излучения, ассоциируемое с наличием особых химических связей, соединенных с группами, например с гидроксилом, которые вибрируют под воздействием излучения с определенной длиной волны.
Варианты реализации изобретения. Согласно изобретению представлен полугидрат BrEA, который обычно практически не содержит других форм BrEA, например аморфного BrEA или безводного BrEA. Согласно данному изобретению полугидрат BrEA или кристаллический полугидрат BrEA представляет собой твердый BrEA и воду и имеет упорядоченное расположение практически всех молекул компонентов в определенной трехмерной пространственной структуре и решетке. Кристаллический полугидрат BrEA может включать один или несколько кристаллических габитусов, например, таблетки, стержни, пластины или иглы. Полугидрат BrEA, практически не содержащий других форм BrEA, означает сухой или практический сухой (с содержанием одной или нескольких жидкостей менее примерно 10% по массе от общей массы) твердый препарат, в котором более 55% по массе BrEA присутствует в форме полугидрата BrEA. Такие композиции содержат по меньшей мере около 60% по массе, или по меньшей мере около 70% по массе, или по меньшей мере около 80% по массе, обычно по меньшей мере около 90% по массе, или по меньшей мере около 95% по массе, или по меньшей мере около 98% по массе полугидрата BrEA, в то время как остальной BrEA присутствует в других формах, в частности в форме аморфного или безводного BrEA. Твердый полугидрат BrEA обычно содержит по меньшей мере около 90% по массе, обычно по меньшей мере примерно 97% или примерно 98% по массе соединения и менее примерно 10% по массе, обычно менее 3% или 2% по массе побочных продуктов, которые могут включать изомер 16β BrEA или один или несколько побочных продуктов синтеза BrEA. Часто твердый BrEA, который присутствует в твердой или жидкой среде, не содержит определяемого количества других форм BrEA (с помощью аналитических способов, в частности, FTIR, DSC или XRD), поэтому полугидрат может составлять примерно 99-100% по массе от общего присутствующего количества BrEA.
Другие варианты реализации изобретения включают композиции, которые содержат существенное количество полугидрата BrEA, присутствующего в композициях, включающих одну или несколько других форм BrEA, например, аморфный BrEA или безводный BrEA, а также, возможно, один или несколько других компонентов, в частности, описанных здесь наполнителей. Термин "существенное количество" полугидрата BrEA, используемый в данном описании, означает по меньшей мере 15-20% по массе или по меньшей мере около 20% по массе полугидрата BrEA от общего присутствующего количества BrEA, типично - по меньшей мере около 25% по массе, более типично - по меньшей мере около 30% по массе, часто - по меньшей мере около 35% по массе и обычно - по меньшей мере около 45% по массе. Такие композиции в общем случае представляют собой сухие вещества, например, составы или одинарные дозы, однако, они включают также суспензии, осадки, гели и коллоиды, которые содержат твердый BrEA. Такие суспензии или осадки можно получать, например, способом осаждения полугидрата BrEA из раствора, который содержит воду, или путем добавления твердого BrEA к жидким наполнителям. Очевидно, что композиции, которые содержат существенное количество BrEA, могут быть практически свободными от других форм твердого BrEA, как описано выше.
Полугидрат BrEA можно легко идентифицировать путем ссылки на полугидрат BrEA, отличающийся одним или несколькими следующими параметрами: температурой или температурным диапазоном (возможно выраженным как +/- 2°С) плавления или разложения, 2) одной или несколькими температурами или температурными диапазонами (возможно выраженными как +/- 2°С) перехода DSC полугидрата BrEA, 3) одной или несколькими характеристическими полосами поглощения IR полугидрата BrEA, 4) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пиков XRD наибольшей интенсивности (один или несколько из которых могут быть выражены как +/- 0,1° тета или +/- 0,2° тета), полученных из спектра XRD полугидрата BrEA с использованием излучения Cu-Кα (например, полученных способом, описанным в литературе U.S. Pharmacopoeia, volume 23, 1995, <941>, р.1843-1845), 5) наличием менее чем примерно 3% или менее чем примерно 2% по массе других соединений, 6) содержанием воды в сухом полугидрате BrEA примерно 2,5% по массе (например, 2,3-2,7% по массе), при этом сухой полугидрат BrEA означает соединение, высушенное фильтрацией, возможно, однократно промытое безводным растворителем, в частности гексаном, повторно профильтрованное и высушенное в вакууме примерно при 60°С до отсутствия потери массы после сушки при 60°С в течение 24 часов (например, если содержание воды определяют способом Карла Фишера или другим способом, описанным в U.S. Pharmacopoeia, vol.23, 1995, р.1801-1802 или 1840-1843, способы <731> или <921>), 7) клеточнымми константами и ориентационной матрицей, полученными способом рентгеновской кристаллографии монокристалла полугидрата BrEA (полученные, например, согласно описанию WO 99/04774 в примере 13), 8) описанием формы кристалла, наблюдаемой при увеличении примерно от 100Х до примерно 150Х способом микроскопии в поляризованном свете или 9) описанием среднего размера и формы кристалла полугидрата BrEA.
Так, например, полугидрат BrEA может отличаться своими одной или несколькими полосами поглощения, например карбонильными пиками при 1741 см-1 и 1752 см-1, а также своей температурой или диапазоном температур плавления или разложения и/или 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пиками XRD (обычно пиками наибольшей интенсивности) при значениях угла тета (угол рентгеновской дифракции), равных 17,8, 23,8, 24,2, 26,9-27,2, 28,6, 30,1 и 32,2.
Полугидрат BrEA пригоден для получения композиций, содержащих наполнители, которые можно использовать для фармацевтических или ветеринарных целей. Такие композиции используют для получения составов и дозированных продуктов. Дозированные продукты обычно включают таблетки, капсулы, лепешки или стерильные растворы, в том числе стерильные растворы для парентерального введения. Дозированные продукты в твердой форме обычно содержат примерно 5-1000 мг полугидрата BrEA, обычно около 20-400 мг, например около 25 мг, около 50 мг, около 100 мг, около 150 мг или около 250 мг в одной дозе.
Согласно изобретению осуществлен способ получения полугидрата BrEA, содержащего контактную воду, 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он и спирт С1-С6 (например, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол) и воду. Обычно присутствует только один спирт С1-С6, например этанол, который является безводным или который может содержать воду в количестве примерно до 2% по массе. В некоторых вариантах реализации изобретения в способе используется раствор, который содержит примерно 5-25% по массе воды, примерно 30-45% по массе этанола и примерно 30-45% по массе препарата BrEA. Типичные препараты BrEA являются твердыми и содержат BrEA по меньшей мере около 80% по массе, обычно по меньшей мере около 90% по массе или по меньшей мере около 95% по массе. Растворы могут содержать около 18-22% по массе воды, около 37-43% по массе этанола и около 37-43% по массе препарата BrEA. При реализации способа осаждения или кристаллизации типичная температура раствора составляет примерно от -20°С до примерно 45°С, обычно примерно от 0°С до примерно 20°С. Раствор выдерживают в этом температурном диапазоне в течение примерно от 30 мин до примерно 12 ч с возможным перемешиванием в процессе кристаллизации, при этом используют скорость перемешивания от медленной до умеренной.
Смежный вариант реализации представляет собой способ получения полугидрата BrEA, включающий осаждение BrEA из раствора, который содержит по меньшей мере примерно 15-25% по массе воды, примерно 35-45% по массе препарата BrEA и по меньшей мере примерно 35-45% по массе одного или нескольких смешивающихся с водой растворителей, обычно спиртов С1-6 (метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол). Препарат BrEA может содержать один или несколько побочных продуктов синтеза BrEA. Типичные препараты или дозированные продукты BrEA содержат менее чем примерно 5% по массе, обычно менее чем примерно 3% или примерно 2% по массе других соединений, в частности побочных продуктов синтеза BrEA. Операции данного способа включают контактирование воды с органическим раствором, который содержит BrEA и органический растворитель, в частности спирт С1-С6 (например, этанол) или ацетон. Добавление воды к таким растворам приводит к осаждению полугидрата BrEA. Растворы, которые содержат кристаллы или осадок полугидрата BrEA, являются вариантами реализации изобретения, используемыми для получения твердого BrEA, который затем высушивают и хранят, обычно при температуре окружающей среды.
Осаждение полугидрата BrEA из растворов, содержащих воду, выполняют известными способами, такими как, например, снижение температуры раствора, используя насыщенные или близкие к насыщению растворы BrEA, вакуумное концентрирование насыщенных или близких к насыщению растворов BrEA (как правило, выполняют при относительно низкой температуре, обычно около 15-25°С), затравливание насыщенных или близких к насыщению растворов BrEA кристаллами BrEA (например, около 10-100 мг на 1-10 л раствора), нагревание насыщенного или близкого к насыщению раствора BrEA (примерно 25-35°С в течение нескольких минут с последующим естественным снижением температуры или активным охлаждением раствора) и возможным затравливанием раствора кристаллами полугидрата BrEA или добавлением жидкости, например, дополнительного количества воды или этанола, к насыщенному или близкому к насыщению раствору BrEA в смеси воды и этанола, что вызывает пересыщение раствора. BrEA можно осаждать также из других растворителей или систем растворителей, включая ацетон и ацетон-этанол. Такие растворители обычно смешиваются с водой. Кроме того, можно использовать двухэтапное осаждение BrEA для извлечения твердого полугидрата BrEA, например, начальное осаждение и извлечение твердой фазы с последующим охлаждением и затравливанием маточного раствора или выдержка маточного раствора, например, в течение одного, двух или более дней при температуре окружающей среды, для получения второй партии кристаллов. Кроме того, кристаллы полугидрата BrEA можно подвергнуть повторной кристаллизации, как описано здесь, с целью дальнейшего улучшения очистки готового продукта. Способы кристаллизации органических соединений описаны в литературе, например, A.S.Myerson, Handbook of Industrial Crystallization, 1993, Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, p.1-101.
Другие родственные варианты реализации включают продукт, полученный способом контактирования раствора, содержащего BrEA, и органического растворителя с водой. Типичные растворы описаны выше, например раствор, содержащий примерно 3-5% по объему воды и по меньшей мере около 40% по объему одного или нескольких смешивающихся с водой растворителей, обычно полярных растворителей, в частности спиртов C1-6 или кетонов (например, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол, обычно этанол или ацетон). Эти процессы выполняют одним или несколькими способами, описанными в предыдущем абзаце, например, охлаждением насыщенного или близкого к насыщению раствора BrEA в воде и этаноле с возможным затравливанием охлажденного раствора полугидратом BrEA. Относящийся к этому вариант реализации включает растворы или твердую фазу, которые содержат влажные кристаллы или влажный отфильтрованный или отцентрифугованный осадок полугидрата BrEA, который можно получить после кристаллизации. Примеры таких вариантов реализации включают добавление воды к спиртовому раствору BrEA, в частности, медленное добавление примерно 0,5-1,5 объемов или примерно 0,8-1,2 объема воды примерно к 6 объемам раствора BrEA в этаноле для получения полугидрата BrEA. Другие примеры таких вариантов реализации включают добавление воды к раствору BrEA в кетоне-растворителе, в частности, медленное добавление примерно 0,5-1,5 объемов или примерно 0,8-1,2 объема воды примерно к 10 объемам раствора BrEA в ацетоне для получения полугидрата BrEA.
Другой родственный вариант реализации представляет собой полугидрат BrEA, измельченный до среднего размера частиц примерно 0,01-200 мкм, или примерно 0,1-10 мкм, или примерно 0,5-5 мкм. Таким образом, средний размер частиц или диаметр измельченного полугидрата BrEA может быть относительно малым, в частности примерно 0,03-2,0 мкм или примерно 0,1-1,0 мкм, или несколько большим, в частности примерно 0,5-5,0 мкм или примерно 1-5,0 мкм. Измельченный полугидрат BrEA пригоден для получения твердых и парентеральных составов для применения в медицинских и ветеринарных целях. Измельчение материала облегчает растворение полугидрата BrEA в растворителях или наполнителях, а также смешивание с твердыми компонентами или твердыми наполнителями.
Если субъекту можно вводить полугидрат BrEA в виде чистого соединения, то обычно он присутствует в форме твердого состава или используется для получения жидкого состава. Составы обычно используют для получения дозированных продуктов, в частности таблеток, капсул или лепешек для перорального, трансбуккального или подъязычного введения, которые содержат примерно 10-1000 мг или обычно около 25-400 мг полугидрата BrEA. В альтернативных случаях варианты реализации включают продукт для парентерального (например, подкожного, внутривенного, внутримышечного, интраперитонеального) введения, полученный способом контактирования полугидрата BrEA и жидкого наполнителя, например, одного, двух, трех или более из следующих соединений: PEG100, PEG200, PEG300, PEG400, пропиленгликоль, бензилбензоат, бензиловый спирт или этанол, возможной стерилизации раствора и возможного розлива раствора во флаконы или в ампулы (обычно из янтарного стекла), которые могут иметь одноразовое или многоразовое применение, и возможное хранение состава при пониженной температуре (около 0-12°С или около 2-10°С). Такие продукты для парентерального введения обычно содержат BrEA с концентрацией около 10-170 мг/мл, обычно около 20-110 мг/мл или около 30-100 мг/мл, а также, возможно, один или несколько из следующих компонентов: соль, буфер, бактериостат или консервант (например, NaCl, ВНА, ВНТ или EDTA).
Другие варианты реализации включают продукт, полученный в результате контактирования полугидрата, который может практически не содержать других форм BrEA, с наполнителем, пригодным для использования в медицинских или ветеринарных целях. Продукт полезен для получения составов или дозированных форм, которые содержат полугидрат.
Составы, полученные из полугидрата BrEA или содержащие его, обычно хранят при условиях, которые ограничивают количество воды, поступающей в состав, например, наличие силикагеля в герметичном контейнере, в котором находится состав. Характеристики водопроницаемости контейнеров описаны в литературе, например, Containers - Permeation, Chapter, USP 23, 1995, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD, p.1787.
Варианты реализации включают композиции согласно изобретению, которые кратковременно образуются при выполнении определенного технологического этапа или операции. Так, например, если соединение с формулой 1, в частности BrEA, содержащее менее 3% воды, контактирует с наполнителем, например с PEG, спиртом, пропиленгликолем или бензилбензоатом, композиция перед добавлением одного ингредиента к другому представляет собой неоднородную смесь. По мере контактирования ингредиентов однородность смеси возрастает и отношение между ингредиентами достигает желаемой величины. Таким образом, композиции согласно изобретению, которые содержат менее примерно 3% воды, могут содержать около 0,0001-99% соединения с формулой 1, в частности BrEA, и один или несколько наполнителей. Эти переходные композиции являются промежуточными продуктами, которые обязательно образуются при изготовлении композиции или состава, и они включены в число вариантов реализации изобретения до степени их патентоспособности.
Как правило, соединение с формулой 1, представленное в композициях и составах согласно изобретению, полностью растворяется в безводных наполнителях. Однако в некоторых вариантах реализации, например, переходные композиции и некоторые составы, соединение с формулой 1 частично растворяется, а остальная часть остается в виде твердой фазы, которая может быть суспензией или коллоидом.
Композиции и составы согласно изобретению, пригодные для парентерального введения соединений с формулой 1 человеку или животному, обычно содержат два, три или более наполнителей. Примеры таких вариантов реализации включают 1) один, два или три следующих ингредиента: PEG200, PEG300, этанол, бензилбензоат, и 2) два, три или четрые следующих ингредиента: пропиленгликоль, PEG100, PEG200, PEG300, PEG400 и бензилбензоат.
Композиции и составы согласно изобретению, как правило, содержат примерно 0,01-10% BrEA, обычно около 1-5%, и примерно 0,01-3% воды, типично около 0,05-3%, обычно около 0,1-1%. Составы согласно изобретению обычно представлены в одноразовой или многоразовой дозировке, пригодной для парентерального введения один или два раза в день или один раз в два-три дня. Дозированные продукты содержат примерно 3-1000 мг BrEA на одну дозу, типично примерно 5-500 мг, обычно примерно 10-200 мг. Для лечения ретровирусов, в частности, ВИЧ, одинарная доза содержит примерно 10-250 мг BrEA, обычно примерно 100-200 мг, в объеме примерно 1-6 мл, обычно 2-4 мл.
Варианты реализации изобретения включают продукт, полученный способом комбинирования, смешивания или иного контактирования BrEA и одного, двух или более наполнителей. Такие продукты получают обычными способами путем контактирования ингредиентов. Эти продукты могут содержать также разбавитель, агент, вызывающий дезинтеграцию и связующий агент или другие наполнители, указанные в данном описании или в литературе, приведенной здесь в качестве ссылки.
Установлено, что BrEA в присутствии значительного количества воды вызывает эпимеризацию у атома брома, что приводит к образованию смеси изомеров 16α- и 16β-BrEA. Композиции и составы согласно изобретению, содержащие BrEA или полугидрат BrEA, имеют содержание воды менее, чем примерно 3%, типично менее чем примерно 0,3%, обычно менее чем примерно 0,1%. Установлено, что эти композиции и составы имеют хорошую стабильность в процессе хранения при температуре окружающей среды (примерно 5-40°С, как используется в данном изобретении) в закрытых контейнерах по сравнению с контрольными композициями, которые содержат большее количество воды. Кроме того, неожиданно оказалось, что такие жидкости отличаются уменьшенным выпадением осадка соединения, которое вызывается водой.
Варианты реализации изобретения включают композиции, которые содержат менее чем примерно 3% воды, соединение с формулой 1 и соединение, которое не всегда считают пригодным для применения в организме человека, однако, оно является полезным для получения состава согласно изобретению, используемого в ветеринарии. Ветеринарные составы представляют собой композиции, полезные для введения согласно изобретению приматам, кошкам, собакам, лошадям, коровам, кроликами и другим животным, при этом указанные составы могут содержать наполнители, допустимые в ветеринарии и совместимые с соединениями, имеющими формулу 1, в частности, BrEA. Такие ветеринарные составы могут быть не всегда пригодными для организма человека, поскольку они содержат наполнитель, непригодный для организма человека, например спирт, отличный от этанола, в частности метанол, пропанол или бутанол. Обычно такие наполнители присутствуют в относительно малых количествах, например около 1-30%, обычно 1-5%.
Варианты изобретения включают композиции и составы, например, дозированные формы и стерильные растворы, которые содержат 1) примерно 1-100 мг/мл одного или нескольких соединений с формулой 1, примерно 57,5% пропиленгликоля, примерно 25% PEG300, примерно 12,5% этанола и примерно 5% бензилбензоата, 2) примерно 1-60 мг/мл одного или нескольких соединений с формулой 1, примерно 70% пропиленгликоля, примерно 25% PEG300 и примерно 5% бензилбензоата, 3) примерно 1-60 мг/мл одного или нескольких соединений с формулой 1, примерно 25% PEG300, примерно 35% пропиленгликоля, примерно 35% маннитола и примерно 5% бензилбензоата, 4) примерно 1-60 мг/мл одного или нескольких соединений с формулой 1, примерно 57,5% пропиленгликоля, смесь, содержащую примерно 25% PEG300 и PEG200 (например, PEG300:PEG200 в соотношении примерно от 1:10 до примерно 10:1), примерно 12,5% этанола и примерно 5% бензилбензоата, 5) примерно 1-60 мг/мл одного или нескольких соединений с формулой 1, примерно 75% пропиленгликоля, смесь, содержащую примерно 25% PEG300 и PEG200 (например, PEG300:PEG200 в соотношении примерно от 1:10 до примерно 10:1) и примерно 5% этанола, 6) примерно 1-60 мг/мл одного или нескольких соединений с формулой 1, смесь, содержащую примерно 25% PEG300 и PEG200 (например, PEG300:PEG200 в соотношении примерно от 1:10 до примерно 10:1), примерно 35% пропиленгликоля, примерно 35% маннитола и примерно 5% бензилбензоата, 7) любой из составов 1-6 с содержанием одного или нескольких соединений с формулой 1 примерно 40-55 мг/мл, 8) любой из составов 1-7 с содержанием одного или нескольких соединений с формулой 1 примерно 30-100 мг/мл, 9) любой из составов 1-8, в которых присутствуют 1, 2, 3 или 4 соединения с формулой 1, 10) любой из составов 1-9, в которых присутствуют 1 или 2 соединения с формулой 1, 11), любой из составов 1-8, в которых присутствуют 1 соединение с формулой 1, 12) любой из составов 1-11, в которых соединение с формулой 1 независимо содержит в 1, 2 или 3 из каких-либо R1-R6, R10, R15, R17 или R18 независимо выбранный сложный эфир, сложный тиоэфир, карбамат, аминокислоту или пептид из 1 или 2 независимо выбранных соединений с формулой 1, 13) любой из составов 1-12, в которых соединение с формулой 1 содержит или представляет собой BrEA или полугидрат BrEA, 14) любой из составов 1-13, в которых соединение с формулой 1 содержит или представляет собой сложный эфир, сложный сульфатный эфир или сложный фосфиновый эфир BrEA.
Другие варианты реализации включают продукт, полученный в результате выдержки композиций или составов согласно изобретению, например, дозированных форм, каких-либо из описанных выше вариантов реализации 1-14, или композиций, применяемых для получения составов примерно при 10-40°С в течение по меньшей мере 3 дней, например, выдержка при температуре окружающей среды в течение примерно 1-24 месяцев. В течение указанных периодов времени составы согласно изобретению обычно выдерживают в герметизированных или заваренных индукционной сваркой контейнерах. Композиции согласно изобретению обычно выдерживают в закрытых контейнерах. В описании и формуле изобретения приведены примеры пригодных соединений и дозированных форм для этих вариантов реализации.
Другие варианты реализации включают композиции и составы, в которых один или несколько R1-R6, R10, R15, R17 или R18 содержат аминокислоту или пептид, например, R1, R2 или R4 содержит аминокислоту или пептид, R3 является галогеном, а оба R5 и R6 представляют собой -СН3. Пептид в одном или нескольких R1-R6 может представлять собой пептид, присоединяющийся к поверхности клеток, в частности, полный белок, или последовательность из фибронектина или ретронектина, например, KQAGDV.
В соединениях с формулой 1 каждый R4 выбирают независимо. В некоторых вариантах реализации один R4 является водородом, а другой - каким-либо иным радикалом. В других вариантах реализации оба R4 представляют собой независимо выбранные радикалы, отличные от водорода, например, органическая группа С1-С20.
R1-R6, R10, R15, R17 или R18 включают группы, например, сложные эфиры, сложные тиоэфиры, карбонаты, аминокислоты, пептиды и/или карбаматы, которые химически и/или ферментативно гидролизуются, часто при физиологических условиях. Такие группы выбирают независимо. Обычно такие группы инициируют образование -ОН, -SH или -NH2 в позициях R1-R6 стероидного ядра. Варианты реализации соединений с формулой 1 включают такие соединения, в которых 1) один из R1, R2 и R4 является гидролизуемой группой (например, сложный эфир, сложный тиоэфир, карбонат, аминокислота, пептид и/или карбамат), два других R1, R2 и R4 представляют собой -Н, R3 не является водородом, а оба R5 и R6 представляют собой -СН3, 2) два из R1, R2 и R4 являются гидролизуемыми группами (например, независимо выбранные сложные эфиры, сложные тиоэфиры, карбонаты, аминокислоты, пептиды и/или карбаматы), два других R1, R2 и R4 представляют собой -Н, R3 не является водородом, а оба R5 и R6 представляют собой -СН3, 3) R1, R2 и R4 являются гидролизуемыми группами, R3 не является водородом, а оба R5 и R6 представляют собой -СН3. В данных вариантах реализации группа R3 обычно имеет β-конфигурацию, а группы R1, R2 и R4-R6 обычно имеют α-конфигурацию.
В других вариантах реализации одна или несколько групп R1-R6, R10, R15, R17 и R18, обычно одна, содержат аминокислоту или пептид, в то время как остальные группы выбирают независимо из определенных здесь групп. В этих вариантах реализации пептиды обычно представляют собой димеры (дипептиды) или тримеры (трипептиды). Так, например, если один из R1, R2 или R4 содержит аминокислоту, остальные из R1, R2 и R4 независимо содержат -ОН, =O, сложный эфир, карбонат или карбамат, в то время как R3 представляет собой галоген, гидроксил или сложный эфир, а R5 и R6 независимо представляют собой -Н, -(СН2)n-СН3, -(СН2)n-СН2OH, или -(СН2)n-CH2F, -(СН2)2-4-O-(СН2)2-4-СН3, где n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, часто 0, 1, или 2, обычно 0. Обычно сложный эфир, карбонат или карбамат могут подвергаться гидролизу при физиологических условиях.
Гидролизуемые группы обычно включают ацильные группы, сложные эфиры, простые эфиры, простые тиоэфиры, амиды, аминокислоты, пептиды, карбонаты и/или карбаматы. В общем случае, структура гидролизуемых групп не является критичной и может изменяться. В некоторых вариантах реализации эти группы содержат в сумме от примерно 4 до примерно 10 атомов углерода. В других вариантах реализации такие группы включают органическую группу, как описано выше для сложного эфира, которая содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 атомов углерода и 1, 2, 3, 4, 5 или 6 гетероатомов, например кислорода, азота или серы. Эти гидролизуемые группы могут не включать групп, имеющих заряды в плазме, крови, внутриклеточной цитоплазме или в кишечнике, или они могут иметь 1, 2, 3 или более положительных, отрицательных или положительных и отрицательных зарядов при одном или нескольких из этих условий. Заряды могут частично зависеть от группы и условий, в которых она находится. Эти гидролизуемые группы могут содержать 1, 2, 3, 4 или более замещений одного или нескольких атомов водорода и/или одного или нескольких атомов углерода, например, -ОН, защищенный гидроксил, -SH, защищенный тиол, карбоксил, защищенный карбоксил, амин, защищенный амин, -О-, -S-, -CO-, -CS-, алкокси, алкитио, алкенилокси, арил, ОР(O)(O)-O-, -OS(O)(O)-O- и/или гетероцикл. Такие замещения выбирают независимо.
Соединения с формулой 1, которые содержат одну или несколько гидролизуемых групп, могут включать одну или несколько из следующих независимо выбранных групп: -O-CHR24C(O)OR25, -S-CHR24C(O)OR25, -NH-CHR24C(O)OR25, -O-CHR24C(S)OR25, -S-CHR24C(S)OR25, -NH-CHR24C(S)OR25, -O-CHR24OC(O)R25, -S-CHR24OC(O)R25, -NH-CHR24OC(O)R25, -O-CHR24C(O)N(R25)2, -S-CHR24C(O)N(R25)2, -NH-CHR24C(O)N(R25)2, -O-CHR24OR25, -S-CHR24OR25, -NH-CHR24OR25, -O-CHR24C(R25)2CH2OX, -S-CHR24C(R25)2CH2OX, -NH-CHR24C(R25)2CH2OX, -O-CHR24C(R25)2OX, -S-CHR24C(R25)2OX или -NH-CHR24C(R25)2OX, которые содержат один или несколько из R1-R6, R10, R15, R17 и R18. Для этих гидролизуемых групп R24 независимо представляет собой -Н, -СН2-С6Н5, -СН2СН2-С6Н5, алкил C1-8, алкенил С2-8, арил или гетероцикл, при этом каждый алкил, алкенил, арил и гетероцикл может быть независимо замещен 1, 2 или 3, обычно 1, -О-, -S-, -NH-, галогеном, арилом, -OX, -SX, -NHX, кетоном (=O) или -CN, или алкил C1-8 может быть замещен 3, 4, 5 или 6 галогенами, а Х представляет собой -Н или защитную группу. Примерами R24 являются -Н, -СН3, -С2Н5, алкил -CH2-C1-5 с возможным замещением, алкил -CH2CH2-C1-4 с возможным замещением и алкил -CH2CH2-O-C1-4 с возможным замещением. R25 независимо представляет собой -Н, -СН2-С6Н5, -СН2СН2-С6Н5, алкил C1-12, алкенил С2-12, арил, гетероцикл, -СН2-гетероцикл или -СН2-арил, при этом каждый алкил, алкенил, арил, гетероцикл, -СН2-гетероцикл или -СН2-арил может быть независимо замещен 1, 2 или 3, обычно 1, -О-, -S-, -NH-, галогеном, арилом, -OX, -SX, -NHX, кетоном (=O) или -CN, или алкил С1-12, алкенил C2-12 или арил могут быть независимо замещены 3, 4, 5 или 6 галогенами, а Х представляет собой -Н или защитную группу, или арил, гетероцикл, -СН2-гетероцикл или -СН2-арил могут быть независимо замещены 1, 2 или 3 алкильными группами С1-4 или 1, 2 или 3 алкоксигруппами С1-4 в ариловой группе или в гетероцикле, обычно - в атоме углерода, находящемся в кольце. Примерами R25 являются -Н, -СН3, -С2Н5, -С3Н7, -С4Н9, -С6Н13, -С6Н5, -С6Н4OH, -С6H4ОСН3, -C6H4F, алкил -CH2-C1-5 с возможным замещением, алкил -CH2CH2-C1-4 с возможным замещением и алкил -CH2CH2-O-C1-4 с возможным замещением.
Варианты реализации соединений формулы 1 могут включать или исключать любую подгруппу соединений в пределах определения формулы 1 при условии, что остается по меньшей мере одно соединение. Так, например, подгруппа соединений с формулой 1, которую обычно включают, в частности, в число неводных составов согласно изобретению, протоколов прерывистого дозирования согласно изобретению и способов иммунной модуляции, представляет собой соединения с формулой 1, где R2 - гидроксил или группа, которую можно гидролизовать в гидроксил, в какой-либо конфигурации, а R5 и R6 являются метилом в α-конфигурации. Соединения подгруппы, которые могут быть исключены из соединений с формулой 1, содержат одно или все соединения, которые описаны в одной или нескольких известных ссылках или публикациях, например, одно или несколько соединений, которые описаны в цитируемых здесь ссылках, в особенности это касается соединений, которые могут относиться к пункту формулы изобретения или варианту реализации, непатентоспособным вследствие отсутствия новизны, очевидности и/или отсутствия изобретательского уровня изобретения.
Примеры вариантов реализации видов и родов соединений формулы 1 названы согласно приведенному ниже описанию.
Группа 1. Примеры вариантов реализации включают соединения с формулой 1, названные согласно обозначениям структуры соединений, приведенных ниже в таблицах А и В. Каждое соединение, указанное в таблице В, представлено как соединение, имеющее формулу В
где оба R5 и R6 представляют собой -СН3, в позициях 1-2-, 4-5- или 5-6- отсутствует двойная связь, один R4 является водородам, все R7, R8 и R9 представляют собой -СН2-, а R1, R2, R3 и R4 являются заместителями, представленными в таблице А. Соединения, названные согласно таблицам А и В, относятся к соединениям "группы 1".
Соединения, указанные в таблице В, названы по номерам, присвоенным R1, R2, R3 и R4 в соответствии со следующим правилом наименования соединений: R1.R2.R3.R4, исходя из количества химических заместителей, указанных в таблице А. Каждый номер в таблице А обозначает отдельную структуру для каждого из R1, R2, R3 и R4. Если R1, R2, R3 или R4 является двухвалентной группой, например =O, водород в соответствующей позиции отсутствует. Таким образом, соединение группы 1, названное 1.2.1.1, представляет собой структуру формулы В с β-гидроксилом, присоединенным к атомам углерода в 3 и 7 позициях (переменные группы R1 и R2, соответственно), с атомом α-брома, присоединенного к атому углерода в позиции 16 (переменная группа R3), и с двойной кислородной связью (=O) у атома углерода в позиции 17 (переменная группа R4), т.е. соединение 1.2.1.1 имеет структуру, показанную ниже.
Дополнительные группы соединений по формуле В включают следующие группы соединений, описанные ниже. Если не оговорено особым образом, конфигурации атомов водорода и R групп для следующих групп соединений такие же, как определены для соединений группы 1 формулы В, описанной выше.
Группа 2. Эта группа включает соединения, названные в Таблице В, имеющие R1, R2, R3 и R4 заместители, определенные в Таблице А где R1, R2, R3 и R4 заместители присоединены к стероидному ядру, описанному для соединений группы 1, за исключением того, что в положении 5-6 присутствует двойная связь. Таким образом, соединение 1.3.1.1 группы 2 имеет структуру
Группа 3. Эта группа включает соединения, названные в Таблице В, имеющие R1, R2, R3 и R4 заместители, определенные в Таблице А где R1, R2, R3 и R4 заместители присоединены к стероидному ядру, описанному для соединений группы 1, за исключением того, что в положении 1-2 и 5-6 присутствуют двойные связи. Таким образом, соединение 2.2.5.1 группы 3 имеет структуру
Группа 4. Эта группа включает соединения, названные в Таблице В, имеющие R1, R2, R3 и R4 заместители, определенные в Таблице А где R1, R2, R3 и R4 заместители присоединены к стероидному ядру, описанному для соединений группы 1, за исключением того, что в положении 1-2 присутствует двойная связь. Таким образом, соединение 5.2.7.8 группы 4 имеет структуру
Группа 5. Эта группа включает соединения, названные в Таблице В, имеющие R1, R2, R3 и R4 заместители, определенные в Таблице А, где R1, R2, R3 и R4 заместители присоединены к стероидному ядру, описанному для соединений группы 1, за исключением того, что в положении 4-5 присутствует двойная связь. Таким образом, соединение группы 5, обозначенное как 3.5.2.9, имеет структуру
Группа 6. Эта группа включает соединения, названные в Таблице В, имеющие R1, R2, R3 и R4 заместители, определенные в Таблице А, где R1, R2, R3 и R4 заместители присоединены к стероидному ядру, описанному для соединений группы 1, за исключением того, что в положении 1-2 и 4-5 присутствуют двойные связи. Таким образом, соединение группы 6, обозначенное как 10.2.7.8, имеет структуру
Группы с 7-1 по 7-6. Эти группы включают соединения 6 групп, описанных выше, с тем отличием, что R5 представляет собой водород, а не метильную группу. Таким образом, группа 7-1 имеет такое же стероидное ядро, как и группа 1 выше, т.е. двойные связи отсутствуют, но R5 представляет собой -Н. Группа 7-2 имеет такое же стероидное ядро как и группа 2 выше, т.е. двойная связь присутствует в положении 5-6, но R5 представляет собой -Н. В группах соединений с 7-3 до 7-6 стероидное ядро определяется тем же способом. Таким образом, соединения, называемые 1.2.1.9 в группах с 7-1 по 7-6, имеют структуры
Группы с 8-1 по 8-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах 1-6, с тем отличием, что R5 формулы В представляет собой -СН2ОН, а не метильную группу. Соединения групп с 8-1 по 8-6 имеют структуры, которые обозначаются таким же образом, как соединения групп 1-6, с тем отличием, что в положении R5 присутствует -СН2OH, а не метильная группа. Эти группы называются так же, как группы с 7-1 по 7-6. Таким образом, соединения, называемые 1.2.1.9 в группах с 8-1 по 8-2, имеют структуры
Группы с 9-1 по 9-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений 1-6, с тем отличием, что R6 формулы В представляет собой водород, а не метильную группу. Соединения групп с 9-1 по 9-6 имеют структуры, которые обозначаются таким же образом, как соединения групп с 7-1 по 7-6, с тем отличием, что в положении R6 присутствует -Н, а не метильная группа. Таким образом, соединения, называемые 1.2.1.9 в группах с 9-1 по 9-2, имеют структуры
Группы с 10-1 по 10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений 1-6, где R6 формулы 1 представляет собой -СН2ОН, а не метильную группу. Соединения групп с 10-1 по 10-6 имеют структуры, которые обозначаются таким же образом, как соединения групп с 7-1 по 7-6, с тем отличием, что в положении R5 присутствует -СН2OH, а не метильная группа. Таким образом, соединения, называемые 1.2.1.9 в группах 10-1 и 10-2, имеют структуры
Группы с 11-1 по 11-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, где R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А заменены на следующие заместители:
1) -O-С(O)-СН2СН2СН2СН3 (-O-С(O)-СН2СН2СН2СН3 заменяет -ОН, который является R1 заместителем 1 в Таблице А)
2) -O-С(O)-СН2СН2СН2СН2СН2СН3
3) -O-С(O)-СН2СН2OCH2СН3
4) -O-С(O)-СН2СН2OCH2СН2OCH2СН3
5) -O-С(O)-СН2СН2СН2СН2OCH2СН3
6) -O-С(O)-СН2СН2OCH2СН2СН2СН3
7) -O-С6Н4Cl
8) -O-С6Н3F2
9) -O-С6Н4-O(СН2)2-O-СН2СН3
10) -O-С6Н4-С(O)O(СН2)0-9СН3
Соединения групп с 11-1 по 11-6 имеют структуры, которые обозначаются таким же образом, как соединения групп с 7-1 по 7-6, с тем отличием, что заместители 1-10, указанные в Таблице А, в положении R1 заменены на заместители 1-10, приведенные выше. Таким образом, соединения, называемые 1.2.1.9 в группах 11-1 и 11-2, имеют структуры
Соединения групп 11-7-1 и 11-7-2, обозначенные 1.2.1.9, имеют структуры
Группы с 12-1 по 12-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, где R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-Р(O)(O)-ОСН2СН(СН3)СН3 (-O-Р(O)(O)-ОСН2СН(СН3)СН3 заменяет -ОН, который является R1 заместителем 1 в Таблице А)
2) -O-Р(O)(O)-ОСН2СН2СН2СН2СН3
3) -O-Р(O)(O)-ОСН2СН2СН2СН2СН2СН3
4) -O-Р(O)(O)-ОСН2СН2СН(СН2СН2)СН3
5) -O-СН2СН2СН2СН2СН2СН3
6) -O-С2Н5
7) -O-СН2СН2СН3
8) -O-СН2СН2СН2СН3
9) -O-СН(СН3)СНСН3
10) -O-С(СН3)3
Группы с 13-1 по 13-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-(СН2)4СН3 (-O-(СН2)4СН3 заменяет -ОН, который является R1 заместителем 1 в Таблице А)
2) -O-C(O)-NH2
3) -O-С(O)-NHCH3
4) -O-C(O)-NHC2H5
5) -O-С(O)-NHCH2СН2СН3
6) -O-С(O)-NHCH2СН2OCH2СН3
7) -O-С(O)-СН3
8) -O-С(O)-С2Н5
9) -O-С(O)-СН2СН2СН3
10) -O-С(O)-СН2СН2СН2СН3
Группы с 14-1 по 14-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-СН2С6Н5
2) -O-СН2С6Н5
3) -О-CH2С6H4ОСН3
4) -O-СН2С6Н4OCH3
5) -O-СН2С6Н4F
6) -O-СН2С6Н4F
7) -O-СН2С6Н3(ОСН3)2
8) -O-СН2С6Н3(ОСН3)2
9) -O-СН2С6Н4OCH2СН3
10) -O-СН2С6Н4OCH2СН3
Группы с 15-1 по 15-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-C(O)-CH2CH2NH2 (-O-C(O)-CH2CH2NH2 заменяет -ОН, который является R1 заместителем 1 в Таблице А)
2) -O-C(O)-CH2CH2CH2NH2
3) -O-С(O)-СН2OH
4) -O-С(O)-СН2СН2OH
5) -O-С(O)-СН2СН2СН2OH
6) -O-C(O)-CH2SH
7) -O-C(O)-CH2CH2SH
8) -O-C(O)-CH2CH2CH2SH
9) -O-S(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С2Н5
10) -O-Р(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С2Н5
Группы с 16-1 по 16-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-C(O)-A4-NH2, где A4-NH2 представляет собой алкильную группу из 4 атомов углерода, замещенную -NH2; (-O-C(O)-A4-NH2 заменяет -ОН, который является R1 заместителем 1 в Таблице А)
2) -O-C(O)-A6-NH2, где А6- представляет собой алкильную группу из 6 атомов углерода, замещенную -NH2
3) -O-C(O)-A8-NH2, где A8-NH2 представляет собой алкильную группу из 8 атомов углерода, замещенную -NH2
4) -O-С(O)-А4-ОН, где А4-ОН представляет собой алкильную группу из 4 атомов углерода, замещенную -ОН или -O-
5) -O-С(O)-А6-ОН, где А6-ОН представляет собой алкильную группу из 6 атомов углерода, замещенную -ОН или -O-
6) -O-С(O)-А8-ОН, где А8-ОН представляет собой алкильную группу из 8 атомов углерода, замещенную -ОН или -O-
7) -O-S(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С3Н7
8) -O-Р(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С3Н7
9) -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C4H9
10) -O-Р(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С4Н9
Группы с 17-1 по 17-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R1 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-S(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С6Н13
2) -O-Р(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-С6Н13
3) -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C8H17
4) -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-C8H17
5) -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C5H10OH
6) -O-Р(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-СН2С5Н10ОН
7) -O-S(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-СН2С3Н6ОН
8) -O-Р(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-ОН)-СН2-O-С(O)-СН2С3Н6ОН
9) -O-S(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C7H14OH
10) -O-P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-OH)-CH2-O-C(O)-CH2C7H14OH
Группы с 18-1 по 18-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R4 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-C(O)CH2NH2
2) -O-C(O)C(CH3)H-NH2
3) -O-С(O)С(СН2С6Н5)Н-NH2
4) -O-С(O)-O-NHC(СН3)Н-CO2Н
5) -O-C(O)-O-NHCH2-CO2H
6) -O-C(O)-O-NH(CH2C6H5)H-CO2H
7) -O-С(O)-CF3
8) -O-С(O)-СН2CF3
9) -O-С(O)-(СН2)3CF3
10) -O-С(O)-(СН2)5СН3
Группы с 19-1 по 19-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R4 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(O)-O-СН3
2) -O-С(O)-O-СН2СН3
3) -O-С(O)-O-С3Н7
4) -O-С(O)-O-С4Н9
5) -O-С(O)-O-С6Н13
6) -O-С(O)-O-С6Н5
7) -O-С(O)-O-С6Н4OH
8) -O-С(O)-O-С6Н4OCH3
9) -O-С(O)-O-С6Н4OCH2СН3
10) -O-С(O)-O-С6Н4F
Группы с 20-1 по 20-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R4 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(O)-S-СН3
2) -O-С(O)-S-СН2СН3
3) -O-С(O)-S-С3Н7
4) -O-C(O)-S-C4H9
5) -O-С(O)-S-С6Н13
6) -O-С(O)-S-С6Н5
7) -O-С(O)-S-С6Н4OH
8) -O-С(O)-S-С6Н4OCH3
9) -O-С(O)-S-С6Н4OCH2СН3
10) -O-С(O)-S-С6Н4F
Группы с 21-1 по 21-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R4 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(S)-O-СН3
2) -O-С(S)-O-СН2СН3
3) -SH
4) =S
5) -O-C(S)-O-C6H13
6) -O-С(O)-O-СН2С6Н5
7) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OH
8) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OCH3
9) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OCH2СН3
10) -O-С(O)-O-СН2С6Н4F
Группы с 22-1 по 22-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R2 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(S)-O-СН3
2) -O-С(S)-O-СН2СН3
3) -O-С(S)-O-С3Н7
4) -O-C(S)-O-C4H9
5) -O-С(S)-O-С6Н13
6) -O-С(O)-O-СН2С6Н5
7) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OH
8) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OCH3
9) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OCH2СН3
10) -O-С(O)-O-СН2С6Н4F
Группы с 23-1 по 23-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, где R3 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(S)-O-СН3
2) -O-С(S)-O-СН2СН3
3) -O-С(S)-O-С3Н7
4) -O-C(S)-O-C4H9
5) -O-C(S)-O-C6H13
6) -O-С(O)-O-СН2С6Н5
7) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OH
8) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OCH3
9) -O-С(O)-O-СН2С6Н4OCH2СН3
10) -O-С(O)-O-СН2С6Н4F
Группы с 24-1 по 24-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R2 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(O)-O-С6Н5
2) -O-С(O)-O-С6Н4OCH3
3) -SH
4) =S
5) -O-CHR24-C(O)-OR25
6) -O-CHR24-C(O)-R25
7) -O-CHR24-C(O)-N(R25)2
8) -O-CHR24-C(O)-NHR25
9) -O-CHR24-C(O)-NH2
10) -О-CHR24-С(O)-ОС6Н5
Группы с 25-1 по 25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 10-6, в котором R3 заместители 1-10, указанные в Таблице А, заменены на следующие группы:
1) -O-С(O)-O-С6Н5
2) -O-С(O)-O-С6Н4OCH3
3) -SH
4) =S
5) -O-CHR24-C(O)-OR25
6) -O-CHR24-C(O)-R25
7) -O-CHR24-C(O)-N(R25)2
8) -O-CHR24-C(O)-NHR25
9) -O-CHR24-C(O)-NH2
10) -O-CHR24-C(O)-OC6H5
Группы с 26-1 по 26-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R7 в формуле В представляет собой -О- вместо -СН2-. Так, соединения групп 26-1 и 26-2, обозначенные 1.2.5.9, имеют структуры
Соединения, обозначенные 1,2.5.9 для групп соединений 26-8-1 и 26-8-2, имеют структуры
Соединения, обозначенные 1.2.5.9 для групп соединений 26-11-1 и 26-11-2, имеют структуры
Группы с 27-1 по 27-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R8 в формуле В представляет собой -О- вместо -CH2-. Так, соединения групп 26-1 и 26-2, обозначенные 1.2.5.9, имеют структуры
Соединения, обозначенные 1.2.5.9 для групп соединений 27-8-1 и 27-8-2, имеют структуры
Соединения, обозначенные 1.2.5.9 для групп соединений 27-11-1 и 27-11-2, имеют структуры
Группы с 28-1 по 28-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R9 в формуле В представляет собой -О- вместо -СН2- и двойная связь в положении 1-2 отсутствует. Так, например, отсутствуют группы 28-3, 28-4, 28-6, 28-8-3, 28-8-4 или 28-8-6, поскольку двойная связь 1-2 присутствует в этих соединениях и кислород кольца во 2 позиции был бы заряжен. Соединения из групп 28-1, 28-2 и 28-5, обозначенные 1.2.5.9, имеют структуры
Соединения групп 28-8-1, 28-8-2, обозначенные 1.2.5.9, имеют структуры
Соединения групп 28-11-1, 28-11-2, обозначенные 1.2.5.9, имеют структуры
Группы с 29-1 по 29-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R7 представляет собой -NH- вместо -СН2-. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 30-1 по 30-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R8 представляет собой -NH- вместо -СН2-. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 31-1 по 31-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R9 представляет собой -NH- вместо -СН2- и двойная связь в положении 1-2 отсутствует. Так, например, отсутствуют группы 31-3, 31-4, 31-6, 31-8-3, 31-8-4 или 31-8-6. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 32-1 по 32-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором два из R7, R8 и R9 независимо представляют собой -NH-, -О- или -S- вместо -СН2-. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 33-1 по 33-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором каждый из R7, R8 и R9 независимо представляет собой -NH-, -О- или -S- вместо -СН2-. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 34-1 по 34-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R7 представляет собой -S- вместо -СН2-. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 35-1 по 35-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R8 представляет собой -S- вместо -СН2-. Соединения называются , как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 36-1 по 36-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное в группах соединений с 1 по 25-10-6, в котором R9 представляет собой -S- вместо -СН2- и двойная связь в положении 1-2 отсутствует. Так, например, отсутствуют группы 36-3, 36-4, 31-6, 36-8-3, 36-8-4 или 36-8-6. Соединения называются, как описано для групп соединений с 26-1 по 26-25-10-6.
Группы с 37-1 по 37-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное во всех группах соединений с 1 по 36-25-10-6, описанных выше, в котором R1 не является двухвалентным, например, не =O, и находится в α-конфигурации вместо β-конфигурации как показано в формуле В.
Группы с 38-1 по 38-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное во всех группах соединений с 1 по 36-25-10-6, описанных выше, в котором R2 не является двухвалентным, например, не =O, и находится в α-конфигурации вместо β-конфигурации, как показано в формуле В.
Группы с 39-1 по 39-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное во всех группах соединений с 1 по 36-25-10-6, описанных выше, в котором R3 не является двухвалентным, например, не =O, и находится в α-конфигурации вместо β-конфигурации, как показано в формуле В.
Группы с 40-1 по 40-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное во всех группах соединений с 1 по 36-25-10-6, описанных выше, где R4 не является двухвалентным, например, не =O, и находится в α-конфигурации вместо β-конфигурации, как показано в формуле В.
Группы с 41-1 по 41-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное во всех группах соединений с 1 по 36-25-10-6, описанных выше, в котором R2 и R4 являются двухвалентным, например, не =O, и находятся в α-конфигурации вместо β-конфигурации, как показано в формуле В.
Группы с 42-1 по 42-25-10-6. Эти группы включают каждое соединение, обозначенное во всех группах соединений с 1 по 36-25-10-6, описанных выше, в котором если в 5-положении присутствует водород, то он в β-конфигурации вместо α-конфигурации, как показано в формуле В.
Любое соединение или общность соединений, которая названа в группах соединений с 1 по 42-25-10-6, подходит для использования в изложенных здесь способах.
В некоторых реализациях один или более из R1-R6, R10, R15, R17 и R18 независимо имеет структуру/структуры и/или независимо включает названные соединения, -Н, -ОН, =O, -SH, =S, -NH2, -CN, -N3, галоген, -CH2, =NOH,=NOC(O)CH3, -С(O)-СН3, -С(O)-(СН2)1-4-СН3, -ССН, -СССН3, -СН=СН2, -СН=СН2СН3, -O-С(O)-(СН2)m-(CF2)n-СН3, -O-C(O)-(CH2)m-(CF2)n-CF3, -O-C(O)-(CH2)m-(CF2)n-CH2F, -O-С(O)-O-(СН2)m-(CF2)n-СН3, -O-С(O)-O-(СН2)m-(CF2)n-CF3, -O-С(O)-O-(CH2)m-(CF2)n-CH2F, -O-С(O)-NH-(СН2)m-(CF2)n-СН3, -O-C(O)-NH-(CH2)m-(CF2)n-CF3, -O-C(O)-NH-(CH2)m-(CF2)n-CH2F (где m равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, обычно n равно 0), -CH(CH3)-(CH2)2-C(O)NH-CH2COOH, -CH(CH3)-(CH2)2-C(O)NH-CH2SO3H, -OSi(СН3)2С(СН3)3, -С(ОН)=СНСН3, =СН(СН2)0-15СН3, -(CH2)0-14CH2F, -(СН2)0-14СН2Cl, -(СН2)0-14СН2Br, -(CH2)0-14CH2I, -(CH2)2-10-О-(СН2)0-4СН3, -(СН2)2-10-S-(СН2)0-4СН3, -(CH2)2-10-NH-(CH2)0-4CH3, -O-(CH2)0-14CH2F, -O-(СН2)0-14СН2Cl, -O-(CH2)0-14CH2Br, -O-(CH2)0-14CH2I, -O-(СН2)2-10-O-(СН2)0-4СН3, -O-(CH2)2-10-S-(CH2)0-4CH3, -O-(СН2)2-10-NH-(СН2)0-4СН3, -O-С(O)-(СН2)0-14СН2F, -О-С(О)-(СН2)0-14СН2Cl, -O-С(O)-(СН2)0-14СН2Br, -O-C(O)-(CH2)0-14CH2I, -O-С(O)-(СН2)2-10-O-(СН2)0-4СН3, -O-С(O)-(СН2)2-10-S-(СН2)0-4СН3, -O-С(O)-(СН2)2-10-NH-(СН2)0-4СН3, -O-C(S)-(CH2)0-14CH2F, -O-С(S)-(СН2)0-14СН2Cl, -O-C(S)-(CH2)0-14CH2Br, -O-C(S)-(CH2)0-14CH2I, -O-С(S)-(СН2)2-10-O-(СН2)0-4СН3, -O-C(S)-(CH2)2-10-S-(CH2)0-4CH3, -O-C(S)-(CH2)2-10-NH-(CH2)0-4CH3, -(CH2)0-16NH2, -(СН2)0-15СН3, -(CH2)0-15CN, -(CH2)0-15CH=CH2, -(CH2)0-15NHCH(O), -(CH2)0-16NH-(CH2)0-15CH3, -(CH2)0-15CCH, -(СН2)0-15OC(O)СН3, -(СН2)0-15OCH(ОН)СН3, -(СН2)0-15С(O)ОСН3, -(СН2)0-15С(O)ОСН2СН3, -(СН2)0-15С(O)(СН2)0-15СН3, -(CH2)0-15C(O)(CH2)0-15CH2OH, -O(CH2)1-16NH2, -O(СН2)1-15СН3, -O(CH2)1-15CN, -O(CH2)1-15CH=CH2, -O(CH2)1-15NHCH(O), -O(СН2)1-16NH-(СН2)1-15СН3, -O(CH2)1-15CCH, -O(СН2)1-15OC(O)СН3, -O(СН2)1-15OCH(ОН)СН3, -O(СН2)1-15С(O)ОСН3, -O(СН2)1-15С(O)ОСН2СН3, -O(СН2)1-15С(O)(СН2)0-15СН3, -O(CH2)1-15C(O)(CH2)0-15CH2OH, -OC(O)(CH2)1-16NH2, -OC(O)(CH2)1-15CH3, -C(O)O(CH2)1-15CN, -C(O)O(CH2)1-15CH=CH2, -OC(O)(CH2)1-15NHCH(O), -OC(O)(CH2)1-16NH-(CH2)1-15CH3, -OC(O)(CH2)1-15CCH, -OC(O)(CH2)1-15OC(O)CH3, -ОС(O)(СН2)1-15OCH(ОН)СН3, -ОС(O)(СН2)1-15С(O)ОСН3, -OC(O)(CH2)1-15C(O)OCH2CH3, -ОС(O)(СН2)1-15С(O)(СН2)0-15СН3, -OC(O)(CH2)1-15С(O)(СН2)0-15СН2OH, фосфоенолпируват, D-глюкозамин, глюколивая кислота, глюкуроновая кислота, пантотеновая кислота, пуривовая кислота, глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза, латоза, фукоза, рамноза, галактоза, рибоза, 2'-дезоксирибоза, 3'-дезоксирибоза, глицерол, 3-фосфоглицерат, PEG (PEG20, PEG100, PEG200, PEG10000), полимер полиоксиалкилена, глицин, аланин, фенилаланин, треонин, пролин, 4-гидроксипролин или или олигонуклеотид или его аналог, включающий от 4 до 20 мономеров.
Если заместитель представляет собой олигонуклеотид или полимер, то обычно к соединению по формуле 1 присоединен только один из таких заместителей. Типично, когда R1-R2 и R4-R6 включают один или более из этих заместителей (или других, которые здесь описаны), заместитель присутствует в β-конфигурации, тогда как R3 типично представляет собой заместитель в β-конфигурации. В некоторых реализациях R2 находится в α-конфигурации.
В некоторых реализациях один или более из R1-R6, R10, R15, R17 и R18 независимо представляют собой нуклеозид, нуклеотит, олигонуклеотид или аналог этих группировок. Типично такие группы присоединены к стероидному ядру через свою гидроксильную, тиольную, ацильную группу или амин в 5', 3' или 2' положениях, в том случае если гидроксильная, тиольная, ацильная группа или амин присутствуют в этом положении. Для нуклеотидов и их аналогов связь со стероидом иногда может осуществляться через гидроксил сахара во внутренней 2' позиции.
Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиоатные связи и другие, которые описаны в процитированных ссылках. Под группами соединения олигонуклеотидов подразумеваются любые группы, подходящие для создания фосфодиэфирной связи или аналога фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами или их аналогами. Подходящие группы соединения нуклеотидов включают -ОН, Н-фосфонат, алкилфосфонатамидиты или фосфороамидиты, такие как β-цианоэтилфосфороамидит, N,N-диизопропиламино-β-цианоэтоксифосфин и другие, которые описаны в процитированных ссылках. Подходящие пуриновые или пиримидиновые основания включают аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил и другие, которые описаны в процитированных ссылках. Подходящие нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды и их аналоги описаны, см., например, патенты США 4725677, 4973679, 4997927, 4415732, 4458066, 5047524, 4959463, 5212295, 5386023, 5489677, 5594121, 5614622, 5624621, и номера публикаций РСТ WO 92/07864, WO 96/29337, WO 97/14706, WO 97/14709, WO 97/31009, WO 98/04585 и WO 98/04575, которые тем самым включаются в ссылки. Соединения по формуле 1, например те, которые названы в группах соединений с 1 по 42-25-10-6 подходят для присоединения к олигонуклеотидам, модулируют липофильность олигонуклеотидов, транспорт олигонуклеотидов или их способность к проникновению в клетки. Такие присоединения могут быть биологически лабильны, что облегчает освобождения стероида от олигонуклеотида, после того как конъюгат попал в клетку.
Таблица 2 показывает образцы этих и других компонентов, которые могут независимо представлять собой один или более из R1-R6, R10, R15, R17 и R18. Pr обозначает защитную группу. Эти компоненты часто связаны с одним или более из R1, R2 и R4 положений, обычно с одним или двумя из них. Для структур с более чем одной заданной переменной, например Х в структуре A3 или А5, каждая выбирается независимо.
Типичные контейнеры для хранения составов и соединений по формулам изобретения будут ограничивать количество воды, попадающее в материалы, которые в них хранятся. Типично, соединения по формулам упаковывают в контейнеры, которые закрываются герметично или индукционно [индукц. нагревом]. Контейнеры обычно являются индукционно запечатанными. Характеристики контейнеров по влагопроницаемости были описаны, например, в Containers-Permeation, глава, USP 23 <671>, United States Pharmacopeial Convention, Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852, стр. 1787 и далее(1995).
Применение соединений по формуле А для лечения определенных заболеваний, например инфекций, таких как малярия, HCV или Cryptosporidium, описано. Соединения формулы А имеют структуру
где Q1 представляет собой -C(R1)2- или -С(O)-; Q2 представляет собой -C(R1)2-, -C(R1)(Y)-, -C(Y)- или -СН2-СН2-; Q3 представляет собой -Н или -C(R1)3-; Q4 представляет собой -C(R1)2-, -C(O)-, гидроксивинилидин (-СН(СН=СНОН)-) или метил метилен (-СН(СН)3-); Q5 представляет собой -C(R1)2- или -С(O)-; Х и Y независимо представляют собой -ОН, -Н, низший алкил (например, C1-6 алкил), -O-C(O)-R5, -С(O)-OR5, галоген (т.е. -F, -Cl, -Br или -I) или =O; каждый R1 независимо представляет собой -Н, -F, -Cl, -Br, -I, -ОН, C1-6 алкокси или C1-6 алкил; R2 представляет собой -Н, -ОН, -F, -Cl, -Br, -I, C1-6 алкил, C1-6 алкокси, -OR3, сложный эфир (например, -O-C(O)-R4 или -C(O)-O-R4), сложный тиоэфир (например, -O-C(S)-R4 или -C(S)-O-R4), тиоацеталь (например, -S-C(O)-R4, или -C(O)-S-R4), сложный сульфатный эфир (например, -O-S(O)(O)-O-R4), сложный сульфонатный эфир (например, -O-S(O)-O-R4) или карбамат (например, -O-C(O)-NH-R4 или -NH-C(O)-O-R4) или R2, вместе с R1 который связан с тем же атомом углерода представляет собой =O; R3 is -S(O)(O)-OM, -S(O)(O)-O-CH2-СН(O-С(O)-R6)-СН2-O-С(O)-R6, -P(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-R7)-CH2-O-C(O)-R7, глюкуронидную группу структуры (В)
или R3 представляет собой C1-18 алкил, C2-18 алкенил, C1-18 алкинил, C1-18 сложный эфир или C1-18 сложный тиоэфир, где любая из вышеупомянутых C1-18 или С2-18 возможно имеет замещение по одному или более атомов водорода одним или более независимо выбранным -ORPR (включая -ОН), -NHRPR (включая -NH2) или -SRPR (включая -SH) группы, или R3 представляет собой C1-18 жирную кислоту, С2-10 алкинил, (J)n-фенил-С1-5-алкил, (J)n-фенил-С2-5-алкенил; R4 представляет собой -H, защитную группу, C1-18 алкил с возможным замещением, C1-18 алкенил с возможным замещением, C1-18 алкинил с возможным замещением, арил с возможным замещением, арил-С1-6 алкил с возможным замещением, арил-С2-6 алкенил с возможным замещением, арил-С2-6 алкинил с возможным замещением, гетероцикл-С1-6 алкил с возможным замещением, С2-6 алкенил-гетероцикл с возможным замещением, С2-6 алкинил-гетероцикл с возможньш замещением или гетероцикл с возможным замещением, где в любой из вышеупомянутых компонент возможно замещение по одному, двум, трем, четырем, пяти или более атомам водорода или углерода одним или более из независимо выбранных -О-, -S-, -NRPR- (включая -NH-), -NH-C(O)-, -ORPR (включая -ОН), -NHRPR (включая -NH2), -SRPR (включая -SH), =О, =S, =N-OH, -CN, -NO2, -F, -Cl, -Br или -I групп или атомов; каждый R5 независимо представляет собой линейный или разветвленный C1-14 алкил; каждый R6 независимо представляет собой линейный или разветвленный C1-14 алкил; каждый R7 независимо представляет собой линейный или разветвленный C1-14 алкил или глюкуронидную группу структуры (В); каждый RPR независимо представляет собой -Н или независимо выбираемую защитную группу; n равно 0, 1, 2 или 3; каждый J независимо представляет собой -F, -Cl, -Br, -I, C1-4 алкил, C1-4 алкенил, C1-4 алкокси-, карбокси-, нитрогруппу, сульфат, сульфонил, C1-6 сложный карбоксильный эфир или C1-6 сложный сульфатный эфир; М представляет собой водород, натрий, -S(O)(O)-O-СН2-СН(O-С(O)-R6)-СН2-O-С(O)-R6, -Р(O)(O)-O-CH2-CH(O-C(O)-R7)-CH2-O-C(O)-R7 или глюкуронидную группу структуры (А);
пунктирные линии в формуле 1 символизирует необязательную двойную связь, при условии, что двойные связи отсутствуют как в 4-5, так и в 5-6 положениях, и условии, что если двойная связь присутствует, нулевая или 1 R1 группа присоединена к атомам углерода в положениях 1, 2, 4, 5, 6, или 17 таким образом, что эти атомы четырехвалентны; и соли, стереоизомеры, позиционные изомеры, метаболиты, аналоги предшественников.
Соединения по формуле А, в частности, когда оба R1 в 11 положении не представляют собой гидроксилы, алкоксилы или компоненту, которая может гидролизоваться в гидроксил, обычно подходят для использования в способах и составах, изложенных здесь, например, использования для усиления Th1 имунных ответов субъекта. Способы назначения и дозировки по существу такие же, как описано здесь.
Способы прерывистого дозирования Соединение/я по формуле 1, например сложные эфиры, BrEA или BrEA могут периодически назначаться субъекту без некоторых нежелательных последствий, обычно связанных с прерывистым назначением. Такие нежелательные последствия могут включать развитие устойчивости патогена (вируса, такого как ВИЧ, или паразита, такого как паразит Plasmodium) к терапевтическому агенту, или невозможность пациента или субъекта приспособиться к протоколу дозировок. Протоколы прерывистого дозирования включают назначение соединения по формуле 1, например, внутренне, локально или парэнтерально следующим образом: (1) дозирование в течение примерно от 3 до 20 дней, (2) прекращение назначения на примерно от 4 до 20 дней, (3) дозирование в течение примерно от 4 до 20 дней и (4) факультативное повторение протокола дозирования 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 30 или более раз. Часто, назначения доз этапов (1) и (3) будет продолжаться в течение примерно 3-15 дней, обычно примерно 3-5 дней. В целом, этапы (1)-(3) протокола дозировок, перечисленные выше, будут повторяться, по меньшей мере, один раз, типично, по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 раз. Для инфекций, которые имеют тенденцию к хроническому течению, например ВИЧ, вирус гепатита С и других хронических вирусных или паразитических инфекций, такой протокол периодического назначения поддерживается в течение относительно длительного периода времени, например от по меньшей мере примерно 6 месяцев до 5 лет.
В таких протоколах периодического назначения соединения по формуле 1 могут назначать любым подходящим способом, например, внутримышечно (в/м), подкожно (п/к), внутривенно (в/в), внутрикожно, другим парэнтеральным путем, аэрозолем, с использованием от 0,1 до 10 мг/кг/день, обычно примерно 0,2-4 мг/кг/день.
Альтернативно, можно назначать соединение/я по формуле 1 внутрь, используя от 4 до 40 мг/кг/день, обычно от 4 до 20 мг/кг/день. В некоторых реализациях способы прерывистого назначения исключают протоколы дозирования, которые обычно используются для доставки контрацептивных стероидов, например, женщинам, такие как ежедневный прием в течение 21 дня, с последующим перерывом на 7 дней. В общем, безводные составы, описанные здесь, которые содержат соединение/я по формуле 1, назначаются в/м или п/к, тогда как водные составы, которые содержат соединение/я по формуле 1, назначаются в/в, в/м, п/к или другим парэнтеральным путем. Дневная доза может вводиться за один раз, особенно если доза дается парэнтерально, или же эта доза может быть поделена на две, три или четыре меньшие дозы, обычно две, особенно при внутреннем приеме.
Примерами реализации являются (а) назначение соединения/и по формуле 1, например, BrEA или сложного эфира или карбоната BrEA, один раз в день, в течение 20 дней, с последующим (б) прекращением приема на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более дней, и затем (в) назначение соединения/и по формуле 1, по меньшей мере, еще раз, например, назначение соединения/й по формуле 1, например, один раз в день, в течение 20 дней и (г) факультативное повторение (а), (б) и (в) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз, или более. Подгруппой этих способов реализации является (а) назначение соединения/й по формуле 1, например, BrEA или сложного эфира или карбоната BrEA, один раз в день, в течение 20 дней, с последующим (б) прекращением приема на 10-40 дней, и затем (в) назначение соединения/й по формуле 1, по меньшей мере, еще раз, например, назначение соединения/й по формуле 1, например, один раз в день, в течение 20 дней и (г) факультативное повторение (а), (б) и (в) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз, или более. В любой из этих реализаций соединения по формуле 1 можно назначать, разбивая дневную дозу на 2 или 3 меньших дозы.
Другими примерами реализации являются (а) назначение соединения/й по формуле 1, например, BrEA или сложного эфира или карбоната BrEA, один раз в день, в течение 8-12 дней, с последующим (б) прекращением приема на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или более дней, и затем (в) назначение соединения/й по формуле 1, по меньшей мере, еще раз, например, назначение соединения/й по формуле 1, например, один раз в день, в течение 8-12 дней и (г) факультативное повторение (а), (б) и (в) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз, или более. Подгруппой этих способов реализации является (а) назначение соединения/й по формуле 1, например, BrEA или сложного эфира или карбоната BrEA, один раз в день, в течение примерно 10 дней, с последующим (б) прекращением приема на 10-40 дней, и затем (в) назначение соединения/й по формуле 1, по меньшей мере, еще раз, например, назначение соединения/й по формуле 1, например, один раз в день, в течение 10 дней и (г) факультативное повторение (а), (б) и (в) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз, или более. В любой из этих реализаций соединения по формуле 1 можно назначать, разбивая дневную дозу на 2 или 3 меньших дозы.
Одним аспектом периодического назначения согласно изобретению является мониторинг ответа субъекта на препарат. Например, назначая препараты субъекту с вирусной инфекцией (например, HCV, HIV, SIV, SHIV), можно измерять реакцию субъекта или патогена, например улучшение одного или более симптомов или изменения в инфекционных частицах или вирусной РНК в крови. Как только наблюдается реакция, назначение препарата может продолжаться в течение одного, двух или трех последующих дней, с последующим прекращением приема на, по меньшей мере, один день (по меньшей мере 24 часа), обычно, по меньшей мере, на 2 или 3 дня. Как только реакция субъекта начинает показывать признаки ремиссии (например, начинает повышается концентрация вирусной РНК в сыворотке), назначение препарата может возобновляться в виде следующего курса. Одним из аспектов ответа субъекта на соединение/я по формуле 1 является то, что реакцию субъекта можно измерять через короткое время, обычно 5-10 дней, что позволяет напрямую отслеживать ответ субъекта, например, через мониторинг титра вируса в периферических белых кровяных клетках (РВМС - Периферические Клетки Костного Мозга) или измеряя уровень вирусных нуклеиновых кислот в крови. Можно проводить мониторинг одного или более подкласса имунных клеток, например NK, LAK, дендритные клетки или клетки, которые опосредуют ADCC имунные ответы, во время и после периодического назначения, чтобы отслеживать ответ субъекта и определить, когда показано дальнейшее назначение соединения по формуле 1. Эти клеточные подклассы отслеживают, как указано здесь, например, с помощью проточной цитометрии.
Для любого применения или способа, здесь описанного, длительный положительный эффект или устойчивый иммунный ответ у субъекта может происходить после единичного назначения или нескольких ежедневных назначений соединения по формуле 1 или после периодического назначения соединения по формуле 1. Под единичным назначением понимается, что соединения по формуле 1 назначается субъекту в виде одной, двух или трех доз за период в 24 часа и не происходит назначения субъекту никаких соединений по формуле 1 в течение, по меньшей мере, от 45 дней до 2 месяцев, например в течение 3, 4, 5, 6 или более месяцев. Длительные положительные эффекты или иммунные ответы могут также продолжаться, когда короткий курс лечения завершен (например, ежедневное назанчение в течение 2, 3, 4, 5 или 6 дней) и субъект больше не получает никакого соединения по формуле 1, или, в некоторых случаях, никакого другого терапевтического воздействия на первопричину патологического состояния субъекта. Такие положительные эффекты могут продолжаться в течение более чем 5-30 дней.
В некоторых случаях положительные эффекты лечения наблюдались в течение более чем 3 месяцев (4 или 5 или более месяцев) после короткого курса лечения субъекта соединением по формуле 1. Таким образом, назначение соединения по формуле 1 дает способ эффективной защиты субъекта от дальнейшего развития инфекции или от неблагоприятных последствий нежелательных иммунных реакций (например, воспаления) или от иммуносупрессии (в результате инфекции, химиотерапии, и т.п.), без какого-либо приема данного соединения в течение по меньшей мере 3 месяцев, после первичного назначения, которое может проводится согласно периодическому или непрерывному протоколу приема в течение, например, от 1 дня до примерно 4 месяцев (1-15 дней, примерно 1 месяца, примерно 2 месяцев, и т.п.).
Способы синтеза. Реагенты и условия реакции, которые можно использовать для получения соединений по формуле 1, уже описаны, см, например, цитаты выше, номера патентов США 5874598, 5874597, 5874594, 5840900; номер публикации РСТ WO 9901579. Общие методы химического синтеза с целью присоединения разнообразных органических компонентов к разнообразным реакционным группам были описаны. Например, в G.Т.Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, функциональные мишени, такие как аминокислоты, пептиды и карбогидраты, описаны на страницах 3-136, тогда как химия реакционных групп в функциональных мишенях, например, амина, тиола, карбоксила, гидроксила, альдегида, кетона и реактивных атомов водорода (например, -Н, присоединенного к электронодонорной компоненте, такой как гетероарильная группа) описаны на стр.137-166. В этой публикации также описаны реагенты, полезные для получения производных, например, кросс-линкеры нулевой длины, гетеробифункциональные кросс-линкеры, гомобифункциональные кросслинкеры, метки, пробы и полимеры описаны на стр.169-416 и 605-638. В этой публикации также описаны синтетические методы модификации олигонуклеотидов на стр.639-671.
Согласно одному аспекту аминокислоты или пептиды присоединены к стероидам через аминогруппу, с использованием агента присоединения, такого как фосген (Cl-СО-Cl) или Cl-CS-Cl, подходящим образом защищенных аминокислот или стероидов, которые защищены, как необходимо. Такое присоединение приводит к появлению компоненты -СО-O- или -CS-O-, встроенной между аминокислотой или пептидом и стероидным ядром.
Примеры схем синтеза. Ни в коем случае не являясь исчерпывающими, следующие примеры используют для приготовления одного или более соединений, описанных здесь. Исходные материалы и простые вариации этих схем могут быть найдены, например, в следующих источниках, которые тем самым включены здесь в виде ссылки: А.Р.Davis, et al., Tetrahedron Lett., 33:5111-5112, 1992; I.Takashi, et al., Chem. Pharm. Bull., 34:1929-1933, 1986; I.Weisz, et al., Arch. Pharm., 319:952-953, 1986; Т.Watabe, et al., J. Med. Chem., 13:311-312, 1970; M.Davis, et al., J. Chem. Soc. C., (11):1045-1052, 1967; R.С.Cambie, et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (20):2250-2257, 1977; L.Minale, et al., J. Chem Soc., Perkin Trans. 1, (20):2380-2384, 1974; С.К.Lai, et al., Steroids, 42: 707-711, 1983; S.Irie, et al., Synthesis, (9):1135-1138, 1996; E.J.Corey, J. Am. Chem. Soc., 118:8765-8766, 1996; M.E.Annunziato, et al., Bioconjugate Chem., 4:212-218, 1993; N.J.Cussans, et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (8):1650-1653, 1980; D.H.R.Barton, et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., (9):393-394, 1978; H.Loibner, et al., Helv. Chim. Acta, 59:2100-2113, 1976; Т.R.Kasturi, et al., Proc. Indian Acad. Sci., [Ser.]: Chem. Sci., 90:281-290, 1981; Т.Back, J. Org. Chem., 46:1442-1446, 1981; A.Canovas, et al., Helv. Chim. Acta, 63:486-487, 1980; R.J.Chorvat, et al., J. Org. Chem., 43:966-972, 1978; M.Gumulka, et al., Can. J. Chem., 63:766-772, 1985; H.Suginome, et al., J. Org. Chem., 55:2170-2176, 1990; С.R.Engel, et al., Can. Heterocycles, 28:905-922, 1989; H.Sugimone, et al., Bull, Chem, Soc. Jpn., 62:193-197, 1989; V.S.Salvi, et al., Can. Steroids, 48: 47-53, 1986; С.R.Engel, et al., Can. Steroids, 47:381-399, 1986; H.Suginome, et al., Chem. Lett., (5):783-786, 1987; Т.Iwadare, et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., (11):705-706, 1985; H.Nagano, et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun., (10):656-657, 1985; V.S.Salvi, et al., Steroids, 27:717-725, 1976; С.H.Engel, et al, Steroids, 25:781-790, 1975; M.Gobbini, et al., Steroids, 61:572-582, 1996; A.G.Gonzalez, et al., Tetrahedron, 46:1923-1930, 1990; S.С.Bobzin, et al., J. Org. Chem., 54: 3902-3907, 1989; В.Solaja, et al., Croat. Chem. Acta, 59:1-17, 1986; Y.Kashman, et al., Tetrahedron, 27:3437-3445, 1971; К.Yoshida, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 15:1966-1978, 1967; Р.В.Sollman, et al., Chem. Commun. (11):552-554, 1967; H.Suginome, et al., J. Org. Chem., 55:2170-2176, 1990; H.Suginome, et al., Journal Chem. Lett., (5):783-786, 1987; G.A.Tolstikov, et al., Zh. Org. Khim., 22:121-132, 1986; Т.Terasawa, et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (4):990-1003, 1979; Z.Zhuang, et al., Yougi Huaxue, (4):281-285, 1986; W.Т.Smith, et al., Trans. Ky. Acad. Sci., 45:76-77, 1984; А.К.Batta, et al., Steroids, 64:780-784, 1999; В.Ruan, et al., Steroids, 65:29-39, 2000; L.Garrido, et al., Steroids, 65:85-88, 2000; Р.Ramesh, et al., Steroids, 64:785-789, 1999; M.Numazawa, et al., Steroids, 64:187-196, 1999; Р.N.Rao, et al., Steroids, 64:205-212, 1999; M. Numazawa, et al., Steroids, 64:320-327, 1999; Патенты США 3281431, 3301872, 3325535, 3325536, 3952018, 4602008, 5571795, 5627270, 5681964, 5744453; международные публикации WO 9408588, WO 9508558, WO 9508559, WO 9638466, WO 9809450; патенты Великобритании GB 1168227, GB 813529, GB 802618; патенты Франции 824529; патент Японии JP 45010134; Европейские патентные заявки ЕР 232788, ЕР 430078; и патент Германии DE 19631189.
Схема 1. Для структур, показанных в схеме 1, R5-R9 определены так же, как для соединений по формуле 1. Так, когда R5 и R6 оба представляют собой -СН3 в β-конфигурации, R7, R8 и R9 все представляют собой -СН2, H в 9 и 14 позициях находятся в α-конфигурациях, ацетат в 3 положении находится в β-конфигурации и Н в положении 8 находится в β-конфигурации, первое соединение в схеме 1 представляет собой DHEA ацетат. Ацетатные группы в 3, 7, 16, 17 или других положениях в этой схеме и других схемах, изложенных здесь, могут независимо представлять собой другие сложные эфирные компоненты, чем те, которые описаны здесь, например, С2-50 сложными эфирами, включая -С(O)-(СН2)0-4-(CF2)0-4-CF3, включая алкил, возможно замещенный -С(O)-CF3, -С(O)-С2-29, включая алкенил, возможно замещенный -С(O)-СН2-С2-28, алкинил, возможно замещенный -С(O)-СН2-С2-28, фенил, возможно замещенный -С(O)-(СН2)0-6, или гетероцикл или другие органические компоненты с возможным заместителем -С(O)-(СН2)0-6, которые описаны здесь или в процитированных ссылках.
Типичными заместителями для этих органических компонентов являются описываемые здесь, включая один, два, три или более независимо выбранных -О-, =O, возможно защищенный гидроксил, -S-, возможно защищенный тиол, -NH-, возможно защищенный NH2, возможно защищенный -С(O)ОН, -C(O)-NH-, -C(O)-NH2, -NH2-C(O)-Н, -NH2-C(O)-C0-4H1-9, -NH2-C(O)-O-C0-4H1-9, -CN, -NO2, -N3 или галоген. Реакционные группы защищают по мере необходимости, например =O обычно следует защищать в LiCR реакции, которую используют ниже в схеме 1 при получении соединения 1.
Схема 1
Аббревиатуры:
LDA= литийдиизопропиламид; МСРВА= м-хлорпербензойная кислота; TMSCI= триметилхлорсилан; DMAP= 4-диметиламинопиридин; Dibromantin= 1,3-дибромо-4,4-диметилгидантоин.
R=CRA; RA=-Н или С1-С50 органический компонент, который описан здесь, например алкил с возможным заместителем -Н, -С1-20, алкинил с возможным заместителем -С1-20, фенил с возможным заместителем -(CH2)0-6 или гетероцикл с возможным заместителем -(СН2)0-6.
Схема 2. Соединения формулы 2 получают из соединений структуры А, показанной на схеме 1, используя две последние стадии Схемы 1: (1) Dibromantin, (2) LiBr, (3) LiCR, где R представляет собой CRA и RA - алкил с возможным заместителем -Н, -C1-20. В том случае, когда все R7, R8 и R9 представляют собой -СН2, Н в 9 и 14 позициях находятся в α-конфигурациях и Н в положении 8 находится в β-конфигурации, первое соединение на схеме 1 представляет собой DHEA ацетат. Типичные заместители для RA алкильных компонентов включают один, два или более независимо выбранных -О-, возможно защищенный =O, возможно защищенный гидроксил, -S-, возможно защищенный тиол, -NH-, возможно защищенный NH2, возможно защищенный -С(O)ОН, -C(O)-NH-, -C(O)-NH2, -NH2-C(O)-H, -NH2-C(O)-C0-4H1-9, -NH2-C(O)-O-C0-4H1-9, -CN, -NO2, -N3 или галоген.
Схема 2
Схема 3. Аллильное бромирование по С-7 осуществляется, как в Схеме 1. RA и R такие же, как определены для Схем 1 и 2.
Схема 3
Схема 4. В дополнение к литиевому реагенту (ацетилиду лития, когда R представляет собой -СН) в 17-положении >С=O в присутствии бромида в С-16 приводит к образованию эпоксида или пинакольной перегруппировке. Альтернативно соединения без структуры 3 могут быть дегидрированы с использованием мягкого кислотного катализа с образованием соединений формулы 4 путем взаимодействия алкена с Br2, Н2О. RA и R такие же, как определены для Схем 1 и 2.
Схема 4
Схема 5. Боргидрид натрия дает смесь эпимеров по С-7, которые могут быть разделены стандартными способами, например HPLC, TLC или колоночной хроматографией. Для получения чистого соединения 7α-ОН осуществляют аллильное броминирование с последующим гидролизом, как описано в Схемах 1 и 3.
Схема 5
Схема 6. Соединения формулы 6 получают в результате обработки ацетата ацетилидом лития, как в Схемах 1, 2, 3 или 4. R и RА такие же, как определены для Схем 1 и 2.
Схема 6
Схема 7. Соединения формулы 7 получают из триацетата с помощью реагентов, описанных в Схемах 1 и 4. R и RA такие же, как определены для Схем 1 и 2.
Схема 7
Схема 8. Соединения формулы 8 получают из соединений формулы А реакцией с борогидридом натрия по положению С-17 с последующим ацетилированием.
Схема 8
Схема 9. Исходные материалы получают, используя реакции, описанные в Схемах 1 и 3.
Схема 9
Схема 10. Посредством восстановления и ацетилирования по С-3, а также гидролиза и окисления по С-17, соединения 10а и 10б могут быть функционализированы по положениям С-3, С-16 и С-17, как показано в Схемах 1-9. Для соединения формулы А триацетат может быть заменен на 7-оксоацетат, и функционализация по положениям С-3, С-16 и С-17 при использовании 7-оксосоединений достигается аналогичным способом посредством реакций, показанных на Схемах 1-9.
Взаимодействие соединения 10а с LDA с последующим алкилированием енолята делает возможным введение боковых цепей, таких как R10, которыми могут быть, например, С1-С20 алкил (метил, этил), С1-С20 алкенил (СН2=СН-(СН2)0-6-), бензил, -(СН2)1-4-O-(СН2)0-4-СН3
Схема 10
На схемах 1-9 показано введение гидроксильной функциональности в указанные положения. Способы превращения гидроксила в другие функциональные группы осуществляются по существу так, как описано, например, в приведенных ссылках. Например, сложные эфиры соединений формул 1-10с, такие как -O-C(O)-RB, где RB представляет собой С1-50 органическую компоненту, получают из стероидных спиртов обработкой подходящим ангидридом или хлоридом кислоты (RB-C(O)-Cl) с образованием желаемого сложного эфира. Простые эфиры, такие как -O-RB, получают из спиртов путем приготовления алкоксида щелочного металла (Na+ или К+) с последующим взаимодействием с первичным или вторичным иодидом (RB-I). Сложные тионовые эфиры, RB-C(S)O-, получают обработкой RB-С(O)-О- сложного эфира реагентом Lawesson's.
Сульфаты, NaO-S(O)(O)-O-, RB-O-S(O)(O)-O-, например, СН3(СН2)0-18-S(O)(O)-O-, получают обработкой спиртов хлорсульфоновой кислотой, а затем NaOH, или в качестве альтернативы, окислением сульфатов с использованием KMnO4. Если требуется сложный эфир алкила (например, метила), то можно использовать алкилхлоросульфонат (метилхлоросульфонат). Сульфиты HO-S(O)-O- и соли аммония NH4O-S(O)-O или сложные эфиры RBO-S(O)-O- (например, СН3 O-S(O)-O-) получают стандартными способами. Соли аммония получают обработкой спиртов аммиаком и диоксидом серы. Сложные эфиры, такие как алкиловые, алкениловые и алкиниловые сложные эфиры (например, сложный метиловый эфир), получают при обработке спиртов алкилхлорсульфитом (например, метилхлорсульфитом), алкенилхлорсульфитом или алкинилхлорсульфитом в присутствии подходящего основания, такого как триэтиламин. Сложные фосфоэфиры, RBO-Р(ORPR)(O)-О- приготавливают обработкой спирта диэтилхлорфосфатом в присутствии Na2CO3. Альтернативно, если спирт подвергают воздействию двойных сложных эфиров фосфорной кислоты в присутствии трифенилфосфина (PPh3) и диэтилазодикарбоксилата (DEAD), соответствующие тройные сложные эфиры образуются с инверсией (реакция Mitsonobu).
Сложные фосфотиоэфиры, RBO-P(SRPR)(O)-O-, получают в результате взаимодействия спиртов с монотиоаналогом диэтилхлорфосфата, как описано для сложных фосфоэфиров, что дает сложные фосфотиоэфиры. Карбонаты, RвO-P(SRPR)(O)-O-, получают из соответствующего стероидного спирта, используя хлорформат (RB-С(O)-Cl), например С1-20 хлорформаты алкила, алкенила или алкинила (например, СН3(СН2)0-5-С(O)Cl). Карабаматы, RB-NH-C(O)-O-, получают из стероидных спиртов воздействием изоцианатов (RBN=C=O) или NaOCN в присутствии трифторуксусной кислоты. Сложные эфиры аминокислот, ZNX-CHY-C(O)-O-, получают присоединением стероидного спирта к хлориду N-защищенной аминокислоты.
Окисление гидроксильных групп, которые соединены со стероидным ядром, используют для получения кетонов и родственных функциональных групп. Например, конверсия спиртов в кетоны может быть достигнута с использованием разнообразных окислительных агентов, таких как CrO3 в АсОН, или хлорхромата пиридиния, дихромата пиридиния или оксалилхлорида с триэтиламином (окисление по Swern). Тиокетоны (=S) готовят путем обработки кетонов реагентом Лавессона (2,4-бис(4-метоксифенил)-1,3,2,4-дитиадифосфэтан-2,4-дисульфида; коммерчески доступного от Aldrich). Тиоацетали, -(C(SRB)(SRB)-, получают из кетонов (-С(О)-) обработкой RBSH тиолами в условиях кислотного катализа (например, HCl). Сложные фосфоноэфиры, RO-P(ORPR)(O)-, получают при добавлении двойного эфира фосфорной кислоты к кетонам в присутствии KF с получением сложных гидроксифосфоноэфиров. Возможно удаление карбоксильной группы с использованием последовательных дегидратации и гидрогенирования.
Замещение гидроксильных групп используют для получения большого числа функциональных групп. Например, тиолы, -SH, получают из спиртов конверсией спирта с инверсией в бромид PBr3. Обработка бромида тиомочевиной и затем NaOH дает тиол. Простые тиоэфиры, RB-S-, готовят из тиолов с помощью обработки NaOH и необходимого галида, например, алкилгалида. Альтернативно производные спиртов, такие как тозилаты или мезилаты, могут быть замещены тиолат-анионами, RB-S-, с получением простого тиоэфира. Сложные тиоэфиры, R-C(O)-S-, получают обработкой тозилата (мезилата) спиртом с натриевой солью тиокислоты.
Замещение гидроксильных групп может быть использовано для получения как сложных эфиров RBO-C(O)-, так и амидов, NHRB-C(O)-, связанных со стероидом через атомы углерода. Для амидов и аминов RB представляет собой -Н, защитную группу или С1-50 органический компонент. Их синтезируют из стероидбромида с инверсией, замещением NaCN. Цианогруппа может быть гидролизована в амид или кислоту. Кислоту эстерифицируют или подвергают стандартной реакции присоединения пептидов с использованием O-защищенной аминокислоты в присутствии подходящих карбоксил-активирующих агентов, таких как дициклогексилкарбодиимид (DCC), с образованием стероида -C(O)-NH-CHY-C(O)-OR, где Y - боковая цепь аминокислоты или С1-С10 органическая компонента и R - защитная группа (или водород, если защита удалена).
Амины и призводные аминов, например, RBNH-, RB-C(O)NH-, RBOC(O)NH- или RBO-C(O)-CHRB, связанные с атомами углерода стероидного ядра через -NH-, обычно получают стандартными способами. Например, амины (NH2-стероид) в основном получают с помощью перегруппировки по Hoffman (Br2, NaOH) из амида (NH2-C(O)- стероид) или перегруппировки Curtius (NaN3) из кислотного хлорида стероида. Далее, RВ заместитель может вводиться через алкилирование. Стероидные спирты могут быть использованы в качестве исходных материалов при стандартных условиях по Mitsunobu (PPh3, DEAD) для получения N-Boc сульфонамидов, используя N-(t-бутоксикарбонил)-р-толуолсульфонамид. Можно выборочно убирать любую защитную группу. Обработка трифторуксусной кислотой дает сульфонамид (RB-S(O)(O)-NH-стероид). Альтернативно защита снимается нафталенидом натрия, что дает N-Boc соединение. Амины (NH2-стероид) могут быть конвертированы в амиды (RBNH-С(О)-стероид) с использованием ацилхлоридов (RBC(O)-Cl). Обработка этилхлорформатом дает N-карбамат (RBO-C(O)-NH-стероид). Амин (NH2-стероид) может быть алкилирован сложным α-бромэфиром (RB-C(O)-CHY-NH2) с получением стероида, замещенного аминокислотой (RB-O-C(O)-CHY-NH-стероид).
Когда реакции, такие как реакции замещения, дают смесь продуктов, возможно отделение желаемого интермедиата от других продуктов, или по меньшей мере частичное обогащение им смеси (например, обогащение по меньшей мере в 10 раз, обычно по меньшей мере в 50-100 раз) других продуктов, перед проведением последующих реакций. Замещение по атомам углерода стероидного ядра обычно будет проходить с наибольшей эффективностью по позиции 3, которая стерически относительно доступна, и по С-17, которая обычно менее доступна, чем С-3. Относительные различия в реактивности позиций С-3, С-7, С-17 и С-16 позволяют использовать их реактивности для контроля последовательного введения различных функциональных групп в одну и ту же молекулу стероида. Кроме того, такие группы как гидроксил, в более реакционных позициях С-3 или С-17 могут быть последовательно защищены или лишены защиты для введения функциональных групп в другие положения, такие как С-7 или С-16.
Полимеры, такие как PEG, присоединяют к соединениям по существу так же, как описано выше. Например, PEG200 или PEG300 присоединяют к стероиду в 3, 7, 16, 17 или других положениях эфирной связью (PEG-O-стероид), используя PEG алкоксид (PEG-ONa) для замещения стероидбромида. В качестве альтернативы можно провести взаимодействие PEG-Br с алкоксидом стероида. Сложные эфиры полиэтиленгликоля, такие как описанные в патенте США 5681964, также могут быть приготовлены с помощью подходящих соединений формулы 1 и способов, которые здесь изложены. Моносахариды или полисахариды и олигонуклеотиды присоединяют к гидроксильным группам стероида с помощью известных способов, см., например патент США 5627270.
Аналоги стероидов формулы 1, которые содержат один или более гетероатомов кольца, синтезируют согласно следующим способам.
Схема 11. Соединения формулы 1, которые содержат два или три гетероатома кольца, приготавливают, как показано в данных схемах. В данной схеме Х представляет собой -СН2-, -NH-, -О- или -S-; R40 представляет собой -Н или -Br; R41 представляет собой органическую компоненту, содержащую 12 или менее атомов углерода, типично С1-С8 алкил с возможным замещением (например, метил, гидроксиметил, этил, пропил) или С2-С8 алкенил с возможным замещением, имеющий единственную двойную связь (например, винил) с одним, двумя, тремя или более независимо выбранными заместителями (например, -ОН, -СООН, -О-) и с любыми заместителями, которые содержат функциональную группу, обычно защищенную. Приготовление соединения 20 из соединения 19 осуществляют, используя гликоль, такой как НОС(СН3)2С(СН3)2OH в кислоте (Н+) (В.Н.Lipshutz et al., Synth. Commun. 12: 267, 1982). Использование объемной защитной группы облегчает создание двойной связи в позиции 5-6 по отношению к позиции 4-5.
Схема 11
Схемы 12А-12D. Соединения со структурой 12 получают, как показано на схемах ниже. Большинство реакций проводят по существу, как описано, см., например, W.D.Langley, Org. Syn. I, 122, 1932 (соединение 30); R.Ratcliffe et al., J. Org. Chem. 35:4000, 1970 (соединение 32); A.I.Meyers et al., J. Org. Chem. 39:2787, 1974 (соединение 31, 41); J.L.Isidor et al., J. Org. Chem. 38:544, 1973 (соединение 35); G.Wittig et al., Chem. Ber. 87:1318, 1954 (соединение 36); P.M.Pojer et al., Tet. Lett. 3067, 1976 (соединение 38); A.Maercker, Org. React. 14:270, 1965 (соединение 37); E.J.Corey et al., Tet. Lett. 3269 1975 (соединение 37); R.S.Tipson, J. Org. Chem. 9: 235, 1944 (соединение 39); G.W.Kabalka, J. Org. Chem. 51:2386, 1986; B.B.Carson et al., Org. Synth. 1:179, 1941 (соединение 43); H.J.Bestman et al., Justus Liebigs Ann. Chem. 693:132 1966 (соединение 39); М.Miyano et al., J. Org. Chem. 37:268, 1972 (соединение 51); W.H.Glaze et al., J. Org. Chem. 33:1987, 1968 (соединение 52).
Схема 12A
Соединения со структурой 12, где Х представляет собой NH, S и СН2, получают, как показано на схемах 12В, 12С и 12D соответственно.
Схема 12В
Схема 12D
Схема 13. Схему и реакции, показанные ниже, используют для приготовления соединения структуры 13 и родственных соединений, которые используют для введения кислорода, углерода, азота или серы в R7 в R8 положениях соединений формулы 1. Реагент при приготовлении соединения 63, 3-хлор-2-метилпропен (рег. №563-47-3), доступен коммерчески (например, Aldrich, Fluka).
Схема 13
Соединение 59 и аналоги соединения 59, в которых СН2, S или NHCH2 замещает кислород, приготовляют, как показано в последующих реакциях. Подходящие условия для конверсии соединения 106 в 107 описаны в (Т.Hamada et al., Heterocycles 12: 647, 1979; Т.Hamada et al., J. Am. Chem. Soc. 108:140, 1986).
β-метоксиэтоксиметилхлорид (МЕМ-Cl)
Конверсию метилкетонной компоненты (-С(О)-СН3) в соединениях со структурой
(R-С(О)-СН3) в другие функциональности осуществляют следующим образом. Для получения R-C(O)-OH метилкетон сперва расщепляют для получения карбоксигруппы, используя, например, Br2 или I2 в щелочи, а затем обрабатывают кислотой (Н3О+), по существу, как описано в (S.J.Chakrabarty Oxidations in Organic Chemistry Part C, W.Trahnnousy, editor, Academic Press, NY, 1987, chapter 5; L.J.Smith et al., Org. Synth. III 302, 1953). Карбоновую кислоту восстанавливают в спирт с использованием LiAlH4. Конверсию карбоновой кислоты в бромид осуществляют с использованием, например, Br2 в воде, в целом как описано в (J.S.Meek et al., Org. Synth. V, 126, 1973; A.Mckillop et al., J. Org. Chem. 34:1172, 1969).
Соединения со структурой 11 бромируют с использованием N-бромсукцинимида с получением стероидов и их аналогов с бромом в 7 положении.
Соединения 11А лишают защиты для получения альдегидных соединений 12. Как показано на схеме 11, атом брома в итоге оказывается в 7 положении. Бром может быть конвертирован в гидроксил реакцией стероида со щелочью (например, водным КОН), и гидроксил в свою очередь может быть защищен с использованием известных способов, например, использованием C6H5-CH2-Br и щелочи (КОН). Спирт защищают и лишают защитной группы, в целом используя известные способы, см., например W.H.Hartung et al., Org. React. 1:263, 1953; E.J.Rerst et al., J. Org. Chem. 29:3725, 1968; A.M.Felix et al., J. Org. Chem. 43:4194, 1978; D.A.Evans et al., J. Am. Chem. Soc. 101:6789, 1979; международный номер публикации WO 98/02450. Похожие реакции используют для превращения брома в других положениям в гидроксил. Другие заместители присоединяют к стероидам, как описано в схемах 1-10.
Возможны также альтернативные пути для введения функциональной группы в 7 положение. Например, соединения по формуле 1, которые имеют двойную связь в 5-6 позиции и не имеют заместителей в положении 7, защищают произвольным способом, например, гидроксильные группы защищают ацетатом, и в положение 7 вводят кетон путем окисления хромовой кислотой, в целом как описано (Патент США 2170124). Карбонил (=O) в положении 7 восстанавливают до гидроксила в мягких условиях, например, Al(Oi-Pr)3, чтобы избежать восстановления двойной связи 5-6. Использование более жестких условий восстановления, например, восстановления LiBH4 в THF, приводит к конверсии 7-карбонила в гидроксил и восстановлению 5-6 двойной связи и других двойных связей, которые могут присутствовать в молекуле.
Селективное гидрогенирование двойной связи в положении 16-17 без восстановления двойной связи в 5-6 положении осуществляют, используя H2 и Pd. В целом, кетоны (=O) могут быть защищены с использованием гликоля, например, реакцией с этиленгликолем в р-толулолсульфокислоте и бензоле, перед проведением последующих реакций окисления или восстановления.
Разнообразные группы, которые могут содержаться в соединениях по формуле 1, описанных в настоящем изобретении, например, гидроксильные группы или кетоны, присоединенные к стероидному ядру, или замещенные алкильные группы, замещенные гетероциклы, аминокислоты и пептиды, могут содержать одну и более реакционных компонент, таких как гидроксил, карбоксил, аминогруппу или тиол. Интермедиаты, которые используют для получения соединений по формуле 1, могут быть защищены известными способами. Нециклические и циклические защитные группы и соответственные реакции расщепления описаны в "Protective Groups in Organic Chemistry", Theodora W.Greene (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991, ISBN 0-471-62301-6) (далее "Greene") и не будут детально рассматриваться здесь. В контексте настоящего изобретения такими защитными группами являются группы, которые могут быть обратимо удалены с молекулы изобретения без необратимых изменений структуры ковалентных связей или окислительно/восстановительного статуса остатка молекулы. Например, защитная группа, -RPR, связанная с -О- или -NH- группой, может быть удалена с образованием -ОН или -NH2-, соответственно, не затрагивая другие ковалентные связи в молекуле. Иногда, при желании, защитные группы можно удалять более чем одну за раз, или они могут быть удалены последовательно. В соединениях по данному изобретению, которые содержат более чем одну защитную группу, защитные группы являются одинаковыми или разными.
Защитные группы удаляют с помощью известных методик, хотя следует понимать, что защищенные интермедиаты попадают в область данного изобретения. Защитные группы можно удалять сложными или простыми способами, в зависимости от экономичности и природы происходящих превращений. В целом, используют защитные группы для экзоциклических аминов или карбоксильных групп во время синтеза соединений по формуле 1. Для большинства терапевтических применений аминогруппы должны быть лишены защиты. Защитные группы обычно используют для предотвращения ковалентных модификаций чувствительной группы в реакциях, таких как алкилирование или ацетилирование. Обычным образом защитные группы удаляют, например, гидролизом, элиминированием или аминолизом. Так, простых функциональных соображений будет достаточно, чтобы руководствоваться при выборе обратимой или необратимой защитной группы в данном локусе соединения по данному изобретению. Подходящие защитные группы и критерии их выбора описаны в T.W.Greene and P.G.M.Wuts, Eds. "Protective Groups in Organic Synthesis" 2nd edition, Wiley Press, на стр.10-142, 143-174, 175-223, 224-276, 277-308, 309-405 и 406-454.
Является ли группа защитной группой, определяют обычным образом, например, как показано в Kocienski, Philip J. "Protecting Groups" (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994) (далее "Kocienski"), Секция 1.1, стр.2, и Greene Глава 1, стр.1-9. В частности, группа является защитной, если в молярном отношении 90% этой защитной группы удаляется при реакции снятия защиты, не более чем в 50%, типично в 25%, более типично в 10% молекул изобретения, получившихся в результате снятия защиты произошли изменения их структуры ковалентных связей или окислительно/восстановительного статуса, кроме тех, которые вызваны удалением самой защитной группы. Когда в молекуле присутствует много защитных групп одного типа, молярные отношения определяют, когда все группы этого типа удалены. Когда в молекуле присутствует много защитных групп разных типов, воздействуют на каждый тип защитной группы (и определяют молярные отношения) независимо или вместе с другими, в зависимости от того, являются ли условия снятия защиты, подходящие для одного типа, также подходящими для других имеющихся типов. В одной реализации изобретения группа является защитной группой, если, основываясь на молярном отношении, которое определяют обычными методами, 90% этой защитной группы удаляется обычной реакцией снятия защиты, не более чем в 50%, типично в 25%, более типично в 10% молекул изобретения, получившихся в результате снятия защиты, произошли необратимые изменения структуры их ковалентных связей или окислительно/восстановительного статуса, кроме тех, которые вызваны удалением самой защитной группы. Необратимые изменения требуют химических реакций (кроме тех, которые протекают в результате водного гидролиза, кислотно/основной нейтрализации или обычного разделения, выделения и очистки) для восстановления структуры двойных связей или окислительно/восстановительного статуса молекулы по изобретению, лишенной защиты.
Защитные группы вместе с общими концепциями и специфическими стратегиями подробно описаны в Kocienski, Philip J. "Protecting Groups" (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994), что тем самым полностью включается в ссылки. В частности, Chapter 1, Protecting Groups: Review, pp.1-20, Chapter 2, Hydroxyl Protecting Groups: pp.21-94, Chapter 3, Diol Protecting Groups: pp.95-117, Chapter 4, Carboxyl Protecting Groups: pp.118-154, Chapter 5, Carbonyl Protecting Groups: pp.155-185, Chapter 6, Amino Protecting Groups: pp.185-243, Chapter 7, Epilog, pp.24-252, and Index, pp.253-260, которые включаются тем самым в ссылки вместе с особенностями контекста своего содержания. Более конкретно, Секции 2.3 Простые Силиловые Эфиры, 2.4 Простые Алкильные Эфиры, 2.5 Простые Алкоксиалкиловые Эфиры (Ацетали), 2.6 Обзоры (защитные группы для тиольных и гидроксильных остатков), 3.2 Ацетали, 3.3 Производные Силиленов, 3.4 Производные 1,1,3,3-Тетраизопропилдисилоксанилидена, 3.5 Обзоры (защитные группы для диольных остатков), 4.2 Сложные эфиры, 4.3 2,6,7-Триоксабицикло[2.2.2]октаны [ОВО] и Другие Сложные Орто Эфиры, 4.4 Оксазолины, 4.5 Обзоры (защитные группы для карбоксильных остатков), 5.2 O,O-Ацетали, 5.3 S,S-Ацетали, 5.4 O,S-Ацетали, 5.5 Обзоры (защитные группы для карбонильных остатков), 6.2 Производные N-Ацилов, 6.3 Производные N-Сульфонилов, 6.4 Производные N-Сульфенилов, 6.5 Производные N-Алкилов, 6.6 Производные N-Силилов, 6.7 Производные Иминов и 6.8 Обзоры (защитные группы для аминогрупп), которые включаются в ссылки со всей специфичностью, с которой обсуждается введение/удаление защиты требуемых функциональностей. Более того, таблицы «Protecting Groups» расположены на внутренней стороне обложки и следующей странице, «Аббревиатуры» на странице xiv, и «реагенты и расстворители» на странице xv, каждая из которых полностью описывается данным упоминанием.
Типичные защитные группы для гидроксилов описываются в Greene на страницах 14-118 и включают в себя Простые эфиры (Метил), Замещенные Простые Метиловые Эфиры (Метоксиметил, Метилтиометил, t-Бутилтиометил, (Фенилдиметилсилил)метоксиметил, Бензилоксиметил, р-Метоксибензилоксиметил, (4-Метоксифенокси)метил, Гваяколметил, 2,2,2-Трихлорэтилметил, Бис(2-хлорэтокси)метил, 2-(Триметилсилил)этоксиметил, Тетрагидропиранил, 3-Бромтетрагидропиранил, Тетрагидроптиопиранил, 1-Метоксициклогексил, 4-Метокситетрагидропиранил, 4-Метокситетрагидротиопиранил, 4- Метокситетрагидроптиопиранил, S,S-Диоксидо, 1-[(2-Хлор-4-метил)фенил]-4-метоксипиперидин-4-ил, Тетрагидрофуранил, Тетрагидротиофуранил, 2,3,3а,4,5,6,7,7а-Октагидро-7,8,8-триметил-4,7-метанбензофуран-2-ил); Замещенные Простые Этиловые Эфиры (1-Этоксиэтил, 1-(2-Хлорэтокси)этил, 1-Метил-1- метоксиэтил, 1-Метил-1-бензилоксиэтил, 1-Метил-1-бензилокси-2-фторэтил, 2,2,2-Трихлорэтил, 2-Триметилсилилэтил, 2-(Фенилселенил)этил, t-Бутил, Аллил, р-Хлорфенил, р-Метоксифенил, 2,4-Динитрофенил, Бензил); Замещенные Простые Бензиловые Эфиры (р-Метоксибензил, 3,4-Диметоксибензил, о-Нитробензил, р-Нитробензил, р-Галобензил, 2,6-Дихлорбензил, р-Цианобензил, р-Фенилбензил, 2- и 4-Пиколил, 3-Метил-2-пиколил N-Оксидо, Дифенилметил, р,р'Динитробензгидрил, 5-Дибензосуберил, Трифенилметил, α-Нафтилдифенилметил, р-метоксифенилдифенилметил, Ди(р-метоксифенил)фенилметил, Три(р-метоксифенил)метил, 4-(4'-Бромфенацилокси)фенилдифенилметил, 4,4',4''-Трис(4,5-дихлорфталимидофенил)метил, 4,4',4''-Трис(левулиноилоксифенил)метил, 4,4',4''-Трис(бензоилоксифенил)метил, 3-(Имидазол-1-илметил)бис(4',4''-диметоксифенил)метил, 1,1-Бис(4-метоксифенил)-1'-пиренилметил, 9-Антрил, 9-(9-Фенил)ксантенил, 9-(9-Фенил-10-оксо)антрил, 1,3-Бензодитиолан-2-ил, Бензизотиазолил, S,S-Диоксидо); Простые Силиловые Эфиры (Триметилсилил, Триэтилсилил, Триизопропилсилил, Диметилизопропилсилил, Диэтилизопропилсилил, Диметилтексилсилил, t-Бутилдиметилсилил, t-Бутилдифенилсилил, Трибензилсилил, Три-р-ксилилсилил, Трифенилсилил, Дифенилметилсилил, t-Бутилдиметоксифенилсилил); Сложные Эфиры (Формат, Бензоилформат, Ацетат, Хлорацетат, Дихлорацетат, Трихлорацетат, Трифторацетат, Метоксиацетат, Трифенилметоксиацетат, Феноксиацетат, р-Хлорфеноксиацетат, р-поли-Фенилацетат, 3-Фенилпропионат, 4-Оксопентаноат (Левулинат), 4,4-(Этилендитио)пентаноат, Триметилацетат, Адамантоат, Кротонат, 4-Метоксикротонат, Бензоат, р-Фенилбензоат, 2,4,6-Триметилбензоат (Мезитоат); Карбонаты (Метил, 9-Фторенилметил, Этил, 2,2,2-Трихлорэтил, 2-(Триметилсилил)этил, 2-(Фенилсульфонил)этил, 2-(Трифенилфосфонио)этил, Изобутил, Винил, Аллил, р-Нитрофенил, Бензил, р-Метоксибензил, 3,4-Диметоксибензил, о-Нитробензил, S-Бензил Тиокарбонат, 4-Этокси-1-нафтил, Метил Дикарбонат); Группы с Ассистированным Расщеплением (2-Йодбензоат, 4-Азидобутарат, 4-Нитро-4-метилпентаноат, о-(Дибромметил)бензоат, 2-Формилбензолсульфонат, 2-(Метилтиометокси)этил Карбонат, 4-(Метилтиометокси)бутират, 2-(Метилтиометоксиметил)бензоат); Смешанные Сложные Эфиры (2,6-Дихлор-4-метилфеноксиацетат, 2,6-Дихлор-4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феноксиацетат, 2,4-Бис(1,1-диметилпропил)феноксиацетат, Хлордифенилацетат, Изобутират, Моносукциноат, (Е)-2-Метил-2-бутеноат (Тиглоат), о- (Метоксикарбонил)бензоат, р-поли-Бензоат, α-Нафтоат, Нитрат, Алкил-N,N,N',N'-Тетраметилфосфородиамидат, N-Фенилкарбамат, Борат, Диметилфосфинотиоил, 2,4-Динитрофенилсульфенат) и Сульфонаты (Сульфат, Метансульфонат, (Мезилат), Бензилсульфонат, Тозилат (Tos)).
Более типично защитные группы для гидроксилов включают замещенные простые метиловые эфиры, замещенные простые бензиловые эфиры, простые силиловые эфиры и сложные эфиры сульфокислоты, еще более типично, простые триалкилсилилэфиры, тозилаты и ацетаты.
Типичные защитные группы для 1,2- и 1,3-диолов описаны в Green на страницах 118-142 и включают Циклические Ацетаты и Кетали (Метилен, Этилиден, 1-t-Бутилэтилиден, 1-Фенилэтилиден, (4-Метоксифенил)этилиден, 2,2,2-Трихлорэтилиден, Ацетонид (Изопропилиден), Циклопентилиден, Циклогексилиден, Циклогептилиден, Бензилиден, р-Метоксибензилиден, 2,4-Диметоксибензилиден, 3,4- Диметоксибензилиден, 2-Нитробензилиден); Сложные Циклические Орто-Эфиры (Метоксиметилен, Этоксиметилен, Диметоксиметилен, 1-Метоксиэтилиден, 1-Этоксиэтилидин, 1,2-Диметоксиэтилиден, α-Метоксиэтилиден, Производное 1-(N,N-Диметиламино)этилдена, Производное α-(N,N-Диметиламино)этилидена, 2-Оксациклопентилиден) и Производные Силилов (Ди-t-бутилсилиленовая Группа, Производное 1,3-(1,1,3,3-Тетраизопропилдисилоксанилидена, Производное Тетра t-бутоксидисилоксан-1,3-диилидена, Циклические Карбонаты, Циклические Бораты, Этил Борат, Фенил Борат).
Более типично защитные группы для 1,2- и 1,3-диолов включают эпоксиды и ацетониды.
Типичные защиты для аминогрупп описаны в Green на страницах 315-385 и включают Карбаматы (Метил и Этил, 9-Фторенилметил, 9-(2-Сульфо)фторенилметил, 9-(2,7-Дибром)фторенилметил, 2,7-Ди-t-бутил-[9-(10,10-диоксо-10,10,10,10-тетрагидротиоаксантил)]-метил, 4-Метоксифенацил); Замещенный Этил (2,2,2-Трихлорэтил, 2-Триметилсилилэтил, 2-Фенилэтил, 1-(1-Адамантил)-1-метилэтил, 1,1-Диметил-2-галоэтил, 1,1-Диметил-2,2-дибромэтил, 1,1-Диметил-2,2,2-трихлорэтил, 1-Метил-1-(4-бифенилил)этил, 1-(3,5-Ди-t-бутилфенил-1-этилфенил, 2-(2'- и 4'-Пиридил)этил, 2-(N,N-Дициклогексилкарбоксамидо)этил, t-Бутил, 1-Адамантил, Винил, Аллил, 1-Изопропилаллил, Циннамил (Амил коричной кислоты), 4-Нитроциннамил, 8-Хинолил, N- Гидроксипиперидинил, Дитиоалкид, Бензил, р-Метоксибензил, р-Нитробензил, р-Бромбензил, р-Хлорбензил, 2,4-Дихлорбензил, 4-Метилсульфинилбензил, 9-Антрилметил, Дифенилметил); Группы с Ассистированным Расщеплением (2-Метилтиоэтил, 2-Метилсульфонилэтил, 2-(р-Толуолсульфонилэтил)этил, [2-(1,3-Дитианил)]метил, 4-Метилтиофенил, 2,4-Диметилтиофенил, 2-Фосфонийэтил, 2-Трифенилфосфонийизопропил, 1,1-Диметил-2-цианоэтил, м-Хлор-р-ацилоксибензил, р-(Дигидроксиборил)бензил, 5-Бензизоксазолилметил, 2-(Трифторметил)-6-хромонилметил); Группы, Способные к Фотолитическому Расщеплению (м-Нитрофенил, 3,5-Диметоксибензил, о-Нитробензил, 3,4-Диметокси-6-нитробензил, Фенил(о-нитрофенил)метил); Производные Типа Мочевины (Производное Фенотиазинил-(10)-карбонила, N'-р-Толуолсульфониламинокарбонил, N'-Фениламинотиосарбонил); Смешанные Карбаматы (t-Амил, S-Бензил Тиокарбамат, р-Цианобензил, Циклобутил, Циклогексил, Циклопентил, Циклопропилметил, р-Децилоксибензил, Диизопропилметил, 2,2-Диметоксикарбонилвинил, о-(N,N-Диметилкарбоксамидо)бензил, 1,1-Диметил-3-(N,N-Диметилкарбоксамидо)пропил, 1,1-Диметилпропинил, Ди(2-пиридил)метил, 2-Фуранилметил, 2-Йодэтил, Изоборнил, Изобутил, Изоникотинил, р-р'-Метоксифенилазо)бензил, 1-Метилциклобутил, 1-Метилциклогексил, 1-Метил-1-циклопропилметил, 1-Метил-1-(3,5-Диметоксифенил)этил, 1-метил-1-(р-фенилазофенил)этил, 1-Метил-1-фенилэтил, 1-Метил-1-(4-пиридил)этил, Фенил, р-(Фенилазо)бензил, 2,4,6-Три-t-бутилфенил, 4-(Триметиламмоний)бензил, 2,4,6-Триметилбензил); Амиды (N-Формил, N-Ацетил, N-Хлорацетил, N-Трихлорацетил, N-Трифторацетил, N-Фенилацетил, N-3-Фенилпропионил, N-Пиколиноил, N-3-Пиридилкарбоксамид, Производное N-Бензоилфенилаланила, N-Бензоил, N-p-Фенилбензоил); Амиды с Ассистированным Расщеплением (N-o-Нитрофенилацетил, N-o-Нитрофеноксиацетил, N-Ацетоацетил, N'-Дитиобензилоксикарбониламино)ацетил, N-3-(р-Гидроксифенил)пропионил, N-3-(о-Нитрофенил)пропионил, N-2-Метил-2-(o-нитрофенокси)пропионил, N-2-Метил-2-(о-фенилазофенокси)пропионил, N-4-Хлорбутирил, N-3-Метил-3-нитробутирил, N-o-Нитроциннамоил, Производное N-Ацетилметионина, N-o-Нитробензоил, N-о-(Бензоилоксиметил)бензоил, 4,5-Дифенил-3-оксазолин-2-он); Производные Циклических Имидов (N-Фталимид, N-Дитиасукциноил, N-2,3-Дифенилмалеоил, N-2,5-Диметилпирролил, Аддукт 1,1-4,4-Тетраметилдисилилазациклопентана, 5-Замещенный 1,3-Диметил-1,3,5-триазациклогексан-2-он, 5-Замещенный 1,3-Дибензил-1,3,5-триазациклогексан-2-он, 1-Замещеный 3,5-Динитро-4-пиридонил); N-Алкил и N-Арил Амины (N-Метил, N-Аллил, N-[2-(Триметилсилил)этокси]метил, N-3-Ацетоксипропил, N-(1-Изопропил-4-нитро-2-оксо-3-пирролин-3-ил), Четвертичные Соли Аммония, N-Бензил N-Ди(4-метоксифенил)метил N-5-Дибензосуберил, N-Трифенилметил, N-(4-Метоксифенил)дифенилметил, N-9-Фенилфторенил, N-2,7-Дихлор-9-фторенилметилен, N-Ферроценилметил, N-2-Пиколиламин N'-Оксид); Производные Иминов (N-1,1-Диметилтиометилен, N-Бензилиден, N-p-Метоксибензилиден, N-Дифенилметилен, N-[(2-Пиридил)мезитил]метилен, N,(N',N'-Диметиламинометилен, N,N'-Изопропилиден, N-p-Нитробензилиден, N-Салицилиден, N-5-Хлорсалицилиден, N-(5-Хлор-2-гидроксифенил)фенилметилен, N-Циклогексилиден); Производное Енамина (N-(5,5-Диметил-3-оксо-1-циклогексенил)); Производные N-Металлов (Производное N-Борана, Производное N-Дифенилбориновой Кислоты, N-[Фенил(хром- или вольфрам-пентакарбонил)]карбенил, N-Медь, Хелат N-Цинка); N-N Производные (N-Нитро, N-Нитрозо, N-Оксид); N-P Производные (N-Дифенилфосфинил, N-Диметилтиофосфинил, N-Дифенилтиофосфинил N-Диалкил Фосфорил, N-Дибензил Фосфорил, N-Дифенил Фосфорил); N-Si Производные; N-S Производные; Производные N-Сульфенила (N-Бензолсульфенил, N-o-Нитробензолсульфенил, N-2,4-Динитробензолсульфенил, N-Пентахлобензолсульфенил, N-2-нитро-4-метоксибензолсульфенил, N-Трифенилметил-сульфенил, N-3-Нитропиридинсульфенил) и Производные N-Сульфонилов (N-p-Толуолсульфонил, N-Бензолсульфонил, N-2,3,6-Триметил-4-метоксибензолсульфонил, N-2,4,6-Триметоксибензолсульфонил, N-2,6-Диметил-4-метоксибензолсульфонил, N-Пентаметилбензолсульфонил, N-2,3,5,6-Тетраметил-4-метоксибензолсульфонил, N-4-метоксибензолсульфонил, N-2,4,6-Триметилбензолсульфонил, N-2,6-Диметокси-4-метилбензолсульфонил, N-2,2,5,7,8-Пентаметилхроман-6-сульфонил, N-Метансульфонил, N-β-Триметилсилилэтансульфонил, N-9-Антраценсульфонил, N-4-(4',8'-Диметоксинафтилметил)бензолсульфонил, N-Бензилсульфонил, N-Трифторметилсульфонил, N-фенацилсульфонил).
Более типично защита для аминогрупп включает карбаматы и амиды, еще более типично, N-ацетильные группы.
Группы, способные к биологическому расщеплению, обычно включают в себя предшественники лекарственных препаратов. Множество подобных групп описано в "Design of Prodrugs", Hans Bundgaard (Elsevier, N.Y., 1985, ISBN 0-444-80675-Х) и поэтому здесь подробно описываться не будет. В частности Bundgaard, на страницах 1-92 описал предшественники лекарственных препаратов и реакции их биологического расщепления для множества типов функциональных групп. Предшественники лекарственных препаратов для карбоксильных и гидроксильных групп подробно описаны у Bundgaard, на стр. с 3 по 10, для амидов, имидов и других NH-кислотных соединений на стр. с 10 по 27, аминов на стр. с 27 по 43 и циклических предшественников лекарственных препаратов на стр. с 62 по 70. Эти частицы могут быть произвольно присоединены к стероидам по одному, двум или более положениям R1-R6, R10, R15, R17 и R18.
Метаболиты. Также подпадают под рамки изобретения in vivo метаболиты описанных здесь соединений, в случае, если таковые продукты являются новыми и неочевидными. Таковые продукты могут быть получены, например, при окислении, восстановлении, гидролизе, аминировании, этерификации и т.д. введенного субъекту соединения формулы 1, в результате энзиматического или химического процесса. Соответственно, изобретение включает новые и неочевидные соединения, полученные способом, включающим контактирование соединения данного изобретения с субъектом, например человеком, грызуном или приматом в течение промежутка времени, достаточного для образования продукта его метаболизма. Такие продукты обычно идентифицируют, изготовляя меченые радиоактивные соединения (например, 14С, 3H, 131I, 32Р, 35S или 99Те) и назначая их внутрь (парентерально) в определяемых дозах (например, более 0,5 мг/кг) животным, таким как крысы, мыши, морские свинки, приматы или человек, ожидают достаточное для прохождения метаболизма время (обычно от 30 секунд до 30 часов) и выделяя их продукты превращения из мочи, крови или других биологических проб. Данные продукты, поскольку они маркированы, легко выделяются (другие же выделяют с применением антител, способных к связыванию эпитопов, выживающих в метаболите). Структуры метаболитов определяют обычным способом, например, анализами MS (масс-спектрометрия), HPLC (жидкостной хроматографией высокого давления) или NMR (ядерный магнитный резонанс). В основном анализ метаболитов проведен хорошо известным специалистам способом, каким изучают обычный метаболизм лекарственных препаратов. Продукты превращения, поскольку они иным образом не встречаются in vivo, полезны в диагностических анализах для терапевтического дозирования препаратов изобретения, даже если они и не обладают собственной терапевтической активностью.
Составы и композиции для подготовки составов. В том случае, если существует возможность назначения активного ингредиента(тов) в чистом виде, их обычно представляют как фармацевтические составы. Составы изобретения, как для ветеринарии, так и для использования человеком, содержат, по меньшей мере, один активный ингредиент, т.е. соединение формулы 1, совместно с одним или более приемлемыми эксципиентами, и факультативно с другими терапевтическими ингредиентами.
Другой аспект изобретения относится к композициям, содержащим один или более фармацевтически приемлемый эксцепиент(ы) или носитель(ли). Одно или более соединение(я) формулы 1 (также называемое «активным ингредиентом(тами)») назначают любым способом, подходящим для состояний, которые подлежат лечению. Подходящие пути для жидких неводных составов и других составов соединений формулы 1 включают введение орально, ректально, назально, местно (включая буккальное и под язык), вагинально и парентерально (включая подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, интратекально и эпидурально). Чаще всего жидкие неводные составы назначают парентерально. В других вариантах реализации изобретения, таких как способы изобретения с прерывистым дозированием, соединение(я) формулы 1 могут быть представлены в виде жидких неводных составов, сухих твердых составов, которые являются составами для орального, местного, парентерального применения, или в виде жидких водных составов, которые применяют парентерально, орально или местно. Следует понимать, что предпочтительный способ введения может изменяться, например, в зависимости от патологического состояния, или веса, или реакции субъекта на лечение соединениями формулы 1 или другое лечение, соответствующее обстоятельствам.
Составы включают такие составы, которые подходят для вышеупомянутых способов введения. Составы могут быть для удобства представлены в форме единичной дозировки и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в фармакологии. Методики, эксципиенты и составы в большинстве можно найти, например в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1985, 17е издание Nema et al., PDA J. Phann. Sci. Tech. 1997 51:166-171. Способы приготовления составов изобретения включают стадию связывания активного ингредиента(тов) с эксципиентом(ами). В основном составы готовят путем приведения в тесный контакт с образованием однородной смеси активного ингредиента с жидким эксципиентом или тонко измельченным твердым эксципиентом или обоими и затем, при необходимости, формованием продукта.
Составы изобретения, подходящие для назначения орально, готовят в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит определенное заранее количество активного ингредиента, в виде порошка или гранул, в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости, или в виде жидкой прямой (масло-в-воде) эмульсии или жидкой обратной (вода-в-масле) эмульсии. Активный ингредиент(ты) также могут быть представлены в виде пилюль, электуария или пасты.
Таблетку изготовляют путем прессования или отливки, факультативно с одним или более дополнительными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получать на подходящих установках путем прессования активного ингредиента(тов) в свободно-текучей форме, такой как порошок или гранулы, факультативно смешанным со связующим веществом, смазкой, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Литые таблетки можно изготавливать на подходящей установке отливкой смеси активного порошкового ингредиента(тов), смоченной инертным жидким разбавителем. Таблетки факультативно можно покрывать оболочкой или насечками и факультативно готовить таким образом, чтобы обеспечить возможность медленного или контролируемого высвобождения активного ингредиента(тов).
Для лечения инфекций глаз или других наружных тканей, например, рта и кожи, составы обычно применяют в виде местных мазей или кремов, содержащих активный ингредиент(ты) в количествах, например, от 0,075 до 20% по массе (включая содержание активного ингредиента(тов) в диапазоне от 0,1% до 20% с интервалом 0,1% по массе, т.е. 0,6 мас.%, 0,7 мас.%, и т.д.), часто от 0,2% до 15% по массе и наиболее часто от 0,5% до 10% по массе. В случае применения в виде мази активный ингредиент может употребляться совместно либо с парафиновой, либо со смешивающейся с водой основой мази. Альтернативно активные ингредиенты могут быть представлены в виде крема с основой крема "масло-в-воде".
По желанию водная фаза основы крема может включать, например, по меньшей мере, 30 мас.% многоатомного спирта, т.е. спирта, имеющего две или более гидроксильные группы, такого как пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, маннитол, сорбитол, глицерол и полиэтиленгликоль (включая ПЭГ 400) и их смеси. Составы для местного применения могут, по желанию, включать компоненты, которые улучшают абсорбцию или проникновение активного ингредиента(тов) через кожу или другие участки, которые подвергают воздействию. Примеры таких усилителей проникновения через кожу включают диметилсульфоксид и родственные ему аналоги.
Масляная фаза эмульсий согласно изобретению может быть составлена из известных эксципиентов известными способами. Несмотря на то, что фаза может содержать исключительно эмульсификатор (иначе известный как эмульгатор), желательно она включает смесь, по меньшей мере, одного эмульсификатора с жиром или маслом или с жиром и маслом одновременно. Гидрофильный эмульсификатор может быть включен совместно с липофильным эмульсификаторм, который действует как стабилизатор. Некоторые варианты реализации изобретения включают как масло, так и жир. Совместно эмульсификатор(ры) со стабилизатором(ами) или без него образуют так называемый эмульгирующий воск, а воск совместно с маслом и жиром образует эмульгирующую мазевую основу, которая формирует масляную дисперсную фазу кремовых составов.
Эмульгаторы и стабилизаторы эмульсий для применения состава включают Tween60™, Span80™, цетостеариловый спирт, бензиловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат и лаурилсульфат натрия.
Выбор подходящих масел или жиров для состава основан на достижении желаемых косметических свойств. Крема обычно должны представлять собой нежирные, не оставляющие пятен, смываемые продукты подходящей консистенции для предотвращения вытекания из тюбиков или других контейнеров. Можно использовать прямые или разветвленные моно- или диосновные алкиловые эфиры, такие как ди-изо-адипат, изоцетилстеарат, пропиленгликолевый диэфир или жирные кокосовые кислоты, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпальмитат, бутилстеарат, 2-этилгексилпальмитат или смесь сложных эфиров с разветвленными цепями, известных как Crodamol CAP. Указанные реагенты можно использовать в одиночку или в комбинации в зависимости от требуемых свойств. Альтернативно используют липиды с высокой точкой плавления, такие как белый мягкий парафин и/или жидкий парафин или другие минеральные масла.
Составы, подходящие для местного применения на глазах, также включают глазные капли, в которых активный ингредиент(ты) растворены или суспендированы в подходящем эксципиенте(тах), особенно в водном растворителе для активного ингредиента(тов), который содержит один или более зарядов при значениях рН, близких к нейтральным, т.е. около 6-8. Активный ингредиент(ты) обычно присутствуют в таких составах в концентрациях около 0,5-20% по массе, обычно около 1-10% по массе, часто около 2-5% по массе.
Составы, подходящие для местного применения во рту, включают лепешки, содержащие активный ингредиент в душистой основе, обычно сахарозе и гуммиарабике или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент(ты) в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахарозе и гуммиарабике; и составы для полоскания рта, содержащие активный компонент(ты) в подходящем жидком эксцепиенте(тах).
Составы для ректального применения могут быть представлены в виде суппозитариев на подходящей основе, например кокосовом масле или салицилате.
Составы, подходящие для внутрилегочного или назального назначения имеют размер частиц, например, в диапазоне от 0,01 до 500 мкм (включая средний размер частиц в диапазоне от 0,01 до 500 мкм с интервалом 0,1 мкм или другими интервалами, например, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100 мкм и т.д.), которые назначают путем быстрых ингаляций через носовой ход или путем ингаляций через рот, так чтобы достичь альвеолярных мешочков. Подходящие измельченные составы включают водные или масляные растворы или суспензии активного ингредиента(тов). Составы, приемлемые для назначения в виде аэрозолей, сухих порошков или таблеток могут быть приготовлены в соответствии с обычными способами и могут быть введены с другими терапевтическими агентами, такими как соединения, ранее используемые для лечения или профилактики вирусных или других инфекций, как это описано здесь. Такие составы могут быть назначены, например, орально, парентерально (в/в, в/м, п/к), местно или буккально.
Составы, подходящие для вагинального назначения, могут быть представлены пессариями, тампонами, кремами, гелями, пастами, пенками или спреями, которые содержат в дополнение к активному ингредиенту(там) эксцепиенты, которые специалистами считаются подходящими в этих случаях.
Составы, применяемые для парентерального назначения, включают водные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и сгущающие агенты.
Составы представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например запечатанных ампулах и колбах, и могут храниться в высушенном сублимированием (лиофилизированном) состоянии, так что требуется только добавить непосредственно перед применением стерильный жидкий эксципиент, например воду для инъекций. Приготовленные для немедленного применения инъекционные растворы и суспензии готовят из стерильного порошка, гранул и таблеток, описанных выше. Составы одной дозы таковы, что содержат дневную дозу или одну дневную поддозу, на что здесь есть ссылки, или подходящую часть таковой, активного ингредиента(тов).
Следует понимать, что дополнительно к ингредиентам, особо отмеченным выше, составы данного изобретения могут включать другие агенты или эксципиенты, подходящие в данном случае в зависимости от рассматриваемого типа состава, например, для орального применения, они могут включать вкусовые добавки.
Далее изобретение предлагает композиции для ветеринарии, содержащие по меньшей мере один активный описанный выше ингредиент, соответственно совместно с ветеринарным эксципиентом(ами). Ветеринарными эксципиентами являются материалы, необходимые для успешного введения композиций, при этом они могут быть твердыми, жидкими или газообразными веществами, инертными в других отношениях или приемлемыми для целей ветеринарии и совместимыми с активным ингредиентом(ами). Такие композиции для ветеринарии могут назначаться орально, парентерально или любым другим желаемым способом.
Составы изобретения включают содержащие активный ингредиен(ты) фармацевтические составы с контролируемым высвобождением («составы с контролируемым высвобождением»), в которых высвобождение активного ингредиента(тов) контролируется и регулируется, что позволяет дозировать препарат с меньшей частотой или улучшить фармакологическую кинетику или профиль токсичности данного активного ингредиента(тов).
Эффективная доза активного ингредиента(тов) зависит по меньшей мере от природы состояния, которое подлежит лечению, токсичности, того, применяется ли соединение(я) профилактически (низкие дозировки) или в случае острых инфекций или состояний, способа введения фармацевтического состава, и должна быть определена врачом в процессе стандартного изучения постепенного повышения доз. Можно ожидать, что она будет лежать в пределах от 0,05 до примерно 30 мг/кг веса в день. Например, для местного применения, дневная пробная доза для взрослого человека с весом тела примерно 70 кг будет колебаться в пределах от 1 мг до примерно 500 мг, обычно в пределах от примерно 5 мг и до примерно 40 мг, и может быть принята в виде однократной или многократной дозы, или в одном или нескольких местах.
Варианты реализации включают составы, которые содержат липосому или липидный комплекс, который включает соединение(я) формулы 1, например, BrEA или его эфир, карбамат, карбонат, аминокислоту или пептид. Такие составы готовят в соответствии с известными способами, например, как описано в патентах США 4427649, 5043165, 5714163, 5744158, 5783211, 5795589, 5795987, 5798348, 5811118, 5820848, 5834016 и 5882678. Липосомы факультативно могут содержать дополнительный терапевтический агент(ы), например амфотерицин В, цис-платин, адриамицин, ингибитор протеазы, нуклеозид или аналог нуклеотида, одного из вышеупомянутых типов. Составы, которые содержат липосомы, могут назначаться субъекту одним из обычных способов, например орально, в виде аэрозоля или парентерально (т.е. п/к, в/в или в/м).
Терапевтическое применение. Соединения формулы 1 или биологически активные вещества, получаемые из этих соединений в результате гидролиза или метаболизма in vivo, имеют ряд клинических и неклинических применений. Соединения в основном используют для усиления иммунных реакций Т1 или для подавления иммунных реакций Т2. В данном случае в отношении иммунных реакций Т1 и Т2 подразумеваются такие реакции, которые наблюдаются у млекопитающих в целом и не наблюдаются у представителей мышиных, от которых происходит терминология Т1 и Т2. Так, у человека, T1 клетки предпочтительно обнаруживают хемокинетические рецепторы CXCR3 и CCR5, тогда как Т2 клетки предпочтительно экспрессируют молекулы CCR4 и меньшее количество молекул CCR3.
Отдельные аспекты изобретения включают композиции, которые заключают в себе некоторое количество по меньшей мере одного соединения формулы 1, эффективного для увеличения относительного содержания желаемой подгруппы иммунных клеток, например CD4+ Т клеток, NK клеток или дендритных клеток, или для изменения одной или более функций подгрупп иммунных клеток, и фармацевтически приемлемый носитель. Типичная иммуномодуляция направлена на изменение экспрессии гена(ов), которые усиливают иммунную реакцию Тh1 или подавляют иммунную реакцию Th2. Функции, на которые оказывают влияние соединения формулы 1, включают экспрессию молекул CD, или изменение пропорций подгрупп клеток, например, CD44+ или CD8+ Т клеток, или их относительное количество в крови или тканях субъекта. Молекулы CD принимают участие в функционировании различных подгрупп иммунных клеток и могут быть полезны в качестве маркеров иммунной функции in vivo. В некоторых аспектах соединения формулы 1 активируют иммунные клетки, которые обычно изменяют (увеличивают или снижают) экспрессию или изменяют количество клеток, которые экспрессируют комбинации молекул CD4, CD6, CD8, CD25, CD27, CD28, CD30, CD38, CD39, CD43, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CD71, CD90 или HLA-DR. Часто количество клеток, которые экспрессируют эти молекулы, например, CD25, CD16 или CD69, возрастает. Обычно такое возрастание наблюдают в виде увеличения пропорции циркулирующих белых кровяных клеток, которые экспрессируют одну или более из этих молекул. В некоторых случаях заметно изменяется количество таких молекул на отдельную клетку.
После назначения субъекту соединений формулы 1 также заметно изменяется экспрессия одной или более адгезионных молекул CD2, CD5, CD8, CD11a, CD11b, CD11с, CD18, CD29, CD31, CD44, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD54, CD58, CD103 или CD104. Часто наблюдается возрастание количества клеток, которые экспрессируют данные молекулы, например, CD5 или CD56. Адгезионные молекулы задействованы в разных аспектах иммунных реакций, таких как крепление к молекулам МНС 1 класса, трансдукция сигналов между клетками или крепление к молекулам в внеклеточной матрице, связанной с клетками эндотелия или другими типами клеток.
Назначение соединений формулы 1 субъекту также влияет на число определенных подгрупп иммунных клеток, например NK клеток (например, CD8-, CD56+ или CD8+, CD56+) или активируемых лимфокинами клеток киллеров (LAK). Обычно наблюдается увеличение циркулирующих NK или LAK клеток, что отражается в увеличении количества клеток, которые экспрессируют одну или более молекулу CD16, CD38, CD56, CD57 или CD94. Также наблюдается увеличение числа циркулирующих предшественников дендритных клеток, на что указывает возрастание числа клеток, которые экспрессируют одну или более молекулу CD11 с, CD80, CD83, CD106 или CD123. Хотя можно наблюдать увеличение содержания циркулирующих белых кровяных клеток, которые экспрессируют одну или более из этих молекул, в некоторых случаях количество таких молекул на отдельную клетку заметно изменяется. Так же может быть сильно изменено как количество клеток, так и плотность молекул CD на отдельную клетку. Изменение в подгруппах иммунных клеток обычно происходит в случае применения прерывистого дозирования соединений формулы 1.
Также, после назначения субъекту соединений формулы 1, может быть заметно изменена экспрессия одного или более самонаводящихся рецепторов, таких как CD62L. Часто возрастает и количество клеток, которые экспрессируют эти молекулы, например CD62L.
Другие молекулы CD, которые претерпевают изменения в случае присутствия в субъекте соединений формулы 1, включают молекулы рецепторов цитокинов, такие как CD115, CDW116, CD117, CD118, CDW119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125 CD126, CDW127, CDW128 или CDW130. Часто будет меняться и количество рецепторов на отдельную клетку. Например, количество рецепторов цитокинов, которые медиируют иммунную реакцию Тh1 (например, IL-2, 
) обычно будет возрастать внутри или на поверхности клетки, которая медиирует иммунную реакцию Th1. Модулирование этих молекул может происходить при прямом взаимодействии с рецептором(рами) в клетке, которая экспрессирует рецептор цитокина, или опосредованно, путем модулирования синтеза цитокинов в подвергнувшейся воздействию клетке или других клетках, обычно иммунных клетках, которые могут взаимодействовать с клетками, синтез рецепторов которых модулируют.
Лечение субъекта соединениями формулы 1 может привести к изменениям в некоторых подгруппах иммунных клеток по меньшей мере на 25-50% в большую или меньшую сторону, по сравнению с контрольным или базовым уровнями. Например, повышение более чем на 30% общего числа активированных CD8+ Т клеток, например CD8+, CD69+, CD25+ Т клеток, CD8+, CD69+, CD25- Т клеток или CD8+, CD69-, CD25+ Т клеток, обычно происходит на 7 день после однократного введения субъекту соединения формулы 1. Таковое увеличение общего числа активированных CD8+ Т клеток или подгрупп активированных CD8+ Т клеток у отдельных субъектов может быть более чем на 50%, 60% или 100%. Обычно такое увеличение общего числа активированных CD8+ Т клеток или подгрупп активированных CD8+ Т клеток на единицу объема крови по сравнению с базовым уровнем в среднем составляет около 30-40%, и с отдельными субъектами, которые показывают более чем 100% увеличение числа активированных CD8+ Т клеток.
Назначение соединений формулы 1 может влиять и на другие подгруппы иммунных клеток. Например, концентрация циркулирующих CD4+, CD69+, CD25- (Тh1 клетки хелперы) и CD8+, CD16+, CD38+ LAK клеток или CD8-, CD16+, CD38+ LAK клеток обычно возрастает во время или после курса дозировок субъекту соединений формулы 1. Также увеличение количества от среднего до значительного могут показывать CD8-, CD16+, CD38+ и CD8+ CD16+, CD38+ (ADCC эффекторные клетки) и low side scatter Lin-, DR+, CD123+ (предшественники дендритной клетки) или low side scatter Lin-, DR+, CD11c+ (дендритные клетки или их предшественники).
У субъектов с подавленным иммунитетом, например, в результате инфекции (например, вирусной (HIV, HCV), бактериальной инфекции или паразитарной инфекции) или после химиотерапии (например, противовирусной химиотерапии, онкологической химиотерапии или радиотерапии), назначение субъекту соединений формулы 1 приводит к благоприятному сдвигу соотношения реакций Тh1 или Th2, которые субъект способен проявить с учетом подавленного иммунитета. В случае, если реакции Тh1 ниже оптимальных или недостаточны, лечение соединениями формулы 1 приводит к усилению реакций Тh1 или снижению реакций Th2. И наоборот, в случае, если ниже оптимальных или недостаточны реакции Th2, лечение соединениями формулы 1 приводит к усилению реакций Th2 или снижению реакций Тh1. Таким образом, соединения формулы 1 можно использовать для изменения природы иммунной реакции субъекта, что приведет к переходу от иммунодепрессии к более сбалансированной иммунной реакции. Альтернативно соединения могут избирательно подавлять неподходящую или нежелательную иммунную реакцию. Очевидно, хотя бы частично, усиление реакции Тh1 происходит по одной или более из нижеследующих причин: (1) снижение биологического ограничения (сдерживания), например, высоких уровней IL-4 или IL-10 на функции Th1 через предшественников первичных Th1 эффекторных клеток, (2) ускорение дифференциации Th0 клеток в Th1 клетки или усиление реакций, передаваемых Th1 клетками, (3) усиление воздействия вспомогательных клеточных функций, например, антигенной презентации дендритными клетками предшественниками или макрофагами, (4) ускорение пролиферации и дифференциации предшественников Th1 клеток или их прогенитальных клеток, (5) усиление экспрессии IL-12 в дендритных клетках или их предшественниках, что приводит к ускорению дифференциации Th1 клеток из их Th0 предшественников, (6) усиление экспрессии или активности факторов, связанных с функциями Th1, например, IL-2 гамма интерферона (γ-IFN) или лимфотоксина.
Одним из аспектов способов изобретения является изменение экспрессии IL-4 или IL-10, которое происходит после назначения субъекту соединений формулы 1, например, BrEA. Последовательно наблюдается быстрое снижение внеклеточных IL-4 или IL-10 до уровней, которые невозможно определить методом ELISA (иммуноферментного твердофазного анализа). Содержание внутриклеточных IL-10 снижается до уровней, близких или более низких, чем предельные уровни определения методом поточной цитометрии. Назначение субъекту соединений формулы 1 таким образом представляет собой средство подавления каждого в отдельности или двух этих интерлейкинов. Таковое подавление может быть связано с усилением иммунных реакций Th1 по отношению к реакциям Th2 или Th0, например, у субъектов, у которых реакции Th1 подавлены (например, в результате вирусных, бактериальных или паразитарных инфекций (HIV, HCV и т.д.) или химиотерапии) или они ниже нормы по другой причине. У многих субъектов, до дозирования соединения формулы 1, наблюдаются низкие или неопределяемые уровни либо IL-4 либо IL-10, обычно IL-10. У таких субъектов, дозирование соединения формулы 1 приводит к быстрому падению (концентрации) того интерлейкина, который является определяемым, обычно IL-4.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначали субъекту, имеющему патогенную инфекцию, такую как вирусная, бактериальная или паразитарная инфекции. Соединения формулы 1 могут рассматриваться для применения в случае широкого спектра инфекций (см., например, под ред. J.B.Peter, Use and Interpretation of Laboratory Tests in Infectious Disease, 5th Edition, Specialty Laboratories, Santa Monica, CA 90404, 1998, pp.1-271), поскольку эти соединения обычно усиливают иммунную реакцию Тh1 и/или снижают иммунную реакцию Th2. Трудности в лечении некоторых инфекций, например прогрессирующего токсоплазмического энцефалита, малярии, туберкулеза, лейшманиоза и шистосомоза, часто оказываются связанными с нежелательными иммунными реакциями Th2. Обычно нежелательные иммунные реакции Th2 связаны с или вызваны повышенной экспрессией одного или более цитокинов или интерлейкинов, таких как IL-4 и IL-10. Назначение соединений формулы 1 или других соединений, описанных здесь, будет, как правило, снижать экспрессию одного или более цитокинов или интерлейкинов, связанных с Th2. В то же самое время соединения усиливают экспрессию одного или более цитокинов или интерлекинов, связанных с иммунными реакциями Th1. Благодаря их способности изменять иммунные реакции Th1 и Th2, эти соединения полезны в случае многих клинических состояний, где желательна усиленная иммунная реакция Th,1 например, при инфекции, подавленном иммунитете или раке. Например, в случае рассеянного или диффузного туберкулеза, может быть желательно снижение иммунной реакции Th2 для того, чтобы дать пациенту возможность замедлить течение болезни или более эффективно очищать инфицированные клетки.
Аспект изобретения предлагает варианты реализации изобретения, в которых субъекту для лечения инфекций, например паразитарных инфекций, таких как малярия, Toxoplasma, Cryptosporidium, или для лечения рака или злокачественной опухоли, назначают соединения формулы 1 и ингибитор глутатионовой редуктазы, такой как бутатион сульфоксимин [CH3-(CH2)3-S(=O)(=NH)-(CH2)2-CHNH2-C(O)-OH]. Уменьшение количества восстановленного глютатиона может усилить фагоцитоз макрофагов, возможно из-за усиления вызванных окислением повреждений в инфицированных клетках или в размножающихся злокачественных клетках. Альтернативно применение ингибитора глутатионовой редуктазы может привести к улучшению распознавания инфицированных клеток или злокачественных клеток иммунной системой. Например, соединение формулы 1, такое как BrEA, совместно с бутатион сульфоксимином используют для ускорения очищения от инфицированных клеток при малярии на стадии кольца или для усиления распознавания злокачественных клеток иммунной системой, в сравнении в применением соединения формулы 1 в одиночку. Инфекции и злокачественные опухоли, в которых применимы данные варианты реализации изобретения такие, как здесь описано.
Другой аспект изобретения предусматривает применение соединения формулы 1 и флавоноида, например нарагин фловоноида, для усиления биодоступности соединения формулы 1. В данных вариантах реализации изобретения эффективное количество флавоноида назначают субъекту, который получает соединение формулы 1. Обычно на 1 кг веса тела субъекту назначают около 1-10 мг флавоноида, такого как бавахинин А, дидимин (изосакуранетин-7-рутинозид или неопонсирин), флавономареин (изоканин-7-глюкозид), флованон азин, флованон диацетилгидразон, флованон гидразон, силибин, силихристин, изосилибин или силандрин. Флавоноидное соединение обычно назначают одновременно с соединением формулы 1 или за несколько, например около 1, 2 или 3 часов, до назначения субъекту соединения формулы 1.
Липосомные составы могут быть использованы для улучшения доставки соединения(ний) формулы 1 к определенным типам клеток, таким как опухолевые клетки или к клеткам ретикулоэндотелиальной системы («RES») (см. патент США 5714163). В RES входят макрофаги, мононуклеарные фагоцитирующие клетки, клетки, выстилающие синусоиды селезенки, лимфатических узлов и костного мозга и фибробластические ретикулярные клетки кроветворных тканей. В целом, RES клетки являются фагоцитами и они являются мишенями для целевой доставки соединения(й) формулы 1 in vitro или in vivo при помощи липосом или других композиций или составов. Таким образом, соединение формулы 1 можно доставлять до неоплазмы, происходящей от ретикулоэндотелиальной ткани (ретикулоэндотелиома). Липосомы факультативно могут содержать пептид инфицирующего агента, такого как малярийный паразит. Пептиды могут содействовать генерации реакции МНС класса II и В клеток.
Вакцинные адъюванты. Описанные здесь соединения также могут быть использованы как адъюванты вакцин с иммуногенами или компонентами иммуногенных композиций для подготовки анитител, способных специфически крепиться к соединениям формулы 1, продуктам их метаболизма, которые содержат иммунологически распознаваемые эпитопы (места крепления антител) или к стандартным антигенам, которые используют для вакцинации против, например, агентов инфекции или злокачественных клеток. Поэтому иммуногенные композиции полезны в качестве интермедиаторов при подготовке антител, крепящихся к соединениям формулы 1, для применения, например, в диагностике, контроле качества или тому подобным методикам, или для анализа самих соединений или новых продуктов их метаболизма. Дополнительно соединения применимы для получения антител на полипептиды, которые в противных случаях будут являться неиммуногенными, при этом соединения могут выступать в роли стимулирующих иммунную реакцию гаптеновых сайтов.
Интересующие нас продукты гидролиза включают рассмотренные выше продукты гидролиза защищенных кислотных и основных групп. В некоторых вариантах реализации изобретения кислотные или основные амиды, содержащие иммуногенные полипептиды, такие как альбумин, гемоцианин limpet keyhole и другие, описанные ниже, полезны в качестве иммуногенов. Описанные ниже продукты метаболизма могут сохранять значительную степень иммунологической связывающей реактивности к соединениям изобретения. Таким образом, антитела согласно данному изобретению будут способны к креплению к незащищенным соединениям изобретения без крепления к защищенным соединениям, альтернативно, продукты метаболизма будут способны к креплению к защищенным соединениям и/или продуктам метаболизма без крепления к защищенным соединения изобретения, или будут способны к специфическому креплению по любому из трех вариантов. Антитела, желательно, не должны в значительной степени перекрестно реагировать с природными веществами. Значительная перекрестная реактивность - это реактивность в особых условиях анализа для специфического аналита, достаточная для того, чтобы влиять на результаты анализа.
Иммуногены данного изобретения состоят из соединения данного изобретения, представляющего желательные эпитопы в соединении с иммуногенным веществом. В рамках изобретения такое соединение означает ковалентное связывание с образованием иммуногенного коньюгата (когда это возможно) или смесь нековалентно связанных веществ, или их комбинацию. Иммуногенные вещества включают адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, иммуногенные протеины, такие как полипептиды вирусного, бактериального, дрожжевого, растительного и животного происхождения, в частности гемоцианин keyhole limpet, альбумин сыворотки крови, тироглобулин быка или ингибитор тирозина соевых бобов, иммуногенные полисахариды. Обычно соединение, имеющее структуру желаемого эпитопа, ковалентно связывают с иммуногенным полипептидом или полисахаридом полифункциональным (обычно бифункциональным) сшивающим агентом. Способы получения гаптеновых иммуногенов известны per se. Для применения подходят любые способы из ранее применяемых для присоединения гаптенов к иммуногенным полипептидам или аналогичным соединениям, с учетом того, какие функциональные группы предшественников или продуктов гидролиза доступны для сшивки, а также вероятности получения антител, специфичных к рассматриваему эпитопу, в противоположность иммуногенному веществу.
Обычно полипептид присоединяют к сайту химического соединения изобретения, расположенному на некотором расстоянии от распознаваемого эпитопа.
Конъюгаты готовят обычным способом. Например, для получения конъюгатов по данному изобретению, можно использовать такие сшивающие агенты, как N-гидроксисукцинимид, сукцинид ангидрид или С2-8-алкил-N=С=N-С2-8-алкил. Конъюгаты содержат соединение изобретения, прикрепленное к иммуногенному веществу химической связью или связующей цепочкой из 1-100, чаще 1-25, еще чаще 1-10 атомов углерода. Конъюгаты отделяют от начальных веществ и побочных продуктов при помощи хроматографии или подобным способом, и затем в стерильных условиях фильтруют и помещают в сосуды для дальнейшего хранения. Синтетические способы приготовления несущих гаптен иммуногенов были описаны ранее, например, у G.Т.Hermanson, Bioconjugate Techniques Academic Press, 1996, стр.419-493.
Соединения данного изобретения сшиты, например, посредством одной или более следующих групп: гидроксильной группы, карбоксильной группы, атома углерода или аминогруппы. Внутри таких соединений содержатся амиды полипептидов, в которых полипептид действует, как вышеописанная защищающая группа.
Животных обычно иммунизируют против иммуногенных конъюгатов или их производных, при этом антисыворотку или моноклональные антитела готовят общепринятым способом.
В варианте реализации изобретения, в котором соединения формулы 1 используются в качестве адъювантов для усиления иммунной реакции субъекта на антигены, такие как белки, пептиды или вирусные или клеточные препараты, соединения формулы 1 назначают примерно в то же самое время, в которое субъекту вводят антиген, например в течение примерно 7 дней после введения субъекту антигена. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения формулы 1 назначают за 1, 2, 3 или 4 дня до введения субъекту антигена. В других вариантах реализации изобретения соединения формулы 1 назначают в тот же день, когда субъекту вводят антиген. В дополнительных вариантах реализации изобретения соединения формулы 1 назначают через 1, 2 или 3 дня после введения антигена. Соединение формулы 1 можно назначать субъекту при помощи любых составов или способов введения описанных здесь или в цитированных здесь ссылках. Аспекты изобретения включают композиции или составы, содержащие соединение формулы 1, один или более эксципиентов и антиген или препарат антигена, такой как разрушенные клетки или вирусы или, такой как ослабленные вирусы или вакцины ДНК.
Родственные варианты реализации изобретения включают способы, включающие назначение субъекту (например, млекопитающему, такому как человек или примат), или введение в ткани субъекта эффективного количества соединения формулы 1 и специфического антигена. Эти способы полезны для усиления иммунной реакции субъекта на антиген. Усиленная иммунная реакция включает иммунную реакцию слизистой оболочки на антиген, такой как протеин, пептид, полисахарид, микроорганизм, экстракт опухолевых клеток или летально облученные опухолевые или патогенные клетки (например, антигены или клетки меланомы, карциномы почечных клеток, рака молочной железы, рака простаты, доброкачественной гиперплазии простаты, вирусы или бактерии или другие опухоли или патогены, раскрытые здесь). Аспекты этих вариантов реализации изобретения включают усиление иммунной реакции субъекта в случае, если антиген или иммуноген назначается интраназально или орально. В этих аспектах соединение формулы 1 назначается почти одновременно с антигеном или в течение 3-72 часов после введения антигена. Применение иммуномодулирующих агентов для усиления иммунной реакции на вакцину было описано ранее, например в патенте США 5518725.
Другие применения соединения(ий) формулы 1 включают назначение соединения(ний) субъекту, страдающему от паталогического состояния(ний). Лечение может лечить или устранять причину, вызывающую состояние(я) и/или симптомы, связанные с патологическим состоянием(ями), таким как инфекция патогеном(нами) (вирусы, бактерии, грибы), опухоль, нежелательная иммунная реакция, например иммунная реакция, которая вызывает патологию и/или симптомы, например, аутоиммунные состояния или аллергия или состояния, такие как состояния гипопролиферации, например, нормальный или ослабленный рост тканей, или заживление ран или заживление ожогов, или в состояниях иммунодепрессии, например, состояний, характеризующихся отсутствием желательной реакции и/или неадекватной степенью желаемой реакции.
Много раков или опухолей связаны с нежелательной иммунной реакцией Th2 или недостаточной реакцией Th1. Недостаточная иммунная реакция Th1 может играть свою роль в способности злокачественных клеток избегать иммунного контроля. Эти состояния включают non-small cell рак легких, бронхогенную карциному, рак или карциному почечных клеток, лимфому, глиому, меланому, аденокарциному желудка или поджелудочной железы, ассоциированную с папилловирусом человека, цервикальную интраэпителиальную неоплазию, цервикальную карциному, гепатому и кожную лимфому Т-клеток (грибковые заболевания слизистых, синдром Sezary).
В некоторых из этих вариантах реализации изобретения гиперпролиферационное или злокачественное состояние субъекта может быть связано с одним или более патогенов. Например, карцинома клеток печени, связанная с HCV или HBV, саркома Капоши, связанная с HIV-1 или HIV-2, Т-клеточная лейкемия, связанная с HTLV I, лимфома Burkitt, связанная с вирусом Эпштейна-Барра или папилломы, или карцинома, связанная с вирусами папилломы (HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 45) или аденокарцинома желудка или MALT липома желудка, связанная с инфекцией Helicobacter pylori. В других вариантах реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначают субъекту, имеющему состояния гиперпролиферации, которые, очевидно, не связаны с патогеном, например, меланома или рак или предрак, возникающий в горле, пищеводе, желудке, кишечнике, толстой кишке, яичниках, легких, молочной железе или центральной нервной системе.
В примерах реализации изобретения, пациентами являются люди, страдающие от меланомы или предшествующих карциноме повреждений, которые получают лечение разработанными кремами местного назначения, содержащими 2-20% BrEA (мас/мас). Крем назначают на первичные nevi (диспластические nevi или обычно приобретенные nevi), первичные кожные меланомы, вторичные кожные меланомы и кожу, окружающую nevi или меланомы. Если это возможно, перед назначением крема поверхности, которые подлежат лечению, моют с мылом или протирают спиртом (например, этанолом или изопропанолом). В зависимости от размера поверхности, подвергающейся лечению, наносят примерно 0,1-0,4 г крема, один или два раза в день на подвергающуюся лечению поверхность или повреждение в течение примерно 10-20 дней. Крем оставляют на подвергающейся лечению поверхности в течение 15-30 минут до того, как пациент возобновляет обычную активность. У большинства пациентов рост nevi и меланом замедляется, а у некоторых повреждений наблюдается значительная регрессия. Вслед за первичным курсом лечения, состав назначают каждый день по меньшей мере в течение от 1 до 4 месяцев, с применением тех же дозировок, которые были описаны для первичного курса лечения. У таких пациентов факультативно начинают или продолжают проводить стандартное лечение предшественников повреждений или меланомы, например, диметилтриазеноимидазолом карбоксамидом или нитрозокарбамидами (например, BCNU, CCNU), в соответствии с рекомендациями лечащего врача пациента и информированном согласии самого пациента. В тех случаях, когда опухоль или предшествующее повреждение удалено хирургически и место операции достаточно зажило, пациент факультативно продолжает использовать местный состав на поверхности и прилегающих районах каждый день в течение, по меньшей мере, от 1 до 4 месяцев. В некоторых из данных вариантов реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначаются постоянно ежедневно в виде композиции или состава для орального применения, например, в случае соединений(я) формулы 1, которые являются новыми per se. Факультативно также назначается для систематического применения BrEA, например, описанные далее в примерах составы, для приема по 1-5 мг/кг/день ежедневно примерно в течение от 1 недели до примерно 4 месяцев, например, в случае злокачественной меланомы.
Недостаточная иммунная реакция Th1 часто связана с вирусной инфекцией. Вирусные инфекции могут происходить от вирусов ДНК или РНК, например, вирусы герпеса, гепаднавирусы, аденовирусы, ретровирусы, тогавирусы, альфавирусы, арбовирусы, флавивирусы, риновирусы, вирусы папиллом и/или пестивирусы. Типичные вирусы были описаны ранее. См., например, В.N.Fields, et al., издатели. Fundamental Virology, 3е издание, 1996, Lippencott-Raven Publishers, см. главу 2 на стр.23-57, включая табл.4 на стр.26-27, табл.5 на стр.28-29, главу 17 на стр.523-539, главы 26-27 на стр.763-916, главу 32 на стр.1043-1108 и главу 35 на стр.1199-1233. В данном описании, ретровирусы включают вирусы человека и животных, например HIV-1, HIV-2, LAV, вирус I лейкемии человеческих Т клеток ("HTLV I"), HTLV II, HTLV III, SIV, SHIV, FIV, FeLV. Дополнительные вирусы, включая их геногруппы, clades, изоляты, линии и другие, вызывающие вирусную инфекцию, включают человеческий вирус гепатита С (″HCV″), человеческий вирус гепатита В ("HBV"), человеческий вирус гепатита A ("HAV"), вирус гепатита уток, вирус гепатита сурков, человеческий ("HPV", например, HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 45), или вирусы папиллом животных, Poliovirus, Herpes simplex вирус 1 ("HSV-1"), Herpes simplex вирус 2 ("HSV-2"), человеческий Herpesvirus 6 ("HHV-6"), человеческий Herpesvirus 8 ("HHV-8"), Dengue virus (типы 1-4), западный вирус лошадиного энцефалита, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки и вирус вирусной диарреи коров.
Другие состояния, в которых вовлечен иммунный дисбалланс или избыточная иммунная реакция Тh2, включают аутоиммунные заболевания, такие как SLE (системная эритематозная волчанка), остеопороз, множественный склероз, миастения гравис, болезнь Грависа, связанный с клещами язвенный дерматит, ревматоидный артрит и остеоартрит. Избыточные иммунные реакции Th2 также связаны с нежелательными симптомами или патологией, например утомляемостью, болью, лихорадкой или увеличением степени (сферы, охвата) инфекции, что связано со старением, аллергией и воспалительными состояниями, такими как аллергический бронхопульмонарный аспергиллоз у пациентов с фиброзом мочевого пузыря, атопическая астма, аллергические респираторные заболевания, аллергический ринит, атопический дерматит, субэпителиальный фиброз при гиперчувствительности воздуховодных путей, хронический синусит, многолетний аллергический ринит, болезнь Crohna (региональный энтерит), язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, фиброзный альвеолит (легочный фиброз).
Другие клинические проявления, которые имеют связь или имеют симптом(ы), которые согласуются с избыточной иммунной реакцией Th2, например утомляемость, боль, лихорадка или увеличение частоты инфекций, включают шизофрению, острый миелит, саркоидоз, ожоги, травмы (например, перелом кости, кровоизлияние, хирургическое вмешательство) и иммунную реакцию на ксенотрансплантацию. Эти, обычно выделяемые имунные компоненты, по меньшей мере в части патологий этих состояний позволяют эффективно применять единичный агент для лечения состояний или для лечения одного или больше симптомов, связанных с недостаточной иммунной реакцией Тh1 или избыточной Th2 реакцией. Во всех этих состояниях, в которых присутствуют недостаточная реакция Тh1 или нежелательная реакция Th2, улучшение (облегчение) одного или более симптомов, связанных с этим состоянием, достигается назначением эффективного количества соединения формулы 1 в соответствии с описанными здесь способами.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение(я) формулы 1 могут напрямую и/или опосредованно воздействовать на репликацию, развитие или передачу от клетки к клетке патогенов, таких как вирус или паразит (малярия). Улучшение клинического состояния субъекта может происходить в результате прямого воздействия на инфицирующий агент или на злокачественную клетку. Вмешательство в клеточную репликацию может происходить в результате ингибирования одного или более ферментов, которые паразит или инфицированная клетка используют для нормальной репликации или метаболизма, например глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы, которая воздействует на производство клеткой НАДФ (см. Raineri et al., Biochemistry 1970 9:2233-2243). Это воздействие может благоприятствовать цитостатическому действию, которое могут иметь некоторые соединения формулы 1. Модуляции экспрессии или активности клеточных энзимов также могут воздействовать на репликацию или развитие патогена, например, HIV или малярийного паразита или на репликацию или развитие клеток неопласта, например, на подавление ангиогенеза. Улучшения клинического состояния также в основном происходят в результате усиления иммунологической реакции Th1.
В других применениях вариантами реализации изобретения являются способы, предусматривающие контакт соединения(ний) формулы 1 с клеткой(ками), в которых соединение(я) формулы 1 образуют комплекс с рецептором стероидного гормона или приводит к изменениям его биологической активности. Рецептором стероидного гормона может быть рецептор an orphan nuclear гормона, который проявляет среднее или высокое сродство к связыванию соединения(ний) формулы 1. В некоторых вариантах реализации изобретения стероидный рецептор является известным стероидным рецептором. Биологические эффекты от взаимодействий соединения формулы 1 и рецептора могут привести к нарушениям репликации или развития патогена или самой клетки(ток). Например, может быть изменена экспрессия HIV транскриптов в HIV инфицированных клетках. Комплекс соединения формулы 1 и рецептора может напрямую нарушать LTR зависимую транскрипцию генов HIV, что приводит к сниженной репликации вируса.
Варианты реализации изобретения включают частично очищенные или очищенные комплексы, содержащие соединение формулы 1 и рецептор стероидного гормона. Такой стероидный рецептор(ры) может быть an orphan стероидным рецептором или определенным стероидным рецептором, в котором любой из них связывает соединение формулы 1 со средним или высоким сродством к связыванию, например, менее примерно 0,5-10×10-6 М, обычно менее примерно 1×10-7 М, или, для взаимодействий высокого сродства, менее чем около 0,01-10×10-9 М. Соединение(я) формулы 1 также могут усиливать иммунные реакции таким образом, что оба типа иммунной реакции и измененные условия внутри клетки существуют сосуществуют одновременно для улучшения одного или более из описанных здесь паталогических состояний.
Соединения формулы 1 можно использовать для идентификации рецепторов, которые изменяют биологические реакции, например рецепторов, которые участвуют в эффективном усилении Th1 синтеза цитокина. Варианты реализации изобретения включают способ «Способ 1», который позволяет определять один или более эффектов тестируемого соединения на стероидный рецептор в различных биологических системах. В основном тестируемым соединением является соединение формулы 1. Такие системы включают клетки, содержащие конструкции ДНК, которые значительно или под воздействием индукции экспрессируют интересующий нас стероидный рецептор(ы), например, SXR, CARβ, RXR, PXR, PPARα или их смеси и димеры, например, SXR/RXR. В других биологических системах стероидный рецептор может находиться под транскрипционным контролем регулируемого промоутера. Альтернативно экспрессия другого гена, такого как стимулируемый стероидом ген, например, стимулируемый стероидом цитохром Р-450. Для данного способа источник стероидных рецепторов обычно соединен со средством их мониторинга, например, посредством измерения транскрипции гена, регулируемого рецептором. Клетки, которые содержат стероидный рецептор и факультатиивные средства мониторинга иногда здесь называют «биологической системой». Источники стероидных рецепторов включают линии клеток и популяции клеток, которые в норме экспрессируют интересующий нас стероидный рецептор и экстракты, полученные из таких клеток. Другим источником полезной для целей данного способа биологической системы являются экспрессирующие рецептор ткани экспериментальных животных.
В одном аспекте способ 1 позволяет определять один или более эффектов соединения формулы 1 на стероидный рецептор с применением способов, которые включают (а) предоставление биологической системы, например экстракта клеток, клеток или тканей, содержащих клетки, имеющие множество стероидных рецепторов, которые содержат мономеры, гомодимеры или гетеродимеры, которые содержат стероидный рецептор, например SXR, CAR-β, RXR, PPARα, PXR, или димеры которые содержат один или более такового, (б) активацию или ингибирование множества мономеров, гомодимеров или гетеродимеров, которые содержат стероидный рецептор путем приведения клетки в контакт с агонистом или антагонистом стероидного рецептора (например, SXR, CAR-β, RXR, PPARα или PXR), (в) удаление из клетки большей части всех агонистов или антагонистов стероидного рецептора, (г) определение активности множества мономеров, гомодимеров, или гетеродимеров, которые содержат стероидный рецептор, когда он находится в активированном состоянии в отсутствие агонистов или антагонистов, (д) экспозиция клеток с тестируемым соединением, (е) определение по меньшей мере одного эффекта тестируемого соединения на активность множества мономеров, гомодимеров или гетеродимеров, которые содержат один или более из стероидных рецепторов в то время, пока они остаются в значительной мере свободны от агонистов или антагонистов и (ж) факультативно классифицируют тестируемое соединение как агонист или антагонист стероидного рецептора, либо как нейтральное соединение, имеющее незначительный или неопределяемый эффект.
Эффекты, которые можно измерять способом 1, включают определение или измерение воздействия на ген, экспрессия которого находится под влиянием стероидного рецептора. Геном может представлять собой ген, связанный с патологическим состоянием, такой как инфицирующий агент, иммунное нарушение или состояние гиперпролиферации.
Так, другой аспект способа 1 «способ 1А» определяет, может ли химическое вещество, ранее неизвестное как модулятор биосинтеза протеинов, транскрипционально изменять экспрессию гена, который кодирует протеин, связанный с поддержанием или лечением одного или более симптомов патологического состояния. Этот способ включает: (а) приведение в контакт образца, который содержит эукариотические клетки, с соединением формулы 1, при этом эукариотические клетки содержат множество белков стероидного рецептора, а конструкцией ДНК, содержащей в 5'-3' порядке (1) модулируемую транскрипционную регуляторную последовательность гена, кодирующего интересующий нас протеин, (2) промоутер гена, кодирующего интересующий нас протеин и (3) ген репортер, который экспрессирует полипептид, способный подавать обнаруживаемый сигнал, связанный с и находящийся под контролем промоутера, в условиях, где химическое вещество, если оно способно быть модулятором транскрипции гена, кодирующего интересующий нас ген, вызывает подачу измеряемого или детектируемого сигнала, подаваемого полипептидом, экспрессируемым геном репортером, (б) количественное определение количества подаваемого таким способом сигнала и (в) факультативно, проведение сравнения определенного таким образом количества с количеством поданного сигнала в отсутствие любого тестируемого химического вещества или при приведении образца в контакт с другим химическим веществом, с тем, чтобы идентифицировать химическое вещество как вещество, которое вызывает изменения детектируемого сигнала, подаваемого полипептидом, и определение того, модулирует ли химическое вещество специфически транскрипционно экспрессию гена, связанного с поддержанием или лечением одного или более симптомов патологического состояния.
При осуществлении способа 1А, как правило, образец, который содержит предварительно определенное количество идентичных или по существу идентичных эукариотических клеток, приводят в контакт с предварительно определенной концентрацией соединения формулы 1. Эукариотические клетки содержат конструкции ДНК, которые изготовлены при помощи обычных способов молекулярной биологии и прописей. Как правило, конструкции ДНК содержат в 5'-3' порядке (1) транскрипционную регуляторную последовательность, которая участвует в модуляции экспрессии гена, связанного с поддержанием или лечением патологического состояния, (2) генный промоутер и (3) ген репортер, который экспрессирует полипептид, способный подавать заметный сигнал, при этом полипетид связан с промоутером и находится под его контролем. Конструкция используется в таких условиях, в которых соединение формулы 1, если оно способно действовать как транскрипционный модулятор гена, кодирующего интересующий нас протеин, вызывает подачу полипептидом, экспрессируемым геном репортером, измеряемого или детектируемого сигнала. Через промежуток времени, достаточный для генерации заметного ответа или сигнала, можно оценивать поданный сигнал количественно. Обычно ответ или сигнал оценивают количественно, но и качественные измерения могут быть полезны для целей экспресс-скрининга.
В способе 1А можно также факультативно сравнивать детектируемый сигнал со значением произведенного сигнала, который (1) наблюдается в отсутствие любых соединений формулы 1, или (2) при приведении образца в контакт с другими химическими веществами, что позволяет идентифицировать соединение формулы 1 как химическое вещество, вызывающее изменения детектируемого сигнала, подаваемого полипептидом. Как правило, в таком случае определяют, модулирует ли транскрипционно специфично соединение формулы 1 экспрессию гена, связанного с поддержанием или лечением одного или более симптомов патологического состояния.
Другие аспекты способа 1 и 1А включают способы отбора, включающие приведение в контакт по отдельности каждого из множества идентичных, в значительной степени идентичных или различных образцов, где каждый образец содержит предварительно определенное количество клеток, с предварительно определенной концентрацией каждого подлежащего тестированию соединения формулы 1 в отдельности, например, когда множество образцов содержит более чем примерно 1×103 или более чем примерно 1×104 образцов или около 0,5-5×105 образцов. В других аспектах можно определять количество РНК при помощи количественной полимеразно-цепьевой реакции. По любому из способов 1 или 1А можно использовать такое любое соединение формулы 1, которое описано или названо здесь.
Аспекты изобретения включают другой способ, «способ 2», который нацелен на идентификацию гена, экспрессия которого модулируется кандидатом партнера для связывания для агентов терапии инфекционных заболеваний. Обычно партнер для связывания является стероидным рецептором, например, мономером, гомодимером или гетеродимером, который содержит SXR, CAR-β, PXR, PPARα или RXR или гомологи или изоформы таковых. Стероидный рецептор обычно представляет собой комплекс, который содержит, например, соединение формулы 1 и регулируемую генную DNARS, которую стероидный рецептор или комплекс, который включает стероидный рецептор, распознает и к которой специфически крепится. Такие комплексы также могут содержать фактор транскрипции, который крепится к стероидному рецептору или к последовательности нуклеиновых кислот, примыкающих или расположенных вблизи DNARS. Примерные образцы факторов транскрипции, которые могут присутствовать, включают один или более ARA54, ARA55, ARA70, SRC-1, NF-κВ, NFAT, API, Ets, р300, СВР, р300/СВР, р300/СРВ-ассоциированных факторов, SWI/SNF и их гомологи человека SWI/SNF, СВР, SF-1, RIP140, GRIP1 и Vpr. В общем, получают первую и вторую группу клеток in vitro или in vivo и приводят первую группу клеток в контакт с терапевтическим агентом инфекционного заболевания, а вторую группу клеток не приводят в контакт in vitro или in vivo с терапевтическим агентом инфекционного заболевания. Выделение РНК из клеток или получение происходящих от РНК кДНК проводят по обычным методикам. Анализ РНК или происходящих от РНК кДНК из первой и второй группы клеток показывает разницу между ними, что может быть использовано для идентификации гена, регуляцию которого модулировали вариантом партнера связывания для терапевтического агена инфекционного заболевания или любой DNARS, связанной с этим геном.
Аспект способа 2 включает определение способности соединения формулы 1 модулировать или принимать участие в модуляции транскрипции гена, связанного с поддержанием или лечением одного или более симптомов патологического состояния. Как правило, ожидают, что соединения формулы 1 будут вызывать усиление транскрипции таких генов. Патологическим состоянием обычно является состояние, связанное с инфицирующим агентом, например вирусом, паразитом или бактерией, но оно также может включать иммунное состояние, например аутоиммунное состояние или иммунную недостаточность. Патологическое состояние также может быть недостаточной иммунной реакцией на инфекцию или недостаточной реакцией на состояние гиперпролиферации или злокачественное состояние. Другие патологические состояния, к которым можно применять способ, включают воспалительные состояния.
В некоторых аспектах соединения формулы 1, использованные в способе 2, будут маркированы. Такие соединения готовят обычными способами, используя стандартные метки, такие как радиометки, флюоресцентные метки или другие метки, как это описано здесь и в цитируемых источниках.
Вариант реализации способа 2 включает анализ РНК или происходящей от нее кДНК методом субтрактной (вычитательной) гибридизации. В данном варианте реализации изобретения РНК или кДНК, полученные от первой и второй группы клеток, гибридизируют и удаляют получающиеся пары. Это позволяет выделить нуклеиновые кислоты, которые кодируют гены, репликация которых модулируется кандидатом партнера для спаривания, которым обычно является стероидный рецептор. Можно использовать и обычные способы для размножения и получения нуклеиновых кислот и информации о протеиновых последовательностях от нуклеиновых кислот, выделенных данным способом. Последовательности нуклеиновых кислот, которые транскрипционно возбуждаются или подавляются соединением формулы 1, являются кандидатами партнеров для спаривания.
Количество транскрипционно возбужденного гена(ов) будет увеличено в группе клеток 1, обработанной соединением формулы 1, тогда как любой подавленный ген(ы) будет обеднен или будет отсутствовать. В данных вариантах реализации изобретения РНК, выделенную после удаления пар, обычно размножают по стандартным RT-PCR или PCR прописям. В этих прописях обычно используют особые наборы случайно выбранных пар праймеров, вслед за чем проводят анализ размноженных аминокислот гелевым электрофорезом. Аминокислоты, возбужденные соединением формулы 1, проявятся как полоса(сы), обычно спаренных ДНК, которые отсутствуют в контроле или во втором наборе клеток. Аминокислоты, транскрипционно подавленные партнером связывания соединения формулы 1, в первой группе клеток будут обеднены или отсутствовать. После того, как такие варианты гена будут идентифицированы, их можно клонировать и экспрессировать, а способность DNARS, связанной с геном, к образованию комплекса, который включает кандидата партнера для спаривания и помеченное обычным способом соединение формулы 1, анализируют обычными способами, например равновесным диализом, аффинной хроматографией с применением, например, иммобилизованной на колонке DNARS, или соосаждением комплексов, которые содержат маркированные обычным способом DNARS и варианты кандидатов для спаривания, с использованием антител к несвязывающимся партнерам. Анализ последовательностей аминокислот обычно используют для идентификации областей, прилегающих к кодирующим областям регулируемого гена, для идентификации любых связанных с геном DNARS. Идентичность DNARS можно установить спариванием комплексов DNARS, которые содержат кандидат партнера для спаривания, например, стероидный рецептор и факультативно также содержат соединение формулы 1. Местоположение и идентификацию DNARS можно определять по отпечаткам ДНК или другими способами определения связующих взаимодействий. В этих вариантах способа 2 можно маркировать DNARS, рецептор или соединение формулы 1.
В целом, вторая группа клеток будет идентична, или по существу идентична, первой группе клеток. В вариантах реализации изобретения (для обоих способов 1 и 2), в которых клетки «по существу идентичны», первая и вторая группа клеток могут отличаться друг от друга присутствием или отсутствием конструкции(ций) ДНК, которая экспрессирует (1) стероидный рецептор и/или (2) легко идентифицируемый протеин, например β-галактозидазу, пероксидазу, фосфатазу или хлорамфеникол ацетилтрансферазу, регуляция транскрипции которых обычно модулируется стероидным рецептором. В этих вариантах реализации изобретения разница между первой и второй группой клеток используется для облегчения анализа биологического действия соединения формулы 1 и партнера связывания стероидного рецептора. Группы клеток считают «идентичными», если они не проявляют известные или очевидные морфологические или генетические различия.
Обычно вторая группа клеток служит контролем и, таким образом, их не подвергают воздействию ни одного из соединений формулы 1 перед получением РНК или кДНК. Но в некоторых вариантах реализации изобретения можно подвергать вторую группу клеток воздействию известного агониста или антагониста партнера для спаривания стеродного рецептора. Это позволяет сравнить силу соединения формулы 1 с силой агониста или антагониста.
В других вариантах реализации изобретения можно модифицировать способ 2 путем задействования третьей группы клеток, которая факультативно используется в качестве интактного контроля в том случае, когда вторая группа клеток подвергается воздействию агониста или антагониста стероидного рецептора. В этих вариантах реализации изобретения обычно сравнивают воздействие соединения формулы 1 и агониста или антагониста экспрессии гена или конструкции ДНК. Конструкция ДНК должна содержать промоутер или другую регуляторную последовательность, которая подвергается обычно увеличивающей транскрипцию транскрипционной модуляции, соединением формулы 1, с участием ее партнера для спаривания.
Образцами стероидных рецепторов млекопитающих и других стероидных рецепторов, включая orphan стероидный рецептор, их гомологи, изоформы и ко-факторы (например, ко-репрессоры, факторы транскрипции, области генных промоутеров, или последовательности), которые могут включать данные комплексы, являются стероидогенный фактор-1 (SF-1), фактор, противодействующий промоутерной транскрипции альбумина яйца цыпленка (COUP-TFI), и его гомологи у млекопитающих, заглушающий медиатор рецепторов ретиноидного и тироидного гормонов (SMRT) и их гомологи у млекопитающих, NF-E3, COUP-TFII и их гомологи у млекопитающих, тестикулярный orphan рецептор TR2, тироидный гормон α1 (TR α1), ретиоид Х рецептор α, гетеродимер TRα1/RXRα, элемент прямого повтора-4 гормонального ответа (DR4-TRE), рецептор эстрогена (ER), рецептор эстрогена родственный α (ERRα), рецептор эстрогена родственный β (ERRβ), стероидный ксенобиотический рецептор (SXR), нуклеарный фактор гепатоцитов 4 (HNF-4), нуклеарный фактор гепатоцитов 3 (HNF-3), Х рецепторы печени (LXRs), LXRα, рецептор эстрогена α (ERα), основной - β рецептор андростана (CAR-β), RXR/CAR-β гетеродимер, партнер короткого гетеродимера (SHP), SHP/ERβ гетеродимер, рецептор эстрогена β, гетеродимер SHP/Er β тестикулярный orphan рецептор TR4, TR2/TR4 гетеродимер, pregnane Х рецептор (PXR) и его изоформы, область генного промоутера цитохром Р-450 монооксигеназы 3А4 и его изоформы, область генного промоутера HNF-4/цитохром Р-450 монооксигеназны 3А4 и его изоформный комплекс, HIV-1 длинный конечный повтор (LTR), HIV-2 LTR, TR2/HIV-1 LTR комплекс, TR4/HIV-1 LTR комплекс, TR α1/TR4/HIV-1 LTR комплекс, изоформы TR2 (TR2-5, TR7, TR9, TR11), DAX-1, DAX-1/стероидогенная область промоутера гена острого регуляторного протеина, RevErb, Rev-erbA α, Rev-erb β, коактиватор стероидного рецептора, амплифицированный при раке молочной железы (AIB 1), р300/CREB связывающий протеин-взаимодействующий протеин (р/CIP), рецептор тироидного гормона (TR, T3R), элементы тироидной гормональной реакции (T3REs), основной рецептор андростана (CAR), Xenopus xSRC-3 и его гомологи у млекопитающих (человека), комплексы ТАК1, ТАК1/рецептора пероксисомного пролиферативно-активируемого α (PPARα), PPARα/RXRα комплекс, ТАК-1/RIP-140 комплекс, рецептор ретиноиковой кислоты (RAR), RARβ, TR4/RXRE комплекс, район гена промоутера SF-1/стероидной гидроксилазы, район гена промоутера SF-1/окситоцина, район гена промоутера SF-1/ACTH рецептора, крысиный Ear-2 и его гомологи у млекопитающих, orphan рецептор человека TR3, RLD-1, OR-1, рецептор андрогена, глюкокортикоидный рецептор, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, минералкортикоидный рецептор, OR1, OR1/RXRα комплекс, TIF-1, СВР/Р300 комплекс, TRIP1/SUG-1 комплекс, RIP-140, SRC1α/P160 комплекс, и TIF-2/GRIP-1 комплекс, RAR/N-CoR/RIP13 комплекс, RAR/SMRT/TRAC-2 комплекс, и ДНК DNARS 5' AGGTCANAGGTCA 3' или 5' TGCACGTCA 3'. Один из этих комплексов может быть включен в способы изобретения, в том случае, когда, например, их применяют в бесклеточных анализах. Образование этих комплексов в клетках усиливают введением в клетку конструкции(й) ДНК, которые экспрессируют один или более из этих белков, например, клетки млекопитающих или дрожжей, содержащие стабильную конструкцию ДНК или конструкцию, которую использовали для экспресс-анализов трансфекции (переноса генов). Способы проведения анализов или получение биологической реакции in vitro или in vivo с применением соединений формулы 1 в качестве агонистов, антагонистов или в качестве контрольного образца точно такие же, как описаны, см. например, патенты США 5080139, 5696133, 5932431, 5932555, 5935968, 5945279, 5945404, 5945410, 5945412, 5945448, 5952319, 5952371, 5955632, 5958710, 5958892, 5962443; международные публикации WO 96/19458, WO 99/41257, WO 99/45930. Комплексы или аналитические системы, которые включают соединение формулы 1 и которые использованы при осуществлении этих способов, здесь включены в качестве аспектов изобретения.
Для того, чтобы вызвать биологическую реакцию, соединения формулы 1 обычно взаимодействуют с одним или более биологическими лигандами. Для ускорения идентификации возможных партнеров для связывания с соединениями формулы 1 можно использовать радиоактивно меченое соединение формулы 1, которое связано с носителем, обычно твердым носителем, как средством для выделения возможного партнера для связывания. Соединение формулы 1 может быть связано с носителем через, например, 3-, 7-, 16- или 17- позицию стероидного ядра. Линкерные агенты для такого применения известны и включают гомобифункциональные и гетеробифункциональные агенты, многие из которых есть в продаже. Используемые линкеры обычно содержат около 2-20 линкерных атомов. Линкерные атомы это, в основном, атомы углерода, с одним, двуми или тремя атомами кислорода, атомами серы или азота, которые замещают один или более атомов углерода. Как источник вариантов (поиска) партнеров для спаривания, можно использовать библиотеку экспрессии кДНК, приготовленную из подходящих клеток или тканей. Клетки или ткани можно получать от млекопитающего или позвоночного - "хозяина", например человека, мыши, птицы, примата, или из других источников, например от насекомых (например, Drosophila), других беспозвоночных (например, дрожжей, бактерий, Mycoplasma sp., Plasmodium sp., Tetrahymena sp., C. elegans) или других групп видов, перечисленных здесь или в цитируемых ссылках. Подходящие ткани включают кожу, клетки или ткани печени, включая гепатоциты и клетки Куфера, фиброциты, моноциты, дендритные клетки, клетки и ткани почек, мозга или другие клетки или ткани центральной нервной системы, включая нейроны, астроциты и глиальные клетки, ткани периферической нервной системы, ткани или клетки легких, желудочно-кишечного тракта, плаценты, молочной железы, яичников, яичек, мышц, включая сердечную или миоциты, белые кровяные клетки, включая Т клетки, В клетки, клетки и ткани костного мозга, ткани или жидкости лимфатической системы и хондроциты.
Обычно кандидат партнера для связывания, выделенный из источника, отличного от человека, будет иметь человеческий гомолог, который имеет сходные характеристики сродства к соединению формулы 1. Кандидат партнера для связывания, выделенный из источника, отличного от человека, таким образом, может быть использован для ускорения выявления гомолога человека, например, с применением антисыворотки для осаждения человеческого гомолога из раствора, который содержит человеческий гомолог, или путем сравнения последовательностей нечеловеческого возможного партнера для связывания с известными человеческими генными последовательностями. После того, как найден источник кандидатов партнеров для связывания, его можно привести в контакт с меченым соединением формулы 1, обычно меченым радиоактивным изотопом, например 14С или 3H, и затем комплексы, которые включают меченое соединение формулы 1 и возможный партнер для связывания, выделяют, например, с применением аффинной хроматографии или способов осаждения антителами. Выделенные комплексы представляют собой источник, по меньшей мере, частично очищенного возможного партера для связывания то есть возможный партнер для связывания будет обогащен, например, по меньшей мере, в 10 раз, или, по меньшей мере, в 100 раз, или, по меньшей мере, в 500 раз, по сравнению с начальным материалом возможного партнера для связывания.
Аспекты изобретения включают композицию, включающую частично очищенный (очищение, по меньшей мере, от примерно двукратного до примерно 10-кратного относительно природного источника, например, клеток или лизированных клеток) комплекс, или очищенный (очищение примерно от 20- до около 5000-кратного относительно природного источника, например, клеток или лизированных клеток) комплекс (где частично очищенный или очищенный комплекс факультативно выделен), содержащий соединение формулы 1 и стероидный рецептор, сывороточный, связанный со стероидом белок (например, человеческий сывороточный глобулин, α1-кислотный гликопротеин, связанный с половым гормоном глобулин, связанный с тестостероном глобулин, связанный с кортикостероидом глобулин, связанный с андрогеном глобулин (крыса)) или другой партнер для связывания, например фактор транскрипции или DNARS. Аспект данных композиций включает продукт, получаемый в результате процесса приведения в контакт частично очищенного или очищенного композиции с одной или более клетками, одной или более тканями, плазмой или кровью.
Другие аспекты изобретения включают способ определения биологической активности соединения формулы 1, включая (а) приведение соединения(ний) формулы 1 в контакт с клеткой или популяцией клеток, (б) измерение одного или более из следующего: (1) (образования) комплекса между партнером для связывания и соединением формулы 1, (2) пролиферации клетки или популяции клеток, (3) дифференциации клетки или популяции клеток, (4) активности протеинкиназы С, (5) уровня фосфориляции протеин киназы С, (6) транскрипции одного или более генов мишеней, (7) ингибирование клеточного ответа на стероиды, например глюкокортикоиды, половые стероиды или (8) ингибирование HIV LTR-зависимой транскрипции и (9) факультативно сравнивая результаты, полученные на стадии (б) с подходящим контролем. Аспекты данного варианта реализации изобретения включают (1) способ, в котором партнер для связывания представляет собой стероидный рецептор, фактор транскрипции или DNARS, (2) способ, в котором измеряемое биологическое воздействие - это модулирующее воздействие соединения формулы 1 на репликацию или цитопатические эффекты, связанные с ретровирусом, вирусом гепатита или паразитом из протозоа, (3) способ в котором измеряемое биологической воздействие - это модулирующее воздействие соединения формулы 1 на репликацию, цитопатические эффекты, связанные с ретровирусом, вирусом гепатита или паразитом из протозоа, или определяемое биологическое воздействие это метаболизм (анализ с поглощением 3H-тимидина или другие анализы, как описано здесь или в ссылках) клеток или популяций клеток включая NK клетки, фагоциты, моноциты, макрофаги, базофилы, эозинофилы, дендритные клетки, синовиоциты, микроглиальные клетки, фиброциты, трансформированные (неопластические) клетки, инфицированные вирусом клетки, инфицированные бактериями клетки, или инфицированные паразитами клетки и (4) способ, в котором геном мишенью является ген вируса, ген бактерии, ген паразита, ген, ассоциированный с раком, например, в которм ген вируса это ген ДНК или РНК полимеразы, ген реверсивной транскриптазы, конвертируемый ген, ген протеазы или ген, ассоциированный с репликацией вирусной нуклеиновой кислоты или вирусный структуральный ген.
Вариантом реализации изобретения является способ, включающий приведение в контакт комплекса, который содержит стероидный рецептор и соединение формулы 1, с трансактиваторным протеином, при этом комплекс содержит протеин стероидного рецептора, соединение формулы 1 и формы трансактиваторного протеина, в котором трансактиваторный протеин находится в (1) экстракте клеток или тканей (например, лизате, содержащем ядра, или лизате без ядер из клетки(ток) или ткани(ней), (2) частично очищенном или очищенном экстракте клеток или экстракте ткани, (3) клетке(ках) в культуре тканей или (4) клетке(ках) в субъекте, в котором любой из п.(1)-(4) факультативно включает ген мишень (природный или интродуцированный при помощи стандартных методик генных манипуляций ген), уровень экспрессии которого факультативно анализируется после образования комплекса. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения трансактиваторный протеин частично очищен или очищен и находится в экстракте клетки или ткани или очищенном или частично очищенном экстракте клеток или тканей. Трансактиваторный протеин может быть TIF-1, СВР/Р300, TRIP1/SUG-1, RIP-140, SRC1α/P160 или TIF-2/GRIP-1. В любом из данных вариантов реализации изобретения комплекс, включающий протеин стероидного рецептора, соединение формулы 1 и трансактиваторный протеин, может увеличивать или снижать транскрипцию гена мишени по сравнению с подходящим контролем (например, контроль при тех же условиях, но в отсутствие любых добавленных соединений, которые соответствуют соединению формулы 1, или в котором есть другое соединение (например, стероид, про который известно, что он связывается со стероидным рецептором) и используется как эталон или относительный стандарт, относительно которого оценивается изменение экспрессия гена мишени). В этих способах геном-мишенью может быть патогенный ген (например, вирус, бактерия, паразит, грибки, дрожжи) или ген, ассоциированный с паталогическим состоянием (аутоиммунность, воспаление, гиперпролиферация).
Соединения формулы 1 подходят для применения в некоторых из описанных здесь способах, в которых для модуляции биологической активности в клетках или тканях используют стероиды. Например, соединение(я) формулы 1 можно использовать для селективного взаимодействия со специфическим стероидным рецептором или стероидным orphan рецептором или с их подтипами, ассоциированными с паталогическим состоянием(ями) у субъекта, точно так, как это описано в патенте США 5668175. В данных областях применения соединение формулы 1 может действовать в качестве лианда для рецептора с тем, чтобы модулировать абнормальную экспрессию генного продукта(тов), которые коррелируют с паталогическим состоянием (полученное в качестве отклика на стероидный гормон болезненное состояние). В норме такие гены регулируются стероидными гормонами. В других вариантах реализации изобретения можно использовать соединения фоормулы 1 для поиска лигандов, которые крепятся к стероидному рецептору или стероидному orphan рецептору и к одному или более факторам (или кофакторам) транскрипции, таким как АР-1 и/или с последовательностью(тями) ДНК, тем же способом, как это описано в патенте США 5643720. Аналогично соединения формулы 1 можно использовать, по существу как это описано в патентах США 5597693, 5639598, 5780220, 5863733 и 5869337. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения, для облегчения их применения, соединение(я) формулы 1 маркированы. Подходящие метки известны специалистам и включают метки радиоизотопами (например, 3Н, 14С, 32Р, 35S, 131I, 99Tc и другими изотопами галогенов), флуоресцентные группировки (например, флюоресцин, резофурин, Техасский Красный, родамин, BODIPY, арилсульфонат цианина), хемолюминисцентные группировки (например, эфиры акридиниума), хелаты металлов, биотин, авадин, пептидные метки (например, гексамер гистидина, пептид, распознаваемый моноклональными или поликлональными антителами), ковалентные сшивающие группировки. Приготовление меченых соединений проводят в соответствии с известными способами.
Способы, подходящие для измерения биологического действия различных соединений, например, активации, на клетках иммунной системы (например, NK клетках, фагоцитах, моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, дендритных клетках, синовиоцитах, микроглиальных клетках, фиброцитах) были описаны ранее, например, Jakob et al., J. Immunol. 1998 161:3042-3049, Pierson et al., Blood 1996 87:180-189, Cash et al., Clin. Exp.Immunol. 1994 98:313-318, Monick et al., J. Immunol. 1999 162:3005-3012, Rosen et al., Infect. Immun. 1999 67:1180-1186, Grunfeld et al., J. Lipid Res. 1999 40:245-252, Singh et al., Immunol. Cell Biol. 1998 76:513-519, Chesney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 94:6307-6312, Verhasselt et al., J. Immunol. 1999 162:2569-2574, Avice et al., J. Immunol. 1999 162:2748-2753, Cella et al., J. Exp. Med. 1999 189:821-829, Rutalt et al., Free Radical Biol. Med. 1999 26:232-238, Akbari et al., J. Exp. Med. 1999 189:169-178, Hryhorenko et al., Immunopharmacology 1998 40:231-240, Femvik et al., Inflamm. Res. 1999 48:28-35, Cooper et al., J. Infect. Dis. 1999 179:738-742, Betsuyaku et al., J. Clin. Invest. 1999 103:825-832, Brown et al., Toxicol. Sci. 1998 46:308-316, Sibelius et al., Infect. Immunol. 1999 67:1125-1130. Применение в данных способах соединений формулы 1 является аспектами изобретения, и они позволяют, например, измерять биологическое действие соединений формулы 1 на гены, экспрессия которых регулируется соединением формулы 1 и стероидным рецептором.
Варианты реализации изобретения включают любые способы, описанные выше, например способ 1, в котором клетки или биологические системы содержат NK клетки, фагоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, дендритные клетки, синовиоциты, микроглиальные клетки, глиальные клекти, фиброциты или гепатоциты, которые факультативно содержат конструкции ДНК, экспрессирующие один или два клонированных стероидных рецептора. Способ факультативно анализирует воздействие соединения формулы 1 на клетки по сравнению с контролем. Контроль включает применение известного агониста или антагониста стероидного рецептора или сравнение клеток, обработанных соединением формулы 1, с контрольными клетками (обычно того же клеточного типа, что и обрабатываемые клетки), которые не были обработаны соединением формулы 1. Реакцию, например активацию стероидного рецептора, можно измерять известными способами по сравнению с контролем.
Соединение формулы 1 в некоторых случаях будет модулировать (увеличивать или уменьшать) транскрипцию одного или более генов в клетках. В других случаях соединение формулы 1 будет усиливать движение лизосом в одной или более клетках субъекта - NK клетках, фагоцитах, моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, дендритных клетках, синовиоцитах, макроглиальных клетках или фиброцитах. Подобные воздействия обычно передаются напрямую или опосредованно через рецепторы стероидных гормонов, действие которых модулирует транскрипцию гена, например, вызывает усиление активности протеинкиназы С (РКС) в клетках, использованных для анализа, например, РКСα, РКСβ, РКСγ или РКСζ.
Другие родственные варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие частично очищенный или очищенный комплекс, включающий соединение формулы 1 и стероидный рецептор, сывороточный стероидсвязывающий протеин (например, альбумин сыворотки крови человека, α1-кислотный гликопротеин, связывающий половой гормон глобулин, андроген связывающий протеин (крысы) или другой партнер для связывания, например, фактор транскрипции DNARS. Аспект данных комозиций включает продукт, получаемый в процессе приведения частично очищенной или очищенной композиции в контакт с одной или более клетками, одной или более тканями, плазмой или кровью.
Другой вариант реализации изобретения включает способ определения биологической активности соединения формулы 1, включающий (а) приведение соединеия(ний) формулы 1 в контакт с клеткой или популяцией клеток, (б) измерение (1) одного или более компексов, образующихся между партнером для связывания и соединением формулы 1, (2) пролиферации клетки или популяции клеток, (3) дифференциации клетки или популяции клеток, (4) активности протеинканазы С, (5) уровня форфориляции субстрата протеинканазы С, (6) транскрипции одного или более генов-мишеней, (7) ингибирования клеточной реакции на стероиды, например глюкокортикоиды, (8) ингибирования стероид-зависимой транскрипции, например, глюкокортикоидов, половых стероидов, или (9) ингибирования HIV LTR-вызываемой транскрипции и (в) факультативно сравнивая результаты, полученные на стадии (б) с подходящим контролем. Аспекты данного варианта реализации изобретения включают (1) способ, в котором партнер для связывания является стероидным рецептором, транскрипционный фактор - DNARS, (2) способ, в котором биологическую активность измеряют по модулирующему действию соединения формулы 1 на репликацию или цитопатические эффекты, связанные с ретровирусом, вирусом гепатита или паразитом из протозоа, (3) способ, в котором биологическую активность определяют по модулирующему действию соединения формулы 1 на репликацию, цитопатические эффекты связанные с ретровирусом, вирусом гепатита или паразитом протозоа или определяемой биологической активностью является метаболизм (анализы с поглощением 3H-тимидина или другие анализы, описанные здесь, или на которые даны ссылки) клеток или популяций клеток, включающих NK клетки, фагоциты, моноциты, макрофаги, базофилы, эозинофилы, дендритные клетки, синовиоциты, микроглиальные клетки, фиброциты, трансформированные (неопластические) клетки, инфицированные вирусом клетки, инфицированные бактериями клетки или инфицированные паразитами клетки, и (4) способ, в котором геном-мишенью явяляется ген вируса, ген бактерии, ген паразита, ген, ассоциированный с раком, например, в котором ген вируса является геном полимеразы ДНК или РНК, геном реверсивной транскриптазы, конвертируемым геном, геном протеазы, или геном, ассоциированным с репликацией вирусной нуклеиновой кислоты или вирусным структуральным геном.
Другой вариант реализации изобретения представляет собой способ, включающий приведение комплексов, которые содержат стероидный рецептор и соединение формулы 1, в контакт с трансактиваторным протеином, при этом комплекс содержит протеин стероидного рецептора, соединение формулы 1 и формы трансактиваторного протеина, причем трансактиваторный протеин является (1) экстрактом клетки или ткани (например, ядра, лизата, содержащего ядра, или лизата, не содержащего ядра из клетки(ток) или ткани(ней), (2) частично очищенным или очищенным экстрактом клетки или ткани, (3) клеткой(ками) в культуре тканей, (4) клеткой(ками) в субъекте, в которых любой из п.(1)-(4) факультативно включает ген-мишень (природный ген или ген, интродуцированный при помощи методик стандарных манипуляций с генами), уровень экспрессии которого факультативно анализируют после образования комплекса. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения трансактиваторный протеин является частично очищенным или очищенным и находится в экстракте клетки или ткани или частично очищенном или очищенном экстракте клетки или ткани. Трансактиваторный протеин может быть TIF-1, СВР/Р300, TRIP1/SUG-1, RIP-140, SRC1α/P160 или TIF-2/GRIP-1. В любом из этих вариантов реализации изобретения комплекс, включающий протеин стероидного рецептора, соединение формулы 1 и трансактиваторный протеин, может повышать или снижать транскрипцию гена мишени по сравнению с подходящим контролем (например, контроль в тех же условиях, но без добавления какого либо соединения, которое может соответствовать соединению формулы 1, или в котором другое соединение (например, стероид, с известной способностью крепиться к стероидному рецептору) используется как эталон, в отношение которого определяют изменение экспрессии гена мишени). В этих способах геном-мишенью может быть патогенный ген (например, вирус, бактерия, паразит, грибок, дрожжи) или ген, ассоциированный с паталогическим состоянием (аутоиммунность, воспаление, гиперпролиферация).
Как ожидается, биологические реакции, наблюдаемые при проведении описанных здесь способов, обычно включают образование комплексов, которые содержат два или более компонента. Такие компоненты могут включать один или более факторов транскрипции или ко-регуляторов или ко-репрессоров транскрипции и их гомологи и изоформы. Эти факторы и содержащие их комплексы включают представителей семейства коактиваторов стероидного рецептора (SRC-1, SRC-1/фактор плазменной реакции), NF-κВ, NFAT, р300, СВР, р300/СВР, р300/СРВ-ассоциированный фактор, SWI/SNF и его человеческий и другие гомологи, BRG-1, ОСТ-1/OAF, AP1, Ets, протеин, ассоциированный с рецептором андрогена 54 (ARA54), протеин, ассоциированный с рецептором андрогена 55 (ARA55), протеин, ассоциированный с рецептором андрогена 70 (ARA70), RAC3/ACTR, CREB-связывающий протеин (СРВ), SRC-1α, взаимодействующий с рецептором протеин-140 (RIP-140), активирующий транскрипционный фактор протеин-1, результат активации-2, глюкокортикоидный, взаимодействующий с рецептором протеин-1 (GRIP-1), взаимодействующий с рецептором протеин-160 (RIP-160), суппрессор повреждений gal4D (SUG-1), фактор промежуточной транскрипции-1 (TIF-1), фактор промежуточной транскрипции-2 (TIF-2), SMRT, N-CoR, N-CoA-1, p/CIP, строидогенный фактор-1 (SF-1), p65 (RelA), и Vpr, кодируемый вирусом иммунодефицита человека, и его изоформы и гомологи. Один или более из этих факторов могут быть представлены в комплексах, включающих соединение формулы 1 и стероидный рецептор, такой как SXR, PPARα, CAR-β, RXR и/или PXR.
В родственных вариантах реализации изобретения соединение формулы 1 используют для того, чтобы оказать цитостатическое действие на клетки млекопитающих in vitro. Обычно такие клетки являются лимфоидными клетками, например, популяции Т клеток из, например, крови или органов, богатых лимфоидными клетками (например, селезенки, лимфатических тканей или узлов), или трансформированные линии Т клеток. Такие действия позволяют определять потенциальную способность соединений формулы 1 медиировать иммунологические реакции, такие как усиление иммунной реакции Th1 или подавление одного или более Тh2-ассоциированных цитокинов. Таким образом, способ изобретения включает (а) приведение соединения формулы 1 и лимфоидной клетки в контакт in vitro, (б) определение степени цитостаза, который вызывает соединение, с тем, чтобы идентифицировать цитостатическое соединение, и (в) факультативное назначение цитостатического соединения субъекту с подавленным иммунитетом для определения воздействия соединения на одну или более иммунных реакций субъекта, как это здесь описано, например, усиления цитокина или клеточной реакции Th1 или снижения экспрессии цитокина, ассоциированного с Th2. Обычно такие способы осуществляют, используя набор концентраций соединения формулы 1 и соответствующий контроль, такой как известный цитостатический агент или холостой опыт, который содержит раствор, в отсутствие соединения формулы 1. Подавление пролиферации клеток измеряют стандартными способами. Способы измерения цитостатических воздействий соединений включают подсчет числа живых клеток в обработанной и необработанной культурах или путем определения синтеза ДНК, при помощи, например, 3H-тимидина, встроенного в ДНК обработанных и необработанных культур. Обычный набор концентраций формулы 1 в среде для выращивания клеток приблизительно составляет от примерно 0,1 μМ до примерно 100 μМ, с применением 4-6 различных концентраций соединений и фиксированное количество клеток (например, от примерно 0,4×10 до примерно 5×10). Соединение формулы 1 оставляют в контакте с клетками в культуре тканей на достаточное для наблюдения цитостаза время, например от примерно 16 часов до примерно 6 дней, обычно на 24-72 часа. В данных вариантах реализации изобретения следует факультативно следить за изменениями биологической активности стероидного рецептора, например, активацией PPARα, которая может быть ассоциирована с вызываемым соединением цитостазом.
Оказалось, что в некоторых областях применения изобретения соединение(я) формулы 1 приводит к улучшению одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией или состоянием. Например, лечение субъекта с подавленным иммунитетом, например, в результате ретровирусной инфекции, хемотерапии рака или других причин, в основном показывает улучшения одного или нескольких ассоциированых симптомов, таких как потеря веса, лихорадка, анемия, утомляемость, или уменьшает симптомы инфекции, которые связаны с вторичной инфекцией(ями), например HSV-1, HSV-2, папиллома, цитомегаловирус человека ("CMV"), инфекции Pneumocystis (например Р. carinii) или Candida (С. albicans, С. krusei, С. tropicalis). Соединения формулы 1 также полезны для ускорения восстановления иммунной системы в условиях аутологического трансплантанта костного мозга или трансплантанта стволовых клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначают в качестве жидкого неводного состава, как это описано здесь, или соединение(я) формулы 1 назначают в соответствии с любой прописью прерывистого дозирования описанными здесь с применением твердого или жидкого состава(ов). В случае, если субъект имеет ретровирусную инфекцию с симптомами, включающими один или более из (симптомов) относительно низкие значения CD4 (например, примерно 10-200, обычно примерно 20-100), одну или более дополнительную патогенную инфекцию (HSV-1, HSV-2, HHV-6, HHV-8, CMV, HCV, HPV, инфекцию Р. carinii или Candida) и одно или более из нижеперечисленного: анемии, утомляемости, саркомы Капоши, лихорадки или потери веса (по меньшей мере до 5% от веса тела), назначение субъекту 5 мг/кг/день соединения(ний) формулы 1 обычно приводит к заметному улучшению одного или более симптомов в течение 1-4 недель. В других вариантах реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначают субъекту, который находится в состоянии, которое, очевидно, имеет связь с вирусной инфекцией, например, пневмония или ретинит, связанные с CMV, назофарингиальная карцинома или волосистая оральная лейкоплакия, связанная с вирусом Эпштейна-Барра, прогрессирующий панцефалит, или диабет, связанный с вирусом Рибелла или апластический кризис при гемолитической анамии, связанный с паровирусом 19.
В одном из примеров реализации изобретения пациенту-человеку, инфицированному HCV, дозировали водный изотонический α-циклодекстрин или β-циклодекстриновый состав, содержащий примерно 20 мг/мл BrEA. Состав назначали внутривенно в однократной дозе или двух поддозах ежедневно. Пациенту дозировали от 1 дл 10 мг/кг/день в течение от 4 до 10 дней, за чем следовало от 5 до 30 дней без дозировки, затем следовала дозировка циклогекстриновым составом в течение от 4 до 10 дней. Протокол дозирования повторяют один, два или более раз. Во время лечения следят за клиническими маркерами на HCV инфекцию, например за вирусной нуклеиновой кислотой в крови или плазме, уровнями почечных энзимов в крови или плазме (например, AST/SGOT, ALT/SGPT, кислой фосфотазой). Для таких пациентов факультативно проводят стандартное анти-HCV лечение(я) в соответствии с рекомендациями лечащего врача и с полученным информированным согласием пациента. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначается ежедневно постоянно как часть оральной или парентеральной композиции или состава, например, для соединения(ний) формулы 1, которое является новым per se. Также факультативно назначают систематическое применение BrEA, например состав примера 1 для приема по 1-5 мг/кг/день ежедневно в течение примерно от 1 до 4 месяцев, или оральный состав для приема примерно 5-40 мг/кг/день ежедневно в течение от 1 до 4 месяцев.
В любом из вариантов реализации изобретения, раскрытых здесь, можно факультативно назначать дополнительное терапевтическое лечение одновременно с, то есть до, во время или после назначения субъекту(там) соединения(ний) формулы 1. Например, субъектам, которые имеют вирусную или паразитарную инфекцию и принимают курс соединения формулы 1, можно назначать другие курсы лечения, например, нуклеозидными аналогами в случае вирусных инфекций или хлорохинином в случае малярии. Такие добавочные курсы лечения обычно будут включать стандартное лечение паталогического состояния(ний) субъекта, но они также могут включать экспериментальные или другие способы лечения. Например, можно совместно назначать витамины (мультивитамины, отдельные витамины), антиоксиданты или другие агенты (витамин Е, аллопуринол), пищевые длбавки (жидкий протеин или углеводородные препараты) или другие способы лечения, какие позволяет медицинское состояние пациента и рекомендует лечащий врач пациента. Любой из этих дополнительных способов лечения может быть соединен с назначением любого из соединений формулы 1, например, BrEA, эфира, карбамата, карбоната или аминокислоты или пептидного конъюгата, из любого из описанных здесь вариантов реализации изобретения.
Такие дополнительные способы лечения очевидны для специалистов. Такие способы лечения подбирают на основании состояния(ний), которые подлежат лечению, взаимодействия ингредиентов и фармакологических свойств их комбинаций. Например, при лечении ретровирусной инфекции у человека или другого субъекта соединения формулы 1 соединяют с одним или более ингибитором реверсивной транскриптазы, ингибиторами протеаз, антибиотиками или анальгетиками. Подходящие соединения формулы 1 включают соединения, описанные, например, в соединениях групп с 1 по 42-25-20-6 и другие описанные здесь соединения. Примерами ингибиторов реверсивной трансферазы являются AZT, 3ТС, D4T, ddI, ddC, адефовил дипивоксил, 9-[2-(R)-[[бис[[(изопропоксикарбонил)окси]метокси]фосфиноил]метокси]пропил]аденин, (R)-9-[2-(фосфонометокси)пропил]аденин и адефовир. Примерами ингибиторов протеазы являются индинавир, нелфинавир, ритонавир, криксиван и секванавир. Также можно использовать ингибиторы слияния, например ингибиторы слияния HIV. При лечении вирусной инфекции респираторной системы или других систем, например вируса гепатита С (HCV) или гриппозной вирусной инфекции (например грипп А или В), композиции изобретения факультативно применяют совместно с антивирусными препаратами (такими как γ-интерферон, амантадин, римантадин, рибаварин или соединениями, раскрытыми в патентах США 5763483 (в особенности соединения, цитируемые в пунктах 1 и 2) и 5866601), миколитиками, экспекторантами, бронходиляторами, антибиотиками, антипиретиками или анальгетиками.
В некоторых вариантах реализации изобретения соединение(я) формулы 1 назначаются субъектам, имеющим паразитарную или бактериальную инфекцию, для замедления прогрессирования инфекции, нарушения репликации или развития агента инфекции или для улучшения одного или более связанных с инфекцией симптомов, например, потери веса, анемии или вторичных инфекций. Паразитами в контексте будут малярийные паразиты, паразиты сонной болезни и паразиты, связанные с гастроинтеральными инфекциями. Паразиты и бактерии включают виды, группы, генотипы, линии или изоляты желудочно-кишечных гельминтов, микроспоридии, изоспоры, криптоспоридии (Cryptosporidium parvum), Mycobacterium (M. avium, M. bovis, М. leprae, M. tuberculosis, M. pneumoniae. M. penetrans), Mycoplasma (M. fermentans, M. penetrans, M. pneumoniae), Trypanosoma (T. brucei, T. gambiense, T. cruzi, T. evansi), Leishmania (L. donovani, L. major, L. braziliensis), Plasmodium (P. falciparum, P. knowlesi, P. vivax, P. berghei), Ehrlichia (E. canis, E. chaffeensis, E. phagocytophila, E. equi, E. sennetsu), Babesia microti, Haemophilus (H. somnus, H. influenzae), Brucella (B. militensis, B. abortus), Bartonella (B. henselae), Bordetella (B. bronchiseptica, B. pertussis), Escherichia (E. coli), Salmonella (S. typhimurium), Shigella (S. flexneri), Pseudomonas (P. aeruginosa), Neisseria (N. gonorrhoeae, N. meningitidis), Streptococcus, Staphylococcus (S. aureus), Rickettsia (R. rickettsii), Yersinia (Y. enterocolitica), Legionella pneumonia und Listeria (L. monocytogenes).
Один или более протоколов прерывистого дозирования согласно изобретению или один или более из жидких неводных составов, описанных здесь, могут быть применены после проведения обычных экспериментов по любому описанному здесь использованию или применению.
Для соединения(ний) формулы 1, которые являются новыми per se, соединение(я) могут быть назначены субъекту в соответствии с протоколом(ами) прерывистого дозирования согласно изобретению или согласно другим методикам, например, путем непрерывного ежедневного введения единичной дозы или двух или более поддоз в течение дня. Дополнительно любое соединение формулы 1, например, одно или более соединений формулы 1, которые являются новыми per se, может быть представлено в любом описанном здесь твердом или жидком виде. Такие составы и методики дозирования могут быть применены при помощи проведения обычных экспериментов к любому из описанных здесь применений.
Перечисление вариантов реализации изобретения. Некоторые аспекты изобретения и родственные им вопросы включают следующие перечисленные варианты реализации.
В некоторых аспектах изобретение относиться к жидким неводным составам, которые содержат соединение формулы 1. Ниже следуют примерные варанты реализации.
1. Композиция, включающая одно или более соединений формулы 1 или формулы 2 и один или более неводных жидких эксципиентов, при этом композиция содержит менее чем примерно 3% об./об. воды.
2. Композиция по варианту реализации изобретения 1, в которой одно или более из соединений формулы 1 имеет структуру
в которой R7 и R9 независимо являются -CHR10-, -СН2-, -СН=, -О-, -S- или -NH-, тогда как R10 является -ОН, -SH, С1-10 возможно замещенным алкилом, С1-10 возможно замещенным алкоксилом, C1-10 возможно замещенным алкенилом и R8 является -СН2-, -O-, -S- или -NH-, в котором атомы водорода в положениях 5 (если присутствует), 8, 9 и 14 соответственно являются α.α.α.α (т.е., 5α, 8α, 9α, 14α), α.α.α.β, α.α.β.α, α.β.α.α, β.α.α.α, α.α.β.β, α.β.α.β, β.α.α.β, β.α.β.α, β.β.α.α, α.β.β.α, α.β.β.β, β.α.β.β, β.β.α.β, β.β.β.α или β.β.β.β, обычно α.α.β.α или β.α.β.α.
3. Соединение по 2 варианту реализации изобретения, в котором одно или более соединений формулы 1 имеет структуру
в котором атомы водорода в положениях 5 (если присутствует), 8, 9 и 14 соответственно являются α.α.α.α, α.α.α.β, α.α.β.α, α.β.α.α, β.α.α.α, α.α.β.β, α.β.α.β, β.α.α.β, β.α.β.α, β.β.α.α, α.β.β.α, α.β.β.β, β.α.β.β, β.β.α.β, β.β.β.α обычно α.α.β.α или β.α.β.α.
4. Композиция по 1, 2 или 3 варианту реализации изобретения, в которой присутствует одно, два или три соединения формулы 1.
5. Композиция по 1, 2, 3 или 4 варианту реализации изобретения, в которой композиция содержит менее чем 0,3% об./об. воды.
6. Композиция по 1, 2, 3, 4 или 5 варианту реализации изобретения, в которой один или более жидкий неводный эксципиент является одно, дву- или многоатомным спиртом, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или бензилбензоатом.
7. Композиция по любому из вариантов реализации изобретения с 1 по 6 (варианты реализации изобретения 1, 2, 3, 4, 5 или 6), в которой соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7α-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7α,17β-тригидрокси-5-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5-андростен, 16β-бром-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бром-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бром-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бром-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бром-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он, 3β,7α-дигидроксиэпиандростерон, 3β,7β-дигидроксиэпиандостерон, 3β-гидрокси-7-оксоэпиандростерон.
8. Композиция по 7 варианту реализации изобретения, в которой соединение формулы 1 является 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-оном.
9. Композиция по любому варианту реализации изобретения с 1 по 8, в которой композиция включает два, три, четыре или пять неводных жидких эксципиентов.
10. Композиция по 9 варианту реализации изобретения, в которой композиция включает три или более жидких неводных эксципиента.
11. Композиция по любому из вариантов реализации изобретения с 1 по 10, в которой соединение формулы 1 составляет около 0,0001-99% м/об композиции.
12. Композиция по любому из вариантов реализации изобретения с 1 по 11, в которой композиция любого варианта реализации изобретения содержит однократную дозу.
13. Композиция по 12 варианту изобретения, в которой однократная доза содержит около 0,5-100 мг/мл соединения формулы 1.
14. Композиция по 10 варианту изобретения, в которой композиция содержит около 1,0-60 мг/мл соединения формулы 1.
15. Композиция по 14 варианту изобретения, в которой соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он или 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он.
16. Композиция по 1 варианту реализации изобретения, в которой один или более жидких неводных эксципиентов содержит полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и бензилбензоат.
17. Композиция по 16 варианту реализации изобретения, в которой композиция включает менее примерно 0,03% об/об воды.
18. Композиция по 17 варианту реализации изобретения, в которой соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он или 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он.
19. Композиция по 18 варианту реализации изобретения, в которой соединение формулы 1 является 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-оном.
20. Композиция по 16 варианту реализации изобретения, которая в дальнейшем включает спирт.
21. Композиция по 20 варианту реализации изобретения, в которой соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он или 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он.
22. Композиция по 1 варианту реализации изобретения, в которой один или более жидкий эксципиент включает бензилбензоат, полиэтиленгликоль, спирт и возможно дополнительный жидкий неводный эксципиент.
23. Композиция по 22 варианту реализации изобретения, в которой композиция содержит менее примерно 0,3% об/об воды.
24. Композиция по 22 или 23 варианту реализации изобретения, в которой соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он или 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он.
25. Композиция по 24 варианту реализации изобретения, в которой соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он.
26. Композиция по 22, 23, 24 или 25 варианту реализации изобретения, в которой полиэтиленгликоль является полиэтиленгликолем 300 и/или полиэтил енгликолем 200.
27. Композиция по 26 варианту реализации изобретения, в которой спиртом является полиэтиленгликоль, который является полиэтиленгликолем 300.
28. Композиция по 22 или 23 варианту реализации изобретения, которая включает около 2,5-25% об/об этанола, около 1-10% об/об бензилбензоата, около 10-35% об/об полиэтиленгликоля 300, около 40-65% об/об пропиленгликоля и около 2-60 мг/мл 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростана-17-она.
28А. Композиция по 22, 23, 24, 25 или 26 варианту реализации изобретения, которая включает около 0,1-10% об/об бензилбензоата, около 0,1-10% об/об бензилового спирта, около 1-95% об/об полиэтиленгликоля 200, около 1-95% об/об пропиленгликоля и около 2-60 мг/мл 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она.
29. Композиция по 28 варианту реализации изобретения, которая содержит около 12,5% об/об этанола, около 5% об/об бензилбензоата, около 25% об/об полиэтиленгликоля 300, около 57,5% об/об пропиленгликоля и около 50 мг/мл 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она.
30. Композиция по любому из вариантов реализации изобретения с 1 по 29, которая дополнительно включает местный анестетик.
31. Композиция по 30 варианту реализации изобретения, в которой местный анестетик является прокаином, бензокаином или лидокаином.
32. Композиция по любому из вариантов реализации изобретения с 1 по 31, в которой композиция включает раствор, суспензию, коллоидный раствор, гель или их сочетания.
33. Продукт, полученный способом, в котором композицию, содержащую одно или более соединений формулы 1 и первый жидкий неводный эксципиент, приводят в контакт со вторым жидким неводным эксципиентом, в котором продукт содержит менее примерно 3% воды и солей, его аналогов, структурных изомеров и таутомеров.
34. Продукт по 33 варианту реализации изобретения, в котором продукт содержит менее чем примерно 0,3% воды.
35. Продукт по 33 или 34 варианту реализации изобретения, в котором первый неводный жидкий эксципиент является полиэтиленгликолем (например, ПЭГ300 или ПЭГ200) или пропиленгликолем.
36. Продукт по 33, 34 или 35 варианту реализации изобретения, в котором второй жидкий неводный эксципиент является полиэтиленгликолем (например, ПЭГ300 или ПЭГ200) или пропиленгликолем.
38. Продукт, полученный способом, в котором композицию, содержащую одно или более соединений формулы 1 и два жидких неводных эксципиента, приводят в контакт с третьим жидким неводным эксципиентом, при этом продукт содержит менее чем примерно 3% воды и солей, его аналогов, структурных изомеров и таутомеров.
39. Продукт по 38 варианту реализации изобретения, в котором продукт содержит менее чем примерно 0,3% воды.
40. Продукт по 38 или 39 варианту реализации изобретения, в котором два жидких неводных эксципиента выбраны из полиэтиленгликоля (например, ПЭГ300 или ПЭГ200), пропиленгликоля, бензилбензоата и спирта (например, этанола).
41. Продукт по 38, 39 или 40 варианту реализации изобретения в котором эксципиент является полиэтиленгликолем (например, ПЭГ300 или ПЭГ200), пропиленгликолем, бензинбензоатом или спиртом (например, этанолом).
42. Продукт, полученный способом, в котором композицию, содержащую одно или более соединений формулы 1 и три жидких неводных эксципиента, приводят в контакт с четвертым жидким неводным эксципиентом, при этом продукт содержит менее чем около 3% воды и солей, его аналогов, структурных изомеров и таутомеров.
43. Продукт по 42 варианту реализации изобретения, в котором продукт содержит менее чем примерно 0,3% воды.
44. Продукт по 42 или 43 варианту реализации изобретения, в котором три неводных жидких эксципиента выбирают из полиэтиленгликоля (например, ПЭГ300 или ПЭГ200), пропиленгликоля, бензинбензоата или спирта (например, этанола).
45. Продукт по 42, 43 или 44 варианту реализации изобретения, в котором четвертый неводный жидкий эксципиент является полиэтиленгликолем (например, ПЭГ300 или ПЭГ200), полипропиленгликолем, бензилбензоатом или спиртом (например, этанолом).
46. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 45, в котором продукт хранят при пониженных температурах (примерно от 4°С до примерно 8°С) или при комнатной температуре от примерно 30 минут до примерно 2 лет.
47. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 46, в котором одно или более соединений формулы 1 включает 1, 2, 3 или 4 соединения формулы 1.
48. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 36, в котором одно или более соединений формулы 1 включает одно соединение формулы 1.
49. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 48, в котором одно или несколько соединений формулы 1 выбирают из следующих соединений: 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он и 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он.
50. Продукт по 49 варианту реализации изобретения, в котором соединение формулы 1 является 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-оном.
51. Продукт по 49 варианту реализации изобретения, который содержит около 2,5-25% об/об этанола, около 1-10% об/об бензилбензоата, примерно 10-35% об/об полиэтиленгликоля 300, примерно 40-65% об/об пропиленгликоля и примерно 2-60 мг/мл 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она.
52. Продукт по 51 варианту реализации изобретения, который содержит примерно 12,5% об/об этанола, примерно 5% об/об бензилбензоата, примерно 25% об/об полиэтиленгликоля 300, примерно 57,5% об/об пропиленгликоля и примерно 50 мг/мл 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она.
53. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 52, который в дальнейшем включает местный анестетик.
54. Композиция по 52 варианту реализации изобретения, в которой местный анестетик является прокаином, бензокаином или лидокаином.
55. Продукт, полученный способом, в котором композицию, содержащую соединение формулы 1, приводят в контакт с жидким неводным эксципиентом, при этом продукт содержит менее 3% об/об воды и солей, его аналогов, структурных изомеров и таутомеров.
56. Продукт по 55 варианту реализации изобретения в, котором продукт содержит менее чем около 0,3% об/об воды.
57. Продукт по 53 варианту реализации изобретения, в котором продукт хранят при пониженных температурах (от около 4°С до около 8°С) или при комнатной температуре в течение от примерно 1 часа до примерно 2 лет.
58. Продукт по 53 варианту реализации изобретения, в котором первый жидкий неводный эксципиент явяляется полиэтиленгликолем, спиртом, пропиленгликолем или бензилбензоатом.
59. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 58, в котором соединение формулы 1 содержит от примерно 0,01% до примерно 99% м/об продукта.
60. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 59, в котором продукт представлен однократной дозой.
61. Дозированный продукт по варианту реализации изобретения 60, включающий раствор, содержащий около 0,5-70 мг/мл одного или более соединений формулы 1.
62. Продукты по любому варианту реализации изобретения с 55 по 61, в котором одно или более соединений формулы 1 выбирают из 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-она, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростена, 16α-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростана, 16α-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростена, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростана, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростана, 16β-бромо-3β, 17β-дигидрокси-5α-андростена, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростана, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-она, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-она и 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-она.
63. Продукт по 62 варианту реализации изобретения, в котором соединение формулы 1 представляет собой 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он.
64. Продукт по любому из вариантов реализации изобретения с 33 по 61, в котором одно или более соединение формулы 1 выбирают из соединений или одного или более видов соединений внутри семейства, названного в группах соединений от 1 до 21-10-6.
65. Способ, включающий назначение композиции или продукта по любому из вариантов реализации изобретения с 1 по 64 субъекту, страдающему от патогенной инфекции или злокачественной опухоли или подавленного иммунитета или состояния дисрегуляции, например подавленной иммунной реакции Th1 или нежелательной иммунной реакции Th2.
66. Способ по 65 варианту реализации изобретения, в котором патогенной инфекцией является ДНК вирусная инфекция или РНК вирусная инфекция.
67. Способ по 66 варианту реализации изобретения, в котором РНК вирусная инфекция является ретровирусной инфекцией или инфекцией вируса гепатита.
68. Способ по 65 варианту реализации изобретения, в котором ретровирусная инфекция или инфекция вируса гепатита является HIV, FIV, SIV, SHIV или инфекцией вируса гепатита С.
69. Способ по 69 варианту реализации изобретения, в котором патогенная инфекция является внутриклеточной паразитарной инфекцией.
70. Способ по 69 варианту реализации изобретения, в котором внутриклеточная паразитарная инфекция является малярийной инфекцией.
71. Способ по 65 варианту реализации изобретения, в котором соединение формулы 1 имеет строение
в которой один, два или три R7, R8 и R9 являются -СН2- или -CH= и в котором конфигурация атомов α.α.α.α, α.α.α.β, α.α.β.α, α.β.α.α, β.α.α.α, α.α.β.β, α.β.α.β, β.α.α.β, β.α.β.α, β.β.α.α, α.β.β.α, α.β.β.β, β.α.β.β, β.β.α.β, β.β.β.α или β.β.β.β, обычно α.α.β.α или β.α.β.α.
72. Способ по 71 варианту реализации изобретения, в котором соединение формулы 1 имеет структуру
73. Способ по 72 варианту реализации изобретения, в котором R1, R2 и R4 независимо являются -ОН, а С2-С20 эфиром или С1-С20 алкокси, R3 является -Н и два или три из R7, R8 и R9 являются -СН2-.
74. Способ по 72 или 73 варианту реализации изобретения, в котором соединение формулы 1 имеет структуру
75. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 71 по 74, в котором конфигурация атомов водорода в положениях 5 (если присутствует), 8, 9 и 14 соответственно являются α.α.β.α или β.α.β.α.
В других вариантах реализации изобретения, соединения формулы 1 включают новые соединения, некоторые из которых описаны в нижеследующих перечисленных вариантах реализации изобретения.
1А. Соединения формулы 1, имеющие структуру
в котором R7, R8 и R9 выбраны независимо и в котором один, два или три из R7, R8 и R9 не являются -СН2- или -CH=, и в котором атомы водорода в положениях 5 (если присутствует), 8, 9 и 14 соответственно находятся в конфигурациях α.α.α.α, α.α.α.β, α.α.β.α, α.β.α.α, β.α.α.α, α.α.β.β, α.β.α.β, β.α.α.β, β.α.β.α, β.β.α.α, α.β.β.α, α.β.β.β, β.α.β.β, β.β.α.β, β.β.β.α или β.β.β.β, обычно α.α.β.α или β.α.β.α.
2А. Соединение по варианту реализации изобретения 1А, в котором R8 является -СН2-, -О-, -S- или -NH-.
3А. Соединение по варианту реализации изобретения 1А или 2А, в котором R7 является -CH2-CHR10-, -O-CHR10- или -О-С(О)-.
4А. Соединение по варианту реализации изобретения 1А, 2А или 3А, в котором отсутствуют R8 или R9.
5А. Соединение по варианту реализации изобретения 1А или 2А. в котором R7 или R9 независимо являются -CHR10, -СН2-, -СН=, -О-, -S- или -NH-, тогда как R10 является -ОН, -SH, C1-30 органическим остатком, C1-30 эфиром, C1-10 возможно замещенным алкилом, C1-10 возможно замещенным алкоксилом, C1-10 возможно замещенным алкенилом или C1-10 возможно замещенным алкинилом.
6А. Соединение по варианту реализации изобретения 1А, 2А, 3А, 4А или 5А, в котором соединение формулы 1 имеет строение
в котором атомы водорода в положениях 5 (если присутствует), 8, 9 и 14 соответственно находятся в конфигурациях α.α.α.α, α.α.α.β, α.α.β.α, α.β.α.α, β.α.α.α, α.α.β.β, α.β.α.β, β.α.α.β, β.α.β.α, β.β.α.α, α.β.β.α, α.β.β.β, β.α.β.β, β.β.α.β, β.β.β.α или β.β.β.β обычно α.α.β.α или β.α.β.α.
7А. Соединение по варианту реализации изобретения 6А, в котором R4 является -ОН, =О, -SH, C1-30 эфиром или C1-30 алкоксилом, в котором эфир или алкокси остаток возможно замещен на один, два или более независимо выбранных заместителей, которые возможно выбирают из -F, -Cl, -Br, -I, -О-, =O, -S-, -NH-, -ORPR, -SRPR или -NHRPR.
8А. Соединение по варианту реализации изобретения 6А или 7А, в котором R1 является -ОН, =O, -SH, C1-30 эфиром или C1-30 алкокси, в котором эфир или алкокси остаток возможно замещают на один, два или более независимо выбранных заместителя, которые возможно выбирают из -F, -Cl, -Br, -I, -О-, =O, -S-, -NH-, -ORPR, -SRPR или -NHRPR.
9А. Соединение по варианту реализации изобретения 1А, 2А или 3А, в котором соединение формулы 1 имеет строение
в котором атомы водорода в положениях 5 (если присутствует), 8, 9 и 14 соответственно являются α.α.α.α, α.α.α.β, α.α.β.α, α.β.α.α, β.α.α.α, α.α.β.β, α.β.α.β, β.α.α.β, β.α.β.α, β.β.α.α, α.β.β.α, α.β.β.β, β.α.β.β, β.β.α.β, β.β.β.α или β.β.β.β, обычно α.α.β.α или β.α.β.α.
10А. Соединение по варианту реализации изобретения 9А, в котором R4 является -ОН, =O, -SH, C1-30 эфиром или C1-30 алкокси, в котором эфир или алкоксиостаток возможно замещают на один, два или более независимо выбранных заместителей, которые возможно выбирают из -F, -Cl, -Br, -I, -О-, =O, -S-, -NH-, -ORPR, -SRPR или -NHRPR.
11А. Соединение по варианту реализации изобретения 9А или 10А, в котором R1 является -ОН, =O, -SH, C1-30 эфиром или C1-30 алкоксилом, в котором эфир или алкоксиостаток возможно замещают на один, два или более независимо выбранных заместителей, которые возможно выбирают из -F, -Cl, -Br, -I, -О-, =O, -S-, -NH-, -ORPR, -SRPR или -NHRPR.
12А. Композиция, включающая соединение по любому из вариантов реализации изобретения с 1А по 11А, и эксципиент, подходящий для фармакологического использования на человеке или для ветеринарного применения, например эксципиент, раскрытый здесь или в цитируемых источниках.
13А. Продукт, полученный в процессе приведения соединения по любому из вариантов реализации изобретения с 1А по 11А в контакт с эксципиентом, подходящим для фармакологического использования на человеке или для использования в ветеринарии, например эксципиент, раскрытый здесь или в цитируемых источниках.
14А. Применение соединения, композиции или продукта по любому из вариантов реализации изобретения с 1А по 13А для получения лекарственного препарата для использования для предотвращения или лечения или улучшения одного или более симптомов, связанных с инфекцией, состоянием подавленного иммунитета, злокачественной опухолью, состоянием перед образованием злокачественной опухоли или для модулирования иммунных реакций млекопитающего, а именно усиление реакции Тh1 или снижение иммунной реакции Th2, например, инфекции, злокачественной опухоли, или нарушения иммунитета, как это описано здесь или в цитируемых ссылках.
15А. Применение по варианту реализации изобретения 14А, в котором инфекцией является вирусная инфекция (например, HIV, HCV, вирус герпеса, тогавирус, вирусная инфекция папилломы человека или другие вирусы, описанные здесь или в цитируемых ссылках), бактериальной инфекцией (например, Borrelia sp., Legionella sp. или другие бактерии, описанные здесь или в цитируемых ссылках), грибковая или дрожжевая инфекция (например, Candida sp., Aspergillus sp. или другие дрожжи, описанные здесь или в цитируемых ссылках), или паразитарной инфекцией (например, малярийный паразит, гастроинтерстециальная нематода, гельминт, Candida sp., Aspergillus sp.или другие паразиты, описанные здесь или в цитируемых ссылках).
16А. Соединение, композиция, продукт или применение по любому из вариантов реализации изобретения с 1А по 15А, в котором соединение формулы 1 является соединением, названным в любой группе соединений с 1 по 42-25-10-6, или соединение формулы 1 является членом любого семейства в любой из групп соединений с 1 по 42-25-10-6.
В других аспектах изобретение предлагает способы дозировок, подходящие для лечения описанных здесь состояний. Следующие варианты реализации изобретения описывают некоторые из этих способов.
1В. Способ, включающий прерывистое назначение субъекту одного или нескольких соединений формулы 1 (или композиции, содержащей соединение формулы 1) или введение в ткани субъекта соединения(ний) формулы 1 (или композиции, содержащей соединение формулы 1), например, любого соединения формулы 1, названного или описанного здесь, включая соединения, описанные выше в пп.1-64 и 1А-11А.
2В. Способ по варианту реализации изобретения 1 В, в котором у субъекта имеется инфекция, гиперпролиферационное нарушение, состояние гиперпролиферации, состояние иммунодепрессии, нежелательная иммунная реакция или в котором субъект недавно перенес, или вскоре перенесет травму, хирургическую операцию или терапевтическое лечение, в котором терапевтическое лечение другое, нежели по способу п.1В.
3В. Способ по варианту реализации изобретения 2В, в котором иммуноподавленное состояние или нежелательная иммунная реакция связаны с вирусной инфекцией, внутриклеточной бактериальной инфекцией, внеклеточной бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, дрожжевой инфекцией, внеклеточной паразитарной инфекцией, внутриклеточной паразитарной инфекцией, протозойной паразитарной инфекцией, многоклеточным паразитом, аутоиммунным заболеванием, раком, предраковым состоянием, химиотерапией, радиационной терапией, иммуноподавляющей терапией, терапией с антиинфекционными агентами, раной, ожогом, присутствием иммуноподавляющей молекулы, желудочно-кишечным раздражением или любым сочетанием вышеперечисленного.
4В. Способ по варианту реализации изобретения 3В, в котором улучшают иммуноподавленное состояние субъекта или снижают нежелательную иммунную реакцию субъекта (например, иммунная реакция Тh2) или в котором усиливают иммунную реакцию Тh1 субъекта.
5В. Способ по варианту реализации изобретения 3В, в котором повышают врожденный иммунитет, специфический иммунитет субъекта или оба эти фактора.
6В. Способ по варианту реализации изобретения 5В, в котором повышают врожденный иммунитет субъекта.
7В. Способ по варианту реализации изобретения 6В, в котором повышают специфический иммунитет субъекта, например, в котором снижают Th2 иммунную реакцию субъекта или в котором усиливают Тh1 иммунную реакцию субъекта.
8В. Способ по варианту реализации изобретения 2В, в котором одно или более соединений формулы 1 назначают в соответствии с протоколом дозирования, включающим следующие шаги:
(a) прием субъектом одного или более соединений формулы 1 по меньшей мере один раз в день по меньшей мере в течение 2 дней;
(b) отсутствие приема субъектом одного или более из соединений формулы 1 в течение по меньшей мере 1 дня;
(c) прием субъектом одного или более соединений формулы 1 по меньшей мере один раз в день в течение по меньшей мере 2 дней и
(d) возможно, по меньшей мере однократное повторение шагов (а), (b) и (с).
9В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором шаг (с) включает такой же протокол дозировок, как и шаг (а).
10В. Способ по варианту реализации изобретения 9В, в котором шаг (а) протокола дозирования включает прием одного или более соединений формулы 1 один раз в день, два раза в день, три раза в день, или четыре раза в день.
11В. Способ по варианту реализации изобретения 10В. в котором шаг (а) протокола дозирования включает прием одного или более соединений формулы 1 один раз в день или два раза в день.
12В. Способ по варианту реализации изобретения 10В, в котором шаг (а) протокола дозировок включает прием одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 3 дней до примерно 24 дней.
13В. Способ по варианту реализации изобретения 12В, в котором шаг (а) протокола дозирования включает прием одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 4 дней до примерно 12 дней.
14В. Способ по варианту реализации изобретения 13В, в котором шаг (а) протокола дозирования включает прием одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 4 дней до примерно 8 дней.
15В. Способ по варианту реализации изобретения 14В, в котором шаг (b) включает прием одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 3 дней до примерно 120 дней.
16В. Способ по варианту реализации изобретения 15В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 4 дней до примерно 60 дней.
17В. Способ по варианту реализации изобретения 16В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 5 дней до примерно 30 дней.
18В. Способ по варианту реализации изобретения 16В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 8 дней до примерно 60 дней.
19В. Способ по варианту реализации изобретения 15В, в котором шаги (а), (b) и (с) повторяют по меньшей мере 4 раза.
20В. Способ по варианту реализации изобретения 15В, в котором шаги (а), (b) и (с) повторяют от примерно 5 раз до примерно 25 раз.
21В. Способ по варианту реализации изобретения 15В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в течение промежутка времени по меньшей мере 2 месяца.
22В. Способ по варианту реализации изобретения 15В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторения шагов (а), (b) и (с) происходит в течение периода времени по меньшей мере 12 месяцев.
23В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или более соединений формулы 1 в течение от примерно 3 до примерно 120 дней.
24В. Способ по варианту реализации изобретения 23В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или более соединений формулы 1 в течение примерно от 4 до примерно 60 дней.
25В. Способ по варианту реализации изобретения 24В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или нескольких соединений формулы 1 в течение от примерно 5 до примерно 30 дней.
26В. Способ по варианту реализации изобретения 23В, в котором шаг (b) включает прекращение приема одного или нескольких соединений формулы 1 в течение от примерно 8 до примерно 60 дней.
27В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором шаг (d) включает повторение шагов (а), (b) и (с) по меньшей мере однократно.
28В. Способ по варианту реализации изобретения 1В, в котором шаги (а), (b) и (с) повторяют от примерно 3 раз до примерно 25 раз.
29В. Способ по варианту реализации изобретения 1В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в времени, по меньшей мере, в 2 месяца.
30В. Способ по варианту реализации изобретения 29В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в промежуток времени, по меньшей мере, в 12 месяцев.
31В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 8В по 30В, в котором состояние подавленного иммунитета или нежелательная иммунная реакция связана с вирусной инфекцией, внутриклеточной бактериальной инфекцией, внеклеточной бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, дрожжевой инфекцией, внеклеточной паразитарной инфекцией, внутриклеточной паразитарной инфекцией, протозойной паразитарной инфекцией, многоклеточным паразитом, аутоиммунным заболеванием, раком, предраковым состоянием, химиотерапией, радиотерапией, иммуноподавляющей терапией или терапией с антиинфекционным агентом, раной, ожогом, присутствием иммуноподавляющей молекулы, желудочно-кишечным раздражением или любыми комбинациями вышеперечисленного.
32В. Способ по варианту реализации изобретения 31В, в котором улучшают иммуноподавленное состояние субъекта или снижают нежелательную иммунологическую реакцию.
33В. Способ по варианту реализации изобретения 32В, в котором повышают врожденный иммунитет субъекта, специфический иммунитет или оба эти фактора.
34В. Способ по варианту реализации изобретения 33В, в котором повышают врожденный иммунитет субъекта.
35В. Способ по варианту реализации изобретения 34В, в котором повышают специфический иммунитет субъекта.
36В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором шаг (с) включает более короткий режим дозирования, чем шаг (а).
37В. Способ по варианту реализации изобретения 36В, в котором шаг (а) включает прием соединения формулы 1 в течение от 7 до примерно 24 дней.
38В. Способ по варианту реализации изобретения 37В, в котором шаг (с) включает прием соединения формулы 1 в течение от 4 до примерно 12 дней.
39В. Способ по варианту реализации изобретения 38В, в котором шаг (b) включает прекращение приема соединения формулы 1 в течение примерно от 3 до примерно 120 дней.
40В. Способ по варианту реализации изобретения 39В, в котором шаг (b) включает прекращение приема соединения формулы 1 в течение от примерно 4 до примерно 60 дней.
41В. Способ по варианту реализации изобретения 40В, в котором шаг (b) включает прекращение приема соединения формулы 1 в течение от примерно 5 до примерно 30 дней.
42В. Способ по варианту реализации изобретения 36В, в котором шаг (d) включает повторение шагов (а), (b) и (с) по меньшей мере один раз.
43В. Способ по варианту реализации изобретения 42В, в котором шаг (d) включает повторение шагов (а), (b) и (с) примерно от 3 до 25 раз.
44В. Способ по варианту реализации изобретения 36В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в промежуток времени по меньшей мере в 2 месяца.
45В. Способ по варианту реализации изобретения 44В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в промежуток времени по меньшей мере в 12 месяцев.
46В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 36В по 45В, в котором иммуноподавленное состояние или нежелательная иммунная реакция связаны с вирусной инфекцией, внутриклеточной бактериальной инфекцией, внеклеточной бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, дрожжевой инфекцией, внеклеточной паразитарной инфекцией, внутриклеточной паразитарной инфекцией, паразитом протозоа, многоклеточным паразитом, аутоиммунным заболеванием, раком, предраковым состоянием, химиотерапией, радиотерапией, иммуноподавляющей терапией или терапией с антиинфекционным агентом, раной, ожогом, присутствием иммуноподавляющей молекулы, желудочно-кишечным раздражением или любыми комбинациями вышеперечисленного.
47В. Способ по варианту реализации изобретения 46В, в котором улучшают иммуноподавленное состояние субъекта или снижают нежелательную иммунную реакцию.
48В. Способ по варианту реализации изобретения 47В, в котором повышают врожденный иммунитет субъекта, специфический иммунитет или они оба.
49В. Способ по варианту реализации изобретения 48В, в котором повышают врожденный иммунитет субъекта.
50В. Способ по варианту реализации изобретения 48В, в котором повышают специфический иммунитет субъекта.
51В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором шаг (с) включает более долгий период дозировки, нежели шаг (а).
52В. Способ по варианту реализации изобретения 51В, в котором шаг (а) включает назначение соединения формулы 1 в течение от 7 до примерно 24 дней.
53В. Способ по варианту реализации изобретения 52В, в котором шаг (с) включает назначение соединения фоормулы 1 в течение примерно от 4 до 12 дней.
54В. Способ по варианту реализации изобретения 53В, в котором шаг (b) включает прекращение приема соединения формулы 1 в течение примерно от 3 до примерно 120 дней.
55В. Способ по варианту реализации изобретения 54В, в котором шаг (b) включает прекращение приема соединения формулы 1 в течение от примерно 4 до примерно 60 дней.
56В. Способ по варианту реализации изобретения 55В, в котором шаг (b) включает прекращение приема соединения формулы 1 в течение от примерно 5 до примерно 30 дней.
57В. Способ по варианту реализации изобретения 51В, в котором шаг (d) включает повторение шагов (а), (b) и (с) по меньшей мере один раз.
58В. Способ по варианту реализации изобретения 57В, в котором шаг (d) включает повторение шагов (а), (b) и (с) от примерно 3 до примерно 25 раз.
59В. Способ по варианту реализации изобретения 51В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в промежуток времени по меньшей мере около 2 месяцев.
60В. Способ по варианту реализации изобретения 59В, в котором шаги (а), (b) и (с) и повторение шагов (а), (b) и (с) происходит в промежуток времени по меньшей мере около 12 месяцев.
61В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 51 В по 60В, в котором состояние с подавленным иммунитетом или нежелательная иммунная реакция связаны с вирусной инфекцией, внутриклеточной бактериальной инфекцией, внеклеточной бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, дрожжевой инфекцией, внеклеточной паразитарной инфекцией, внутриклеточной паразитарной инфекцией, паразитом протозоа, многоклеточным паразитом, аутоиммунным заболеванием, раком, предраковым состоянием, химиотерапией, радиотерапией, иммуноподавляющей терапией или терапией с антиинфекционным агентом, раной, ожогом, присутствием иммуноподавляющей молекулы, желудочно-кишечным раздражением или любыми комбинациями вышеперечисленного.
62В. Способ по варианту реализации изобретения 61В, в котором иммуноподавленное состояние субъекта улучшено или нежелательная иммунная реакция снижена.
63В. Способ по варианту реализации изобретения 62В, в котором врожденный иммунитет или специфический иммунитет субъекта или они оба усилены или иммунная реакция субъекта Тh1 усилена или имунная реакция субъекта Th2 снижена.
64В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором вариации шагов (а), (b) и (с) включают проведение первого протокола доз шагов (а), (b) и (с) однократно, дважды или трижды, за чем следует один или более вторичных протоколов дозировок с шагами (а'), (b') и (с'), в котором один или более шагов (а'), (b') и (с') во втором протоколе дозировок длиннее, чем соответствующие шаги в первом протоколе дозировок.
65В. Способ по варианту реализации изобретения 8В, в котором вариации шагов (а), (b) и (с) включают проведение первого протокола дозировок с шагами (а), (b) и (с) однократно, двукратно или трехкратно, за чем следует одно или более повторений второго протокола дозировок с шагами (а'), (b') и (с'), в котором один или более из шагов (а'), (b') и (с') во втором протоколе дозировок короче, чем соответствующие шаги в первом протоколе дозировок.
66В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1 В по 67В, в котором одно или более соединений формулы 1 назначается орально, внутримышечно, внутривенно, подкожно, местно, вагинально, ректально, интракраниально, интратекально, внутрикожно, в виде аэрозоля или буккально.
67В. Способ по варианту реализации изобретения 66В, в котором одно или более соединений формулы 1 представлено или представлены в виде твердого препарата, преимущественно в виде твердого (тела), или одно или более из соединений формулы 1 представлено или представлены в виде жидкого препарата, преимущественно раствора, коллоидного раствора или суспензии, или одно или более соединений формулы 1 представлено или представлены в виде геля, крема или пасты.
68В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 2 В по 67В, в котором вирусная инфекция, внутриклеточная бактериальная инфекция, внеклеточная бактериальная инфекция, грибковая инфекция, дрожжевая инфекция, внеклеточная паразитарная инфекция, внутриклеточная паразитарная инфекция, паразит протозоа, многоклеточный паразит, аутоиммунное заболевание, рак, предраковое состояние, химиотерапия, радиотерапия, иммуноподавляющая терапия, терапия антиинфекционным агентом, рана, ожог, или присутствие иммуноподавляющей молекулы, гастроинтерстициальное раздражение или любая комбинация вышеперечисленного у субъекта является а) вирусной инфекцией ДНК или вирусной инфекцией РНК (HSV, CMV, HBV, HCV, HIV, SHIV, SIV); (b) микоплазменной инфекцией, инфекцией Listeria или инфекцией Mycobacterium, (с) внеклеточной бактериальной инфекцией, (d) грибковой инфекцией, (е) дрожжевой инфекцией (Candida, Cryptococcus); (d) протозоа (малярия, лейшмания, криптоспоридиум, токсоплазма, пневмоцистис), (е) многоклеточным паразитом, (f) аутоиммунным заболеванием (SLE, RA, диабетом); (g) раками (твердыми раками, а именно раком яичников, молочной железы, простаты, глиомы, рассеянными раками, а именно лимфомами, лейкемией, раком толстой кишки, саркомами; (h) предраковыми состояниями; (i) химиотерапиями (адриамицин, цисплатин, митомицин С); (j) радиотерапиями; (k) иммуноподавляющими терапиями; (l) терапиями с антиинфекционными агентами; (m) ранами (хирургическими или другими); (n) ожогами 1й, 2й или 3й степени; (о) иммуноподавляющими молекулами; (р) желудочно-кишечным раздражением (кишечное раздражение, болезнь Крона, хроническая диаррея) или (q) любыми комбинациями от (а) до (р).
69В. Способ по варианту реализации изобретения 68В, в котором вирусная инфекция РНК является инфекцией ретровирусом или инфекцией вирусом гепатита.
70В. Способ по варианту реализации изобретения 68В или 69В, в котором одно или более соединений формулы 1 является одним соединением формулы 1.
71В. Способ по варианту реализации изобретения 70В, в котором одно или более соединений формулы 1 является или являются композицией, которая включает (а) один или более жидкий неводный эксципиент, в состав которого входит менее примерно 3% (об/об) воды; (b) твердое вещество, которое включает фармацевтически приемлемый эксципиент, или (с) один или более жидких эксципиентов, в состав которых входит более чем 3% (об/об) воды.
72В. Способ по варианту реализации изобретения 68В или 71В, в котором соединением формулы 1 является 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16р-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-он, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он или 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-он.
73В. Способ по варианту реализации изобретения 72В, в котором соединением формулы 1 является 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он.
74В. Способ по варианту реализации изобретения с 1В по 73В, в котором соединение формулы 1 исключает одно или более соединений формулы 1.
75В. Способ лечения у субъекта непреднамеренной потери веса, оральных повреждений, повреждений кожи, условно-патогенных инфекций, диареи или утомляемости, включающий прерывистое назначение субъекту одного или более соединений формулы 1 (например, непреднамеренную потерю веса в результате вирусной инфекции, желудочно-кишечной инфекции, химиотерапии, анорексии).
76В. Способ по варианту реализации изобретения 75В, в котором у субъекта имеется иммуноподавленное состояние.
77В. Способ по варианту реализации изобретения 76В, в котором субъект является человеком.
78В. Способ по варианту реализации изобретения 77В, в котором субъект является человеком в возрасте от 1 дня до 18 лет (например, от 1 месяца до 6 лет).
79В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 75В по 78В, в котором специфический иммунитет субъекта остается недостаточным по сравнению с типичным сопоставимым контрольным субъектом, не имеющим патологического состояния субъекта.
80В. Способ по варианту реализации изобретения 79В, в котором титр CD4 клеток субъекта не увеличивается значительно во время проведения одного или более курсов дозировки (например, дозировка в течение от 1 недели до примерно 2 недель или более).
81В. Способ по варианту реализации изобретения 80В, в котором титр CD4 клеток субъекта составляет от примерно 20 до примерно 100 CD4+ клеток/мм3 или от примерно 20 до примерно 75 CD4+ клеток/мм3.
82В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1В по 81В, в котором у субъекта есть патоген(ы), инфекция или злокачественная опухоль, и патоген(ы) или злокачественная опухоль не становятся резистентными к соединению формулы 1 в течение времени, требующегося обычно для развития измеримой резистентости у, по меньшей мере, 50% субъектов, которые были подвергнуты терапевтическому лечению(ям) отличным от таковых соединением(ями) формулы 1.
83В. Способ по варианту реализации изобретения 82В, в котором патогенной инфекцией является инфекция HIV, SIV, SHIV или HCV.
84В. Способ по варианту реализации изобретения 82В или 83В, в котором соединением формулы 1 является одно или более соединений из 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростана-17-он, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-он, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан, 16α-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен, 16α-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β,17β-дигидрокси-5α-андростен, 16β-бромо-3β,7β,17β-тригидрокси-5α-андростан, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она, 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростен-17-она, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростан-17-она, 16β-бромо-3β,7β-дигидрокси-5α-андростен-17-она или физиологически приемлемого эфира, карбоната, карбамата, аминокислотного конъюгата или пептидного конъюгата.
85В. Способ по варианту реализации изобретения 84В, в котором соединением формулы 1 является 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он или его физиологически приемлемый эфир, карбонат, карбамат, аминокислотный конъюгат или пептидный конъюгат.
86В. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1В по 85В, в котором соединение формулы 1 является соединением, названным в соединении любой группы от 1 до 42-25-10-6, или соединение формулы 1 является представителем любого рода описанного в любой группе соединений от 1 до 42-25-10-6.
В других вариантах реализации изобретения предложены способы модуляции иммунных клеток или иммунной реакции у субъекта. Нижеследующие пронумерованные варианты реализации изобретения описывают некоторые из этих способов.
1С. Способ модулирования врожденного иммунитета субъекта или усиления иммунной реакции Тh1 субъекта или снижение иммунной реакции Th2 субъекта, включающий назначение субъекту соединения(ний) формулы 1, включающих любое соединение формулы 1, которое здесь описано или раскрыто, включая соединения, описанные выше в пп.1-64 и 1А-11А.
2С. Способ по варианту реализации изобретения 1С, в котором усилен врожденный иммунитет субъекта.
3С. Способ по варианту реализации изобретения 1С или 2С, в котором субъект страдает от состояния подавленного врожденного иммунитета, подавленной иммунной реакции Тh1 или нежелательной иммунной реакции Th2.
4С. Способ по варианту реализации изобретения 3С, в котором состояние подавленного врожденного иммунитета, подавленная иммунная реакция Тh1 или нежелательная иммунная реакция Th2 связаны с вирусной инфекцией, внутриклеточной бактериальной инфекцией, внеклеточной бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, дрожжевой инфекцией, внеклеточной паразитарной инфекцией, внутриклеточной паразитарной инфекцией, паразитом протозоа, многоклеточным паразитом, аутоиммунным заболеванием, раком, предраком, химиотерапией, радиотерапией, иммуноподавляющей терапией, терапией с антиинфекционным агентом, раной, ожогом, присутствием иммуноподавляющей молекулы или любой комбинацией вышеперечисленного.
5С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1С по 3С, в котором у субъекта усилена иммунная реакция Th1.
6С. Способ по варианту реализации изобретения 1С, в котором у субъекта подавлена иммунная реакция Th2.
7С. Способ по варианту реализации изобретения 6С, в котором у субъекта отмечается состояние, включающее нежелательную иммунную реакцию (например, аутоиммунное заболевание, SLE, диабет).
9С. Способ по варианту реализации изобретения 6С или 7С, в котором субъект является позвоночным, млекопитающим, приматом или человеком.
10С. Способ по варианту реализации изобретения 9, в котором модуляцией специфического иммунитета позвоночного, млекопитающего, примата или человека является (i) усиление CTL или Th1 реакций на вирусную инфекцию или злокачественную клетку in vitro или in vivo, (ii) усиленная презентация антигена или биологическая активность предшественников дендритных клеток или (iii) усиление уничтожения вирусинфицированных или злокачественных клеток.
11С. Способ по варианту реализации изобретения 10С, в котором позвоночным является человек, вирусной инфекцией является HIV инфекция, а реакции CTL или Тh1 включают усиление реакций на один или более гаг протеинов HIV или на gp 120 (вируса) HIV.
12С. Способ по варианту реализации изобретения 1С, 4С, 10С или 11С, в котором Th1 клетки субъекта, опухоль-инфильтрующие лимфоциты (TIL клетки), NK клетки, лимфоциты периферической крови, фагоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, дендритные клетки или фиброциты активированы, что определено измерением, например, по возрастанию включения 3H-тимидина по сравнению с необработанным контролем или по увеличению в циркулирующей крови (количества) разных типов клеток, или показательными движениями разных типов клеток из одной ткани или органа (например, кожи) в другую ткань или орган (например, кровь, лимфу, лимфатический узел, селезенку или тимус).
13С. Способ по варианту реализации изобретения 1С, 4С, 10С, 11С или 12С, в котором соединение(я) формулы 1 модулирует транскрипцию одного или более генов в NK клетках, фагоцитах, моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, дендритных клетках субъекта, или активирует фиброциты (например, как это показано измерениями увеличения активности протеинкиназы С или по изменению биологической активности стероидного рецептора или рецептора orphan нуклеарного гормона).
14С. Способ по варианту реализации изобретения 1С, в котором соединение(я) формулы 1 усиливает движения лизосом в одном или более типов клеток субъекта: NK клетках, фагоцитах, моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, дендритных клетках или фиброцитах.
15С. Способ по варианту реализации изобретения 1, в котором соединение(я) формулы 1 усиливает активность протеинкиназы С в одном или более типов клеток субъекта: NK клетках, фагоцитах, моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, дендритных клетках или фиброцитах (например, РКСα, РКСβ, РКСγ и PKCζ).
16С. Композиция, включающая частично очищенный или очищенный комплекс, включающий соединение формулы 1 и стероидный рецептор, стероид связывающий протеин сыворотки (например, альбумин сыворотки крови человека, α1-кислотный гликопротеин, связывающий половые гормоны протеин, тестостерон связывающий глобулин, кортикостероид связывающий глобулин, андроген связывающий протеин (крысы)), или партнер для связывания (например, комплексообразующий агент, липосома, антитело).
17С. Продукт, полученный в процессе приведения частично очищенной или очищенной композиции по варианту реализации изобретения 16С в контакт с одним или более стерильными контейнерами, одним или более стерильными шприцами, одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами (например, эксципиентами, как это определено в краткой спецификации выше и включающими сахара, лактозу, сахарозу, наполнители, смазки, связущие вещества, или любые эксципиенты, названные в любой из цитированных здесь ссылок), одной или более клетками, одной или более тканями, плазмой или кровью.
18С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1С по 17С, в котором субъект имеет инфекцию, гиперпролиферационное нарушение, гипопролиферационное состояние, иммуноподавленное состояние, нежелательную иммунную реакцию, или в котором субъект недавно перенес травму, хирургическое вмешательство или терапеевтическое лечение, в котором терапевтическое лечение является иным, нежели способ по п.1С.
19С. Способ по варианту реализации изобретения 18С, в котором иммуноподавленное состояние или нежелательная иммунная реакция связаны с вирусной инфекцией, внутриклеточной бактериальной инфекцией, внеклеточной бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, дрожжевой инфекцией, внеклеточной паразитарной инфекцией, внутриклеточной паразитарной инфекцией, паразитом протозоа, многоклеточным парзитом, аутоиммунным заболеванием, раком, предраком, химиотерапией, радиотерапией, иммуноподавляющей терапией, терапией антиинфекционным агентом, раной, ожогом, присутствием иммуноподавляющей молекулы, желудочно-кишечным раздражением или любой комбинацией вышеперечисленного.
20С. Способ по варианту реализации изобретения 19С, в котором иммуноподавленное состояние субъекта улучшено или нежелательная иммунная реакция уменьшена.
21С. Способ по варианту реализации изобретения 19С, в котором иммуноподавленное состояние субъекта связано с вирусной инфекцией.
22С. Способ по варианту реализации изобретения 21 С, в котором вирусная инфекция включает инфекцию ДНК вирусом или РНК вирусом.
23С. Способ по варианту реализации изобретения 22С, в котором РНК вирусная инфекция включает ретровирусную инфекцию или инфекцию вирусом гепатита.
24С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 18С по 23С, в котором субъект страдает от одного или более из следующего: хронической диарреи, непроизвольной потери веса (обычно по меньшей мере 5% или более), кахексии (обычно по меньшей мере 5% или более), изнурения мышц, одной или более язв на слизистой рта (обычно по меньшей мере диаметром около 1 см2), одной или более язв на слизистой гениталий (обычно по меньшей мере диаметром около 1 см2), кожных язв (обычно по меньшей мере диаметром около 1 см2), или оппортунистических инфекций, связанных с ВИЧ.
25С. Способ (определения, например, биологической активности соединения формулы 1 или модуляции гена в клетке или бесклеточной транскрипционной системе), включающий (а) приведение соединения(ний) формулы 1 в контакт с клеткой или популяцией клеток in vitro или in vivo; (b) определение одного или более из (i) образования комплекса между партнерами для связывания и соединением формулы 1, (ii) пролиферации клетки или популяции клеток, (iii) дифференциации клетки или популяции клеток, (iv) активности протеинкиназы С, (v) уровня фосфориляции субстрата протеинкиназы С, (vi) транскрипции одного или более генов мишеней, (vii) усиления или подавления клеточной реакции на стероиды, например глюкокортикоиды, (viii) ингибирования индуцированной стероидами транскрипции, например, глюкокортикоидов, половых стероидов, (ix) подавление ретровируса (например, HIV, SIV, FIV или SHIV), LTR зависимой транскрипции, или (х) изменения величины популяции иммунных клеток в циркуляционной системе in vivo (например, циркулирующих лимфоцитов периферической крови у млекопитающих, таких как приматы или человек) и (с) возможно сравнивая результат, полученный при проведении шага (b) с подходящим контролем.
26С. Способ по варианту реализации изобретения 25С, в котором партнер для связывания является стероидным рецептором, фактором транскрипции или стероидным гормоном надсемейства orphan рецептора.
27С. Способ по варианту реализации изобретения 25С, в котором определяемой биологической активностью является модулирующее действие соединения формулы 1 на репликацию или цитопатические эффекты, связанные с ретровирусом, вирусом гепатита или паразитом из протозоа.
28С. Способ по варианту реализации изобретения 25С, в котором определяемой биологической активностью является модулирующая активность соединения формулы 1 на репликацию, цитопатические эффекты, связанные с ретровирусом, вирусом гепатита или паразитом из протозоа или определяемой биологической активностью является метаболизм (например, включение 3H-тимидина) клетки или популяции клеток, включая NK клетки, фагоциты, моноциты, макрофаги, базофилы, эозинофилы, фиброциты, трансформированные клетки, вирусинфицированные клетки, клетки, инфицированные бактериями, или клетки, инфицированные паразитами.
29С. Способ по варианту реализации изобретения 25С, в котором геном-мишенью является ген вируса, ген бактерии, ген паразита, ген, связанный с раком.
30С. Способ по варианту реализации изобретения 29С, в котором ген вируса является геном полимеразы, геном реверсивной транскриптазы, envelope геном или геном, связанным с репликацией вирусной нуклеиновой кислоты или структурным геном вируса.
31С. Способ по варианту реализации изобретения 30С, в котором ген полимеразы кодирует ДНК полимеразу или РНК полимеразу.
32С. Способ по варианту реализации изобретения 30С, в котором ген реверсивной транскриптазы кодирует реверсивную транскриптазу ретровируса человека, примата, птицы или кошки.
33С. Способ, включающий назначение соединения(ний) формулы 1 человеку или примату, который имеет ретровирусную инфекцию и титр CD4, равный 550 или ниже.
34С. Способ по варианту реализации изобретения 33С, в котором человек имеет титр CD4 от примерно 20 до примерно 100 или от примерно 20 до примерно 80.
35С. Способ по варианту реализации изобретения 33С, в котором человек имеет титр CD4 от примерно 30 до примерно 150.
36С. Способ по варианту реализации изобретения 33С, в котором человек имеет титр CD4 от примерно 500 и менее, от примерно 450 и менее, от примерно 400 и менее, от примерно 350 и менее, от примерно 300 и менее, от примерно 250 и менее, от примерно 200 и менее, от примерно 150 и менее, от примерно 100 и менее, от примерно 50 и менее или от примерно 25 и менее или от примерно 20 и менее.
37С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 33С по 36С, в котором соединение(я) формулы 1 представлены в композиции, которая содержит один или более жидких неводных эксципиентов и менее чем 3% об/об воды или любой из составов, как раскрыто в спецификации или в любом из вышеприведенных пронумерованных способов.
38С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 33С по 37С, в котором соединение(я) формулы 1 назначают в соответствии с прерывистым протоколом дозировок, как раскрыто в спецификации или любом из вышеприведенных пронумерованных вариантов реализации изобретения.
39С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 30С по 45С, в котором человек одновременно инфицирован вирусом гепатита С, вирусом гепатита В, вирусом HSV-1, HSV-2, малярийным паразитом, Pneumocystis паразитом или Cryptosporidium паразитом.
40С. Способ по варианту реализации изобретения 46С, в котором у человека снижен уровень HCV.
41С. Способ, включающий применение соединения(ний) формулы 1 к субъекту или к клетке(кам) нервной системы в культуре ткани, в котором соединение(я) формулы 1 связывается с рецептором, связанным с клеткой(ками) в нервной системе и (1) вызывает биологическую реакцию в клетке(ках) нервной системы или в клетке(ках) в культуре тканей и/или (2) вызывает биологическую реакцию, которая передается на расстоянии(ях), или клетку(и), где способ возможно используют для просмотра соединения(ний) формулы 1 на их биологическую активность, для лечения у субъекта паталогического состояния (например, патогенной инфекции, такой как вирус (HIV), злокачественная опухоль или неврологическое расстройство, например, связанную со СПИДом диментию, болезнь Альцмейера, болезнь Паркинсона, множественный склероз, или для оценки биодоступности или метаболизма соединения(ний) формулы 1 в субъекте или клетке(ках) в нервной системы или в культуре ткани, в котором метаболизм возможно определяется через сравнение с контрольным соединением, которым может быть другое соединение формулы 1.
42С. Способ по варианту реализации изобретения 41, в котором рецептор, связанный с клеткой в нервной системе, является нейротрансмиттерным рецептором(ами) (например, рецептор γ-аминобитуриковой кислоты, такой как А тип, рецептор NMDA) и/или стероидный рецептор (например, рецептор андрогена, рецептор эстрогена).
43С. Способ по варианту реализации изобретения 41С или 42С, в котором клетка(и) в нервной системе является нейроном(ами) и астроцитом(ами) и/или глиальной клеткой(ками).
44С. Способ по варианту реализации изобретения 41С, 42С или 43С, в котором биологичекской реакцией в клетке(ках) в нервной системе или в клетке(ках) культуры тканей является повышенная или сниженная траскрипция гена(нов) (например, нейротрансмиттера, вазопрессина, протеина теплового шока). Повышенная или сниженная секреция протеина(нов) (например, вазопрессина), снижение повреждения от окислительного стресса, усиление выделения окиси азота и/или усиление роста невритов.
45С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1С по 44С, в котором соединение(я) формулы 1 является одним или более соединением формулы 1, выбранным из соединений, или одним или более видов соединений внутри рода, названного в группе соединений 1 через 21-10-6.
46С. Способ модулирования экспрессии, по меньшей мере, одного иммуноклеточного антигена в иммунной клетке субъекта, в котором антиген иммунной клетки выбран из CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD25, CD38, D56, CD62L, CD69, CD45RA.
46С. Способ (а) модулирования экспрессии, по меньшей мере, одного иммуноклеточного антигена в иммунной клетке субъекта, в котором антиген иммунной клетки выбран из CD3, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD25, CD38, CD56, CD62L, CD69, CD45RA, CD45RO, CD123, HLA-DR, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, 
IGF1 и 
или (b) активирования CD8+ Т клеток или CD8- Т клеток в субъекте, в котором активация включает, по меньшей мере, кратковременное усиление экспрессии Т клетками CD25 или CD69 или (с) увеличения пропорции CD8+ или CD8- лимфокинактивированных клеток-убийц среди CD16+ клеток субъекта (например, CD8+, CD16+, CD38+ или клеток CD8-, CD16+, CD38+), или (d) увеличения пропорции (i) CD8-, CD16+ естественных клеток убийц, CD8+, CD16+ естественных клеток убийц или CD8-, CD16+ клеток, которые передают зависимую от антител, передаваемую клетками цитотоксичность, или (iv) CD8+, CD16+ клеток, которые передают зависимую от антител, передаваемую клетками цитотоксичность, или повысить, среди циркулирующих белых кровяных клеток субъекта, пропорцию предшественников дендритных клеток (например, Lin-, HLA-DR+, CD123+ или Lin- HLA-DR+, CD11c+ клеток), или увеличить пропорцию CD45RA+ Т клеток или CD45+, R0+ Т клеток среди циркулирующих белых кровяных клеток субъекта, или (g) изменения (увеличения или уменьшения) пропорции сравнительного числа CD62L+ Т клеток среди циркулирующих белых кровяных клеток субъекта, или (h) увеличения пропорции CD8+ или CD4+ Т клеток, которые экспрессируют CD62L в циркуляционной системе субъекта или (i) снижения пропорции CD8+ или CD4+ Т клеток, которые экспрессируют CD62L среди циркулирующих у субъекта CD8+ или CD4+ Т клеток, или (j) увеличения пропорции HLA-DR+, CD8+, CD38+ клеток среди циркулирующих белых кровяных клеток субъекта, или (k) снижения уровня IL-4 или IL-10, которые экспрессируются или присутствуют в белых кровяных клетках субъекта, или в плазме субъекта (или которые экспрессируются после того, как белые кровяные клетки субъекта были простимулированы in vitro), (1) по меньшей мере, кратковременного увеличения числа предшественников дендритных клеток или дендритных клеток, которые присутствуют среди белых кровяных клеток субъекта или в плазме субъекта или (m) усиления способности CD4+ Т клеток экспрессировать IL-2, IL-12 или способ включающий назначение субъекту соединения формулы 1 и фармакологически приемлемого эксципиента.
47С. Способ по варианту реализации изобретения 46С, в котором соединение формулы 1 имеет структуру
где R1 является -ОН или группой (например, эфиром С1-30), которая может гидролитически превращаться в физиологических условиях в -ОН, каждая из которых может быть или в α- или в β-конфигурациях, R2 является водородом в α- или β-конфигурации или R2 отсутствует, в том случае, если существует двойная связь в положениии 5-6; R3 является -Н или -Br, каждый из которых может находиться в α- или β-конфигурациях; R4 является -ОН или группой (например, эфиром С1-30), которая может гидролитически превращаться в физиологических условиях в -ОН, каждая из которых может быть в α- или β-конфигурациях, или R4 является =O и атом водорода, прикрепленный к тому же атому углерода, отсутствует; R4A является R4 -С(O)-СН3 или -C(O)-(CH2)1-6-CH3; R5 является -Н или -ОН или группой (например, эфиром С1-30), которая может гидролитически превращаться в физиологических условиях в -ОН, каждая из которых может быть в α- или β-конфигурациях, или R5 является =O и атом водорода, присоединенный к тому же атому углерода, отсутствует; пунктирная линия в позиции 5-6 является возможно двойной связью, или в котором соединение формулы 1 имеет строение, показанное для любого соединения формулы 1, названного или описанного здесь, включая соединения вышеописанные в пп.1-64 и 1А-11А.
48С. Способ по варианту реализации изобретения 46С или 47С, в котором соединение формулы 1 назначается субъекту ежедневно в течение периода времени от одного до примерно 15 дней, например в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более дней.
49С. Способ по варианту реализации изобретения 48С, в котором экспрессия антигена иммунными клетками заметно изменяется в течение, по меньшей мере, примерно 4-7 дней после последнего назначения субъекту соединения формулы 1, например, по меньшей мере, 4, 5, 6, 7 или более дней.
50С. Способ по варианту реализации изобретения 48С или 49С, в котором экспрессия антигена иммунными клетками заметна, по меньшей мере, в течение примерно 8-90 дней после последнего назначения соединения формулы 1, например, по меньшей мере, в течение 8, 10, 12, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 42, 45,49, 50, 55, 60, 63, 65, 70, 75, 77, 80, 90, 98, 100 или более дней.
51С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 46С по 51С, в котором у субъекта имеется иммуноподавленное состояние, патогенная инфекция или состояние, связанное с недостаточной иммунной реакцией Тh1 или избыточной иммунной реакцией Th2.
52С. Способ по варианту реализации изобретения 51С, в котором патогенная инфекция является вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, дрожжевой инфекцией, грибковой инфекцией, вироидной инфекцией, например, в которой патогенная инфекция явяляется вирусной инфекцией, такой как ДНК вирусной инфекцией или РНК вирусной инфекцией (например, инфекцией, вызванной Hepadnavirus, Parvovirus, Papovavirus, Adenovirus, Herpesvirus, Retrovirus, Flavivirus, Togavirus, Rhabdovirus, Picoruavirns, Bunyavirus, Reovirus, Orthomyxovirus или Paramyxovirus, такими как HIV1, HIV2, SIV, SHIV или другими вирусами, описанными здесь или в цитируемых ссылках).
53С. Способ по варианту реализации изобретения 52С, в котором у субъекта имеется иммуноподавленное состояние, которое связано или вызвано патогенной инфекцией.
54С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 46С по 53С, в котором субъект является млекопитающим, человеком, приматом или грызуном.
55С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 46С по 54С, в котором субъекту назначается от примерно 0,05 мг/кг/день до примерно 20 мг/кг/день парентерально (например, путем внутривенной, подкожной, внутримышечной или интрамедуллярной инъекции), местно, орально, под язык или буккально, например, примерно 0,1 мг/кг/день, примерно 0,2 мг/кг/день, примерно 0,5 мг/кг/день, примерно 1,0 мг/кг/день, примерно 1,5 мг/кг/день, примерно 2 мг/кг/день, примерно 2,5 мг/кг/день, примерно 3,0 мг/кг/день, примерно 4 мг/кг/день или примерно 6 мг/кг/день, то есть примерно 0,1-10 мг/кг/день, обычно примерно 0,2-7 мг/кг/день.
56С. Способ по варианту реализации изобретения 55С, в котором субъект одновременно принимает один или более других терапевтических агентов для лечения патогенной инфекции, например вирусной инфекции, такой как HIV-1 инфекция, HIV-2 инфекция, HAV инфекция, HBV инфекция, HCV инфекция, инфекция вирусом Эпштейна Барра, HSV-1 инфекция, HSV-2 инфекция, инфекция вирусом герпеса человека 6, инфекция вирусом герпеса человека 7, инфекция вирусом герпеса человека 8, или бактериальная инфекция, такая как малярийная инфекция, лейшманиоз, криптоспоридиоз, токсоплазмоз, микоплазменная инфекция, инфекция Trichomonas, инфекция Chlamidya, инфекция Pneumocystis, инфекция Salmonella, Listeria инфекция, Escherichia coli инфекция, Yersinia инфекция, Vibrio инфекция, Pseudomonas инфекция, Mycobacterium infection, a Haemophilus infection, a Neisseria infection, a Staphylococcus инфекция или Streptococcus инфекция.
57С. Способ по варианту реализации изобретения 58С, в котором один или более из других терапевтических агентов является ингибитором протеазы, ингибитором реверсивной трансферазы, ингибитором вирусной полимеразы, бактериальной или паразитарной ДНК или РНК, антибактериальным антибиотиком, антигрибковым агентом, таким как AZT, ddI, ddC, D4T, 3ТС, ингибитором вирусного слияния (например, HIV), гидроксиуреей, нельфинавиром, саквинавиром, ритонавиром, индинавиром, хлорохином, аналогом хлорохина, амфотерицином В, флуконазолом, хлотримазолом, изониазидом, дапсоном, рифампином, циклосерином, эритромицином, тетрациклиновым антибиотиком, ванкомицином, этамбутолом, пиразинамидом, флюрохинолином (например, ципрофлохасин, норфлокасин), цефалоспориновым антибиотиком, β-лактамовым антибиотиком или аминоглюкозидным антибиотиком (например, стрептомицином, канамицином, тобрамицином).
58С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 46С по 57С, в котором субъект является человеком, приматом, представителем кошачьих, псовых или грызунов.
59С. Композиция, включающая эффективное количество модулирующего подгруппу иммунных клеток соединения формулы 1 и фармацевтически приемлемый носитель.
60С. Композиция по варианту реализации изобретения 59С, в которой подгруппой иммунных клеток являются (1) CD8+ Т клетки, (2) CD4+ Т клетки, (3) CD8+ лимфокинактивированные клетки-киллеры, (4) CD8- лимфокинактивированные клетки киллеры, (5) CD8-, CD16+ естественные клетки киллеры, (6) CD8+, CD16+ естественные клетки киллеры, (7) CD8-, CD16+ клетки, которые передают зависящую от антител передаваемую клетками цитотоксичность, (8) CD8+, CD16+ клетки, которые передают зависящую от антител, передаваемую клетками цитотоксичность, (9) дендритные клетки или предшественники дендритных клеток, (10) CD45RA+ Т клетки, (11) CD45RO+ Т клетки, (12) CD45RA+, CD45RO+ Т клетки, (13) CD8+, CD62L Т клетки, (11) CD4+, CD62L+ Т клетки или (14) HLA-DR+, CD8+, CD38+ Т клетки.
61С. Способ обнаружения биологических реакций, связанных с назначением соединения формулы 1 субъекту, включающий (1) получение от субъекта образца, (2) назначение субъекту соединения формулы 1 с получением субъекта, подвергшегося лечению, (3) получение второго образца от подвергшегося лечению субъекта, (4) в течение 24 часов после получения образца, исследование образца для получения контрольной информации для обнаружения биологической реакции, (5) в течение 24 часов после получения второго образца, исследование второго образца на присутствие или отсутствие биологической реакции для получения экспериментальной информации и (6) факультативное сравнение контрольной информации с экспериментальной информацией для обнаружения присутствия, отсутствия, сравнительной величины биологической реакции.
62С. Способ по варианту реализации изобретения 61, в котором соединение формулы 1 дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.
63С. Способ по варианту реализации изобретения 61С или 62С, в котором биологической реакцией, связанной с назначением соединения формулы 1 субъекту, явялется изменение экспрессии антигена поверхности клетки, увеличение абсолютного или относительного числа клеток в подгруппе иммунных клеток, уменьшение абсолютного или относительного числа клеток в подгруппе иммунных клеток или неизменность абсолютного или относительного числа клеток в подгруппе иммунных клеток.
64С. Способ по варианту реализации изобретения 63С, в котором подгруппой иммунных клеток явяляются CD8+ Т клетки, CD4+ Т клетки, CD8+ активированные лимфокином клетки-киллеры, CD8-, CD16+ природные клетки киллеры, циркулирующие предшественники дендритных клеток, циркулирующие дендритные клетки, тканевые предшественники дендритных клеток, тканевые дендритные клетки, CD8+ активированные лимфокинами клетки-киллеры, CD8- активированные лимфокинами клетки киллеры, CD8-, CD16+ природные клетки киллеры, CD8+, CD16+ природные клетки киллеры, CD8-, CD16+ клетки, которые передают зависящую от антител, передаваемую клетками цитотоксичность, CD8+, CD16+ клетки, которые передают зависящую от антител, передаваемую клетками цитотоксичность, CD45RA+ Т клетки, CD45RA+, CD45RO+ Т клетки, CD45RO+ Т клетки, CD8+, CD62L Т клетки CD4+, CD62L+ Т клетки или HLA-DR+, CD8+, CD38+ Т клетки, моноциты или макрофаги.
65С. Способ по варианту реализации изобретения 64С, в котором биологической реакцией является, по меньшей мере, кратковременное изменение антигена иммунной клетки или антигена вспомогательной иммунной клетки (например, адгезионной молекулы на поверхности эндотелиальных клеток или рецептора цитокина на поверхности Т клеток или В клеток).
66С. Способ по варианту реализации изобретения 65С, в котором антиген иммунной клетки явяляется протеином, гликопротеином или антиген поверхности клетки экспрессируется обычно или исключительно лимфоидными клетками (лимфоцитами или белыми кровяными клетками или их предшественниками, например Т клетками, В клетками, моноцитами, макрофагами, LAK клетками, NK клетками, дендритными клетками).
67С. Способ по варианту реализации изобретения 65С, в котором антигеном иммунной клетки явяляется молекула CD, интерлейкин, или цитокин, возможно выбираемый из CD16, CD25, CD38, CD62L, CD69, CD45RA, CD45RO, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα, IGF1 и γIFN.
68С. Способ по любому варианту изобретения с 61С по 67С, в котором субъект является человеком, приматом, представителем псовых, кошачьих или грызуном.
69С. Способ изменять баланс Th1-Th2 субъекта, включающий назначение эффективного количества соединения формулы 1 субъекту, в котором заметно изменяется экспрессия или секреция IL-4 или IL-10 субъекта.
70С. Способ по варианту реализации изобретения 30, в котором экспрессия или секреция IL-4 или IL-10 субъекта уменьшается, и баланс Th1-Th2 в иммунной реакции субъекта на инфекцию или иммуноподавленное состояние заметно улучшается.
71С. Способ по любому из вариантов реализации изобретения с 1С по 70С, в котором соединение формулы 1 является соединением, названным в любой из групп с 1 по 42-25-10-6, или соединение формулы 1 является представителем любого рода, описанного в любой из групп соединений 1 через 42-25-10-6.
Варианты и модификации этих вариантов реализации изобретения, формула изобретения и остальная часть данного описания будут, несомненно, понятны специалистам после их прочтения. Укаазанные варианты и модификации подпадают под рамки и дух данного изобретения. Все цитируемые источники, таким образом, приведены здесь по ссылкам во всей их полноте. Все цитируемые источники, таким образом, включены в заявку через ссылки с подробностями.
Примеры. Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение, но они ни в коей мере не должны его лимитировать.
Пример 1. Состав BrEA. Было приготовлено два набора неводных составов BrEA с концентрацией BrEA 50 мг/л в 25% полиэтиленгиколя 300, 12,5% дегидратированного этилового спирта, 5% бензилбензоата и 57,5% пропиленгликоля, как описано ниже. BrEA получили от Procyte, Inc. Другие эксципиенты приведены ниже.
Партия №.
Состав был приготовлен путем суспензирования BrEA в полиэтиленгликоле 300 с последовательным добавлением пропиленгликоля, бензилбензоата и дегидратированного этилового спирта с образованием раствора, который доводили до конечного требуемого объема дополнительным количеством пропиленгликоля. Методика описана ниже.
Расчетное количество полиэтиленгликоля 300 добавляют в сосуд для смешивания. Затем, в процессе смешивания, в сосуд добавляют расчетное количество BrEA и перемешивают в течение по меньшей мере 5 минут до образования гладкой кремообразной жидкости, пропиленгликоль добавляют в сосуд и, для получения однородной суспензии, перемешивают в течение минимум 5 минут. Расчетное количество бензилбензоата добавляют в сосуд и смешивают в течение примерно 5 минут для получения полупрозрачной жидкой суспензии. Дегидратированный спирт добавляют в сосуд и перемешивают в течение примерно 5 минут до получения прозрачного, бесцветного раствора. Затем добавляют пропиленгликоль для получения желаемого конечного состава и перемешивают в течение примерно 5 минут. Лекарственный раствор переносят в аппарат для объемного деления для разлива по 1,2 мл на ампулу. Раствор фильтруют под давлением азота через два 0,2 μм фильтра из поливинилиденфторида последовательно в ампулы из янтарного стекла по 2 см3. Ампулы накрывают покрытыми тефлоном пробками из бутилового каучука и закупоривают обжимом. Материалы, использованные в производстве ампул, перечислены ниже.
Спецификации продуктов были исследованы посредством одного или нескольких нижеприведенных анализов.
≥25 μм нбч 600/единиц
**нбч - не больше чем
≥25 μм нбч 600/единиц
15
Пример 2. Лекарственный препарат BrEA и стабильность состава BrEA.
Ускоренное изучение стабильности продолжительностью 6 месяцев было проведено с использованием BrEA и составов из примера 1. Пробы отбирали через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 месяцев и сравнивали со спецификацией, приведенной в примере 1. Реальную стабильность во времени (25°С, относительная влажность 60%) определяли с применением состава BrEA из набора 1 и 2, с отбором проб через 3, 6, 9, 12, 18, 24 и 36 месяцев. После 3 месяцев храненения при 40°С и относительной влажности 75% активность пробы для анализа BrEA составляла, по меньшей мере, 95% от обозначенной на этикетке. Результаты изучения стабильности показали, что состав BrEA в наборе 1 и 2 при повышенной температуре и влажности стабилен в течение, по меньшей мере, 3 месяцев.
Пример 3. Протокол прерывистого дозирования для приматов. Свинохвостых макак, инфицированных ретровирусом SHIV229, лечили составом BrEA, описанным в примере 1. SHIV229 представляет собой рекомбинантный ретровирус, включающий последовательности HIV и SIV. J. Thompson et al., тезисы №75, 16й Annual Symposium on Nonhuman Primate Models for AIDS, October 7-10, 1998, Atlanta, GA, M.Agy et al., abstract №67, 16й Annual Symposium on Nonhuman Primate Models for AIDS, October 7-10, 1998, Atlanta, GA. У обезьян он вызывает агрессивную инфекцию, которая приводит к развитию острых симптомов на последней стадии заболевания у инфицированных нелеченых животных в течение примерно 180-210 дней после инфицирования. Четыре свинохвостые макаки (по 2 в группе) получали подкожные инъекции состава по 1 или 2 мг/кг веса тела в течение 10 следующих друг за другом дней (Протокол 1). На восьмой неделе трех из четырех обезьян пролечили повторно и двух новых с точки зрения лечения обезьян лечили назначением состава в количестве 5 мг/кг ежедневно в течение 20 дней (Протокол 2). На 19 неделе всем приматам, получившим лечение, начали 3 курс лечения с протоколом 3 мг/кг составом BrEA один раз в сутки в течение 10 последующих суток, с повторением каждые четыре недели, так что общее число курсов составило 3 (Протокол 3).
Животные были инфицированы 1-100 единицами TCID50, вводимыми внутривенно или интраректально. Титр вируса в первой группе животных до начала лечения был в пределах от 106 до 108. У всех животных наблюдался начальный рост РНК вируса SHIV в плазме. Через промежуток времени от 2 до 3 недель титры начали снижаться, и 3 из 4 животных показали реакцию на лечение в виде среднего титра вируса на 0.76 log ниже исходного уровня на 4-5 неделе после начала лечения. К 8 неделе титры у всех животных вернулись на исходные уровни. Содержание глюкозы в крови значительно снизилось, концентрации щелочной фосфотазы были повышенными, а показатели SGOT/GGT имели тенденцию сдвигаться к верхней границе нормы. Никаких других существенных изменений ни по одному контролируемому показателю не наблюдалось. В конце первого протокола уровни CD4 у всех обезьян оставались меньшими 100 кл/мм3.
Три из пяти обезьян, получавших лечение по второму режиму (Протокол 2) реагировали на лечение BrEA более сильным и продолжительным образом, чем это наблюдали при более низких уровнях дозирования. У прореагировавших животных понижение ниже исходного уровня в среднем было равно 1.47 log. He проявившие реакции животные из Протокола 1 реагировали при назначении состава BrEA по Протоколу 2. Реакции не проявили два животных, одно было из группы, получившей лечение, другое из новой с точки зрения лечения группы. Третий протокол (Протокол 3) продолжается, и за животными наблюдают.
Обезьяны, использованные в данном исследовании, были исключены из инфекционных исследований, и ожидалось, что первая группа из четырех исследуемых обезьян (Протокол 1) проживет всего несколько недель после начала данных экспериментов, поскольку их состояние начало ухудшаться из-за причин, вызванных болезнью. Одно животное умерло на 356 день от токсической реакции на анастезию, примененную для отбора пробы крови на анализ. Ко времени подачи данной заявки оставшиеся в живых обезьяны получают множественные курсы лечения и, как кажется, находятся в хорошем клиническом состоянии. Они прожили более 380 дней после инфицирования. Было использовано лечение прерывистым дозированием состава BrEA. Три контрольных обезьяны были инфицированы 1-10000 единицами SHIV229 TCID50 и не получали лечения. Эти животные рассматривались в качестве не получающих лечения во время исследования на выживание. Среднее время до смерти для свинохвостых макак, инфицированных SHIV229, было 193 дня. Обезьяны, получавшие лечение, оставались в хорошем клиническом состоянии более 350 дней с уровнями CD4 менее 20 кл/мм3 и без инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, или связанных с болезнью симптомов, кроме незначительной анемии у одного животного.
Эти результаты показали совершенно неожиданные терапевтические реакции приматов, инфицированных ретровирусом SHIV, который сильно вирулентен. Результаты показали не только то, что большинство субъектов при данных протоколах лечения значительно увеличивают срок выживания по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, но также и то, что клинические симптомы, связанные с ретровирусной инфекцией, значительно улучшаются несмотря на то, что число CD4 остается низким, то есть менее чем примерно 100 CD4 кл/мм3 вначале и менее чем примерно 20 CD4 кл/мм3 позднее, во время протоколов лечения. В настоящее время, подобные этим результаты, то есть (1) хорошее клиническое состояние большинства субъектов, имеющих низкие уровни CD4 (менее чем 150 кл/мм3, в особенности менее чем 75 кл/мм3) и (2) никаких клинических признаков устойчивости вируса к лечению, несмотря на прерывистое дозирование в течение длительного промежутка времени, являются беспрецидентными для приматов, людей или любых других животных. Модель SHIV229 является крайне патогенной для свинохвостых макак. События, которые происходили на данной модели в течение нескольких недель, обычно требуют нескольких лет применительно к людям, инфицированным HIV. Не ожидается, что лечение обезьян, инфицированных этим вирусом и получивших лечение обычно используемыми антиретровирусными препаратами, например AZT, 3ТС или ингибитором протеазы, окажет значительное влияние на течение или развитие болезни. Клиническое состояние животных продолжает улучшаться, например, увеличение веса составляет примерно 8-15% на животное. Эти результаты показывают, что лечение с применением протокола прерывистого дозирования высокоэффективно, несмотря на очевидное ухудшение специфического иммунитета субъекта, на что указывают низкое количество CD4. Увеличения числа CD4 можно достичь, используя иммунные стимуляторы, такие как IL2, или у некоторых субъектов, таких как люди, они число CD4 может возрасти спонтанно в зависимости от протокола лечения, продолжительности дозирования или начального медицинского состояния субъекта. Показанные здесь антивирусные эффекты, как кажется, действуют по меньшей мере частично путем усиления иммунных реакций субъекта, например усиления иммунной реакции через фагоцитирующие клетки (NK клетки, моноциты и/или макрофаги) и/или усиления любой из оставшихся специфических иммунных реакций, которые может иметь субъект, если таковые существуют.
Пример 4. Протокол лечения человека. Была проведена клиническая проба в увеличенной дозе с применением неводного состава, содержащего BrEA или другое соединение(я) формулы 1, приготовленного точно так же, как описано в примере 1. Пациенты были новыми с точки зрения лечения или уже прошедшими лечение, и на каждом уровне доз исследовали примерно от 3 до 10 пациентов. Начальная доза составляла 25 мг BrEA или другого соединения(ний) формулы 1, которое назначали парентерально, например, подкожно или внутримышечно. Дозу назначали однократно или один раз в день, или два раза в день в течение 1-12 суток, после чего дозу не назначали в течение, по меньшей мере, 7 дней (например, от 7 до 90 суток). Последующие дозы назначали однократно или один раз в день в течение 1-12 суток, после чего дозу не назначали, по меньшей мере, в течение 7 дней (например, от 7 до 90 суток). Другими протестированными уровнями доз были 20 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг и 300 мг, причем каждая доза назначалась один раз в день как однократная доза или в виде двух, трех или более дробных доз. Проверку эффективности дозирования проводят с применением того же самого протокола дозирования, как и при проверке нарастания дозы, или, альтернативно, сюда может быть включено дозирование один раз или два раза в день через день в течение 3-17 суток, после чего дозу не назначают в течение 7-90 суток, и затем повтор дозирования один раз или два раза в день через день в течение 3-17 суток. Этот протокол повторяют неограниченно долго (например, по меньшей мере, примерно в течение 3-18 месяцев), используя оптимальную дозу(ы), определенную в результате проверки нарастания доз, например, примерно 10-200 мг/день соединения формулы 1.
Пример 5. Фармакологические опыты на животных. Были проведены неклинические опыты с применением орального и подкожного введения состава BrEA. Для определения уровней лекарственного препарата в крови и различных тканях крысам орально вводили растворенную в различных эксципиентах 14С BrEA. Результаты этих предварительных фармакологических исследований показали, что абсорбция BrEA при оральном введении составляет примерно от 0,1 до 15% по сравнению с, по меньшей мере, 80%, выводимыми с фекалиями.
Неводный состав BrEA из примера 1 вводили в виде однократной подкожной инъекции кроликам. Более 90% лекарственного препарата исчезало с места инъекции в течение 24 часов после введения и достигало максимальной концентрации в плазме в количестве примерно 1,2% от введенной дозы через восемь-двенадцать часов после введения. Период полураспада циркулирующего лекарственного препарата в плазме был примерно 12 часов. Лекарственный препарат не аккумулировался в значительной степени ни в одном из основных органов и преимущественно выделялся с мочей.
BrEA вводили крысам подкожно, применяя состав из примера 1. Примерно 90% лекарственного препарата исчезало с места инъекции в течение 24 часов после введения и достигало максимальной концентрации в плазме через час после введения в количестве примерно 0,2% от инъецированной дозы. Исчезновение из плазмы было двухфазным с периодами полураспада соответственно примерно 12 часов и 72 ч. BrEA не аккумулировался в значительной степени ни в одном из основных органов и выделялся преимущественно с фекалиями. Исследования с составом 1 были также проведены на макаках резус для исследования фармокинетики в плазме.
Фармакокинетический анализ 14С BrEA в плазме был проведен на двух самках макаки резус. Было использовано меченое соединение (16α-бромо-3-бета-гидрокси-5α-[4-14С]-андростан-17-он [50 MCi/ммоль]) с дозой 1 мг/кг в виде подкожной инъекции в область лопатки при объеме инъекции 1 мл/кг. BrEA был приготовлен в 25% полиэтиленгликоля 300, 12,5% абсолютного этанола, 5% бензилбензоата и qs с пропиленгликолем. Каждому животному инъецировали по 40 μCi. Для определения активности 14С анализы крови брали через 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 24 ч. Радиоактивность плазмы возрастала почти до пиковых концентраций через 8 часов и оставалась примерно на одном и том же уровне до конца опытов через 24 ч.
Фармакокинетический анализ 14С BrEA был проведен на новозеландских белых кроликах. Двадцать μCi 14С 16α-бромо-3-бета-гидрокси-5α-[4-14С]-андростан-17-он (50 MCi/ммоль) плюс 1 мг/кг немеченой BrEA вводили каждому из трех новозеландских белых кроликов в виде подкожной инъекции в область лопатки с объемом инъекции 1 мл/кг. Лекарственное вещество готовили в 25% полиэтиленгликоле 300, 12,5% абсолютном этаноле, 5% бензилбензоате и (qs) в пропиленгликоле. Анализы крови брали через 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч у всех трех животных и через 48 часов у двух животных. Через 24 и 48 часов после введения одно и два животных соответственно были умерщвлены, и у них были взяты нижеперечисленные органы/ткани: мозг, сердце, почки, печень, легкие, скелетные мышцы, селезенка, мышцы в районе инъекции и кожа. Дополнительно к органам и тканям собирали мочу и фекалии, так же как и смывы с клеток. BrEA не акумулировался в значительной степени ни в одном из перечисленных выше органов. Из всех органов, наибольшее количество лекарственного препарата наблюдали в печени, которая через 24 и 48 часов соответственно содержала приблизительно 0,8% и 0,12% инъецированной дозы (в среднем 0,13%).
Процентное содержание лекарственного препарата в органах (кролики)
24 ч
48 часов
48 часов
Среднее процентное содержание введенной дозы во всей крови было вычислено умножением концентрации лекарственного препарата в цельной крови на предполагаемый объем крови у животного 200 мл. Количество лекарственного препарата в крови достигало максимума приблизительно через 8 ч, и небольшое его количество все еще находилось там, через 48 ч. Количество BrEA в цельной крови было соответственно ниже, чем в плазме, что предполагает отсутствие поглощения лекарственного препарата, в заметной степени, эритроцитами.
Для определения биодоступности введенного орально BrEA были проведены эксперименты in vivo с применением различных составов. BrEA был (1) растворен в соевом масле, масляном витаминуте Е, смеси витаминута Е и кремофора или (2) BrEA измельчали и либо соединяли с сурфактантом, либо нет. Данные составы описаны ниже. Составы вводили орально крысам и определяли уровни BrEA в крови, печени, селезенке, почках и лимфатических узлах. В опытах с применением измельченного BrEA на поглощение лекарственного препарата был исследован мозг. В случае, когда BrEA растворяли в маслах витаминута Е и сои, и витаминуте Е, смешанном с кремофором, в течение 24 ч собирали мочу и фекалии. Данные этих анализов указывают на то, что BrEA проникает в лимфатические узлы, но быстро элиминутирует из других тканей. Значения 14С радиоактивности, обнаруженной в фекалиях через 24 ч после введения, были от 78 до 83%. Краткое изложение каждого опыта приведено ниже, и результаты представлены в Табл.6.
BrEA (5 мг в 1,0 мл соевого масла или масла витаминута Е) с добавлением BrEA, меченого 14С, интрагастрикально вводили крысам. Растворение BrEA в масле витаминута Е или соевом масле было ускорено 50 μл этанола. Животных (по 3 на каждый интервал времени) исследовали через 1,5, 3, 5,5 и 24 ч после введения и определяли 14С-радиоактивность в крови, печени, селезенке, почках, лимфатических узлах и 24-часовых фекалиях и моче. Результаты указывают на то, что на основании 14C-радиоактивности некоторое количество BrEA включается в лимфатическую систему. Для крови, печени и лимфатических узлов включение более значительно в случае соевого масла, чем масла витаминута Е.
BrEA (5 мг в 1,0 мл витаминута Е и кремафора) с добавлением BrEA, меченного 14С, интрагастрикально вводили крысам. Растворение меченной BrEA в смеси витаминута Е с кремафором ускоряли добавлением 60 μл этанола. Животных (по 4 на каждый интервал времени) умерщвляли через 2, 3, 5,5 и 24 ч и измеряли 14С-радиоактивность в крови, печени, селезенке, почках, лимфатических узлах и 24-часовых фекалиях и моче. Результаты указывают на то, что лекарственный препарат поглощается лимфатической системой. Судя по значениям в плазме, печени и лимфатических узлах, представляется, что поглощение лекарственного препарата проходит медленнее по сравнению с соевым маслом или витаминутом Е, и его присутствие в тканях более длительное.
Крысам, по три самца в группе, орально вводили 1,0 мл 0,9% NaCl, содержащего 10 или 32 мг BrEA, измельченного с сурфактантом, Synperonic PE/F 127 (2.5% об/об). Крыс исследовали через 1,5, 5 и 24 ч после введения. Кровь, печень, селезенка, почки, лимфатические узлы и мозг исследовали на 14С радиоактивность. Уровни BrEA в крови по сравнению с опытами с BrEA в масле витаминута Е и сои были выше, 0,3% через 1,5 ч и возрастали через 5 часов до 0,8% и 0,9% при дозах в 10 и 32 мг соответственно. Кроме того, показатели в лимфатических узлах были схожи с таковыми, измеренными через 1,5 ч, и уровни оставались неизменными через 5 часов (5,3 и 5,0%) и 24 ч (3,7 и 3,1%) для доз в 10 и 32 мг соответственно (см. Табл. 6)
В опыте с повторяющимися дозировками крысам интрагастрикально вводили 1,0 мл 0,9% NaCl, содержащего 2 мг BrEA, измельченного с Synperonic PE/F 127 (2,5% об/об), через каждые 6-16 часов. Крыс (по 3 на каждый интервал времени) умерщвляли через 40, 72, 84, 90 и 96 часов после первого введения. Кровь, печень, селезенку, почки и лимфатические узлы исследовали на 14C-радиоактивность. По сравнению с предыдущими опытами в данном эксперименте были отмечены более высокие уровни в крови, печени, почках и лимфатических узлах.
Крысам, по три самца в группе, орально вводили 1,0 мл 0,9% NaCl, содержащего 2, 4 или 10 мг BrEA, измельченного без сурфактанта. Крыс умерщвляли через 1,5, 5 и 24 ч после введения, и кровь, печень, селезенку, почки и лимфатические узлы исследовали на 14С-радиоактивность. Концентрации BrEA, измельченного без сурфактанта, в исследованных тканях были ниже, чем в случае BrEA плюс сурфактант.
Пример 6. Ингибирование паразитов in vitro. Для антималярийного тестирования in vitro были использованы микротитровальные пластинки. Концентрации лекарственного препарата готовили в виде pMol/ячейку в соответствии со стандартной методикой ВОЗ (WHO, 1990). Тестируемое соединение растворяли в 15% DMSO в стерильной RPMI-1640. Были использованы как хлорохинчувствительные (например, WS/97), так и устойчивые (например, MN/97) изоляты видов Plasmodium.
Анализ ингибирования шизонтов проводили следующим образом. На микротитровальные пластинки предварительно помещали различные концентрации тестируемого соединения. 50 μл суспензии зараженных паразитами эритроцитов в RPMI-1640 (0,2 мл эритроцитов +0,3 мл сыворотки + 4-5 мл RPMI-1640) распределяли по микротитровальным ячейкам, которые содержали различные концентрации лекарственного препарата. Для каждой концентрации было сделано три измерения.
Опыты по включению 3H-гипоксантина были проведены, как описано ниже. Исследования проводили в соответствии с методикой Desjardins et al. 1979. После культивирования в течение 30 ч при 37°С те же микротитровальные пластинки из опытов по ингбированию шизонтов с другими утроенными колонками подвергали импульсному воздействию 3H-гипоксантина в течение ночи. Затем суспензию клеток дважды промывали на миллипористом фильтре из стекловолокна на фильтровальном аппарате Millipore. Фильтровальные диски обсчитывали на наличие DPM на β-сцинтиляционном счетчике Бекмана. Активность лекарственного препарата определяли построением графиков зависимости DPM от соответствующих концентраций лекарственного препарата.
Активность 16α-хлороэпиандостерона и 16α-бромодегидроэпиандростерона против хлорохинчувствительных Т996.86 и хлорохинустойчивых клеток Р. falciparum in vitro показана ниже.
Для ингибирования паразита Plasmodium тем же способом применяют и другие соединения формулы 1, например любое соединение из группы соединений с 1 по 25-6.
Пример 7. Четырехдневный режим ингибирования Plasmodium berghei in vivo. Четырехдневные опыты по ингибированию широко используются, и их можно проводить в течение 1 недели. Тест включает прививку пораженных паразитами эритроцитов в первый день опыта (D0), за чем следует инъекция тестируемого соединения, которое также назначается на 2-й, 3-й и 4-й дни режима. На 5-й день отбирают пленки крови и антималярийную активность определяют либо путем просчета паразитамии, либо определения числа паразитов по предварительно установленной шкале (то есть 1-5). Основную процедуру с применением 4-дневного теста описал Петерс (Ann. Trop. Med. Parasitol. 64:25-40, 1970).
Конспект опыта приведен ниже. В каждой тестируемой группе использовали по 5 самок ТО мышей. Паразита штамма Р. berghei HP15 ANKA от мыши донора, имеющей паразитамию 30+%, собирали проколом сердца с применением шприца с гепарином. Кровь разбавляли разбавителем (50% HIFCS+50% стерильный PBS) до конечной концентрации паразитамии в 1% или 1×107 инфицированных эритроцитов на 0,2 мл инфицирующей взвеси. Каждую мышь прививали внутривенно, что дает более равномерный уровень заражения, чем интраперитониальное введение 0,2 мл инфицирующей взвеси. Тестируемые соединения готовили в дозах 100 мг/кг в (16,7% DMSO+83,3% Celacol). Стероидные составы назначали интраперитонеально через два часа после прививки паразита. Соединения назначали один раз в день, начиная с D0 и продолжая назначать в течение последующих трех суток. Пленки крови готовили из крови, отобранной из хвоста на следующий после последнего назначения соединения день, фиксировали 100% метанолом и окрашивали 10% Giemsa. Паразитамию отпределяли по шкале от 0-5, где 5 соответствовало контролю.
Прививочный материал с 1% паразитамии в 1×107 эритроцитов/мл, в количестве 0,2 мл на мышь (самки мышей линии ТО), вводили внутривенной инъекцией. Назначение лекарственного препарата начинали через 2 ч на день 1 и продолжали в течение 3 суток. Внизу приведены результаты для всех пленок крови от всех 20 мышей, отобранные на день 5, когда определяли паразитамию.
В аналогичном режиме мышей прививали раствором, содержащим 1×107 эритроцитов/мл способом внутривенной иниъекции. Спустя два часа в/в инъекцией вводили данный лекарственный препарат. BrEA или другое соединение формулы 1 вводили (0,2 мл в/в или п/к) один раз в день в течение 4 суток. Для получения крови после окончания опыта использовали кусочки хвоста. Для получения инфицированных клеток использовали мышей, инфицированных Р.Berghei. Паразитов отбирали из крови сердца мышей и неинфицированных мышей инфицировали в/в введением 0,2 мл крови, содержащей 14% паразитамии на мышь. Через два часа инфицированным животным вводили первую дозу BrEA (100 мг/кг в/в или п/к). Состав BrEA представляла собой стерильный раствор, содержащий 15 мг/мл BrEA в 45% гидроксипропил-β-циклодекстрине и 0,9% физиологическом растворе. На 1, 2, 3 и 4 дни после инфиирования животных, инфицированным животным вводили BrEA (100 мг/кг в/в или п/к). В группе, получавшей в/в BrEA ни одно животное не погибло на 30 день, тогда как в контроле все животные погибли до 10 дневного срока. Все животные, пролеченные BrEA с п/к введением, были мертвы к 11 дню.
Пример 8. Крысы в опытах in vitro и in vivo. В режиме in vitro концентрации паразита {Plasmodium falciparum, чувствительный к хлорохину штамм WT и устойчивый к хлорохину штамм Dd2) устанавливали равными 1% и, с применением среды, гемокрит устанавливали на уровне 7%. Используя пластинки с 96 ячейками, 50 мкл паразита и 100 мкл лекарственного препарата, смешанного со средой, добавляли в каждую ячейку и таковую процедуру повторяли трижды. Пластину помещали в отсек, содержащий физиологическую смесь газов и инкубировали при 7°С. Смесь среды/лекарственного препарата меняли через 24, 48 и 72 ч. На день 5 (96 часов) были сделаны слайды с каждой ячейки, окрашены Gemsia и для каждой ячейки было просчитано по 500 красных кровяных клеток. Данные трех проб усредняли и представляли данные в виде процента ингибирования.
В режиме in vivo крысам Lewis с массой 80-85 г делали стандартную интраперитонеальную инъекцию паразита (Plasmodium berghei). Затем, через два часа, крыс внутривенно инъецировали одним из лекарственных препаратов, описанных в таблице внизу, возвращали в клетки, кормили стандартным лабораторным кормом и обеспечивали свободный доступ к воде. Животных взвешивали и снова обрабатывали через 24, 48 и 72 ч после первой обработки и снова возвращали в клетки, где им обеспечивали свободный доступ к корму и воде. Животных снова взвешивали и отбирали кровь, используя иглу 26 толщины на 5, 11 и 28 день после прививки. Замеряли гемокрит и готовили мазки крови от каждой крысы. Затем мазки крови окрашивали Gemsia и определяли степень паразитамии (определенную как процент красных кровяных клеток с паразитами). Животных затем снова возвращали в клетки и наблюдали два раза в день на наличие прогрессирования заболевания, о чем судили по апатичности и побочному действию лекарственного препарата, которое определяли по 20% потере начального веса тела в течение 28 суток. Если были отмечены или развитие болезни, или побочное действие лекарственного препарата, животных умервщляли.
Состав BrEA представлял собой стерильный раствор, содержащий 15 мг/мл BrEA в 45% гидроксипропил-β-циклодекстрине и 0,9% физиологическом растворе.
Внутривенные инъекции были сделаны на 0, 1, 2 и 3 дни и результаты приведены ниже. Результаты указывают на то, что лечение in vivo составом, содержащим BrEA, снижают паразитамию до уровней, сравнимых с уровнями, которые можно наблюдать для хлорохина («Хл») контроль. Результаты приведены ниже.
% RBC паразитамия (RBC - красн.кров. кл.)
День 4
% RBC паразитамия
День 11
Пример 9. Клинические исследования на человеке - паразитарная инфекция. Реакцию инфицированных пациентов на лечение лекарственным препаратом определяли по критерию Мировой организации здравоохранения (WHO, 1973). Оценку терапевтической реакции определяли по времени исчезновения паразита и лихорадки. Время исчезновения паразита выражали в виде трех индексов: время, необходимое для падения титра паразита на 50% от базового (до лечения) уровня (ПИ50), (ii) время, необходимое для падения титра паразита на 90% от базового уровня (ПИ90), и (iii) время, необходимое для падения титра паразита ниже уровня микроскопического обнаружения (время исчезновения паразита ВИП (N.J.White and S.Krishna Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 83:767-777, 1989; White et al., J. Infect. Dis. 165:599-600, 1992; White et al., J. Infect. Dis. 166:1195-1196, 1992). Время исчезновения лихорадки определяли как время от назначения лекарственного препарата до того, как оральная или ректальная температура упадет до или ниже 37,2°С и останется на этом уровне, по меньшей мере, 48 ч.
У двух пациентов отбирали венозную кровь до лечения и через 4, 6, 8, 12, 18, 20, 24, 30 и 36 часов после лечения или через 4- или 6-часовые интервалы после лечения, до момента полного исчезновения периферической паразитамии. Кровь отбирали асептически и переносили в 10 мл шприцы, содержащие 2 мл кислой цитратдекстрозы (ACD) для культивирования in vitro. До начала инкубации плазму отделяли от красных кровяных клеток и красные кровяные клетки дважды промывали. Паразиты культивировали по модифицированной стандартной методике культивирования in vitro (W.Trager and J.B.Jensen, Science 193:673-675, 1976; A.M.Oduola et al., J. Protozool. 39:605-608, 1992). Через 10 минут после отбора пробы помещали в стерильные центрифужные пробирки и центрифугировали. Супернатальную плазму хранили, тогда как осевшие клетки дважды промывали средой культивирования (среда для промывки, среда RPM1-1640, содержащая 25 мМ буфера HEPES и 25 мммоль/л NaOH). Светлый слой кровяного сгустка удаляли вакуумной аспирацией. Каждую пробу крови разбавляли 1 к 10 полной средой для промывки (СМР (среда для промывки, подкрепленная 10% человеческой плазмы)). По 1 мл из каждой пробы переносили в 2 ячейки из 24 на микрокультуральной пластине. Культуры инкубировали при 37°С в атмосфере, содержащей предварительно смешанные газы: 5% CO2, 5% O2 и 90% N2. Среду культивирования меняли ежедневно и через 24 и 48 часов после начала культивирования для микроскопирования готовили тонкие мазки крови. В том случае, если доля зараженных паразитами красных кровяных клеток была более 2%, пробы из культуры разбавляли промытыми, свободными от паразитов Rh-положительными красными кровяными клетками.
Микроскопичекие исследования. Во время проведения опытов in vivo тонкие и толстые пленки крови фиксировали соответственно дегидратированным метанолом (100%) и нагреванием, окрашивали 10% Giemsa в течение 20 минут. Паразитамию подсчитывали на тонких пленках, просчитывая по 2000 красных кровяных клеток на прозрачных смежных полях зрения и определяя часть клеток, которая оказалась зараженной. На толстых пленках паразитамию подсчитывали по отношению к лейкоцитам. Пленку считали отрицательной, если не было обнаружено паразитов после просмотра 200 полей зрения микроскопа толстого мазка. Во время проведения опытов in vitro и ex vivo предварительно обработанные толстые и тонкие мазки были градуированы по стадиям кольца, способом Jiang в модификации Li et al. (J.B.Jiang et al, Lancet 2(8293):285-288, 1982; К.Silamut and N.J.White Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87:436-443, 1993; X.L.Li et al, Chi. J. Parasitol. Dis. 12:296, 1994). Приблизительно по 5000 эритроцитов было просчитано на прозрачных смежных полях зрения через 24 и 48 ч инкубации крови, полученной в каждый из интервалов времени, и классифицированы (рассортированы) по зрелости на миниатюрные кольца, маленькие кольца, большие кольца, пигментированные трофозоиды и шизонты. Функциональная жизнеспособность была определена в виде процента неполовых кольцевых форм, способных к созреванию до пигментированных трофозоидов или шизонтов после 24-48 часов культивирования in vitro (W.M.Watkins et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87:75-78, 1993).
Обсчет параметров.
Пациенты имели четкую, острую, не церебральную малярию Р. Falciparum, с ярко выраженными симптомами. У них была оральная непереносимость жидкостей, температура тела более 39°С, более чем по 5000 паразитов в микролитре крови, неполовая паразитамия и отрицательный анализ на содержание антималярийных препаратов в моче. Каждые четыре часа, им внутривенно назначали по 25 мЛ BrEA, суспендированного в стерильном 45% β-циклодекстрине в физиологическом растворе при концентрации 25 мг/мл. Такой режим проводили в течение 4 суток. Определение паразитамии и клинические исследования проводили каждые 6 часов в течение первых 72 ч, затем параметры определяли ежедневно вплоть до 7 дней (168 часов) и затем на 14 сутки.
Пленки крови окрашивали Giemsa и определение паразитамии проводили на толстых пленках путем просчета 2000 паразитов против лейкоцитов, а на тонких пленках путем нахождения пропорции инфицированных красных кровяных клеток. Реакция на лечение лекарственным препаратом была оценена в соответствии с критериями ВОЗ. Определение терапевтического действия было проведено с применением времени освобождения от паразитов и лихорадки. Освобождение от паразитов выражали в виде трех индексов: время, необходимое для падения титра паразита на 50% от базового (до лечения) уровня (ПИ50), (ii) время, необходимое для падения титра паразита на 90% от базового уровня (ПИ90), и (iii) время, необходимое для падения титра паразита ниже уровня микроскопического обнаружения (время исчезновения паразита ВИП).
Время исчезновения лихорадки определяли как время от назначения лекарственного препарата до того, как оральная/ректальная температура упадет до или ниже 37,2°С и останется на этом уровне больше 48 часов. Уровень освобождения от паразита был 100% на 14 день. Таким образом, клиническая реакция включала воздействие на паразитамию у обоих пациентов и улучшение одного или более симптомов инфекции.
Внутривенные испытания BrEA на пациенте с малярией
Пример 10. Опыты на клетках in vitro. Влияние BrEA на шунтирующую активность пентосефосфата (PPS) в нормальных человеческих красных кровяных клетках (RBC) исследовали, использую интактные клетки. Поскольку глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6PD) является лимитирующим энзимом для PPS, посчитали, что текущие измерения PPS будут лучше отражать активность G6PD в интактной клетке по сравнению с активностью G6PD, замеренной в лизированных клетках. Активность G6PD, измеренная в лизированных клетках обычно в 1100 раз выше, чем текущие измерения PPS в интактных, спокойных, непростимулированных RBC (активность G6PD в лизированных клетках: 165; текущие измерения PPS 0,142 микромолей/час/мл RBC). Текущие измерения PPS и активность G6PD в целых RBC зависит от целого ряда факторов (концентрации НАДФ, НАД и АТФ и внутриклеточных значений рН), которые поддерживаются на постоянном уровне, если измерения проводят на лизированных клетках и могут изменяться в интактных RBC. Уровни активности G6PD в клетках значительно ниже нормальных базовых потребностей и полное ингибирование активности G6PD может оказывать незначительное или не оказывать воздействия на текущие показатели PPS в интактной клетке. Например, RBC со средиземноморским мутантом G6PD, обладающим 1-3 процентами остаточной активности по сравнению с нормальными индивидуумами, не имеет отрицательного влияния на базовый текущей уровень PPS, но показывает его нарушение в том случае, если PPS простимулирован добавлением метиленового синего. Была проведена серия опытов с применением различных количеств BrEA и были замерены текущие значения PPS на непростимулированных базовых RBC и в простимулированных метиленовым синим RBC.
Нижеприведенные данные показывают текущие (значения) PPS (микромолей/час/мл RBC) в базовых, непростимулированных и простимулированных метиленовым синим RBC. Различные концентрации BrEA (0,3, 3,5 и 7 микромолей, в качестве конечной) были добавлены к суспензии промытых RBC, суспензированных в RPMI, рН 7,4 при 10% гематокрите, в которых сразу же, без последующей инкубации и последующих промываний, замеряли текущие PPS. Незначительное ингибирование простимулированных МС текущих (значений) PPS наблюдали с BrEA при концентрации 7 μM.
Приведенные ниже данные показывают средние значения для 3 опытов, в которых базовый уровень непростимулированной и простимулированной МС текущий PPS (микромолей/час/мл ККК) был измерен в нормальных RBC. В этих опытах различные концентрации BrEA (0,8, 8 и 80 мкмолей, в качестве окончательной) добавляли к суспензии промытых RBC, суспензированных в RPMI, рН 7,4 при 10% гематокрите. После 90-минутутной инкубации при 37°С с добавлением и без добавления BrEA, измеряли текущую PPS. Результаты указывают на зависящее от дозы ингибирование простимулированного МС текущего PPS. Ингибирование составило 10% при 8 микромолях (р=0.006 vs контроль + DMSO) и 25% при 80 мкмолях (р=0.002 vs контроль + DMSO).
Пример 11. Ингибирование роста паразитов. Было показано влияние Epi (16α-бромо-эпиандростерона) на рост паразита (Plasmodium falciparum). Epi было активным при концентрации 1 μM.
Паразитемию определяли стандартными способами (микроскопическое иссследование по меньшей мере 500 клеток, окрашенных Diff-Quick™ (Baxter). Паразитов культивировали в стандартных условиях в RPMI-1640 с добавлением Hepes/глюкозы (10 мМ), глютаминута (0,3 г/литр) и 10% человеческой плазмы. Гематокрит был равен 1%.
Пример 12. Стимуляция фагоцитоза. Способность BrEA воздействовать на фагоцитоз инфицированных паразитарным Plasmodium RBC исследовали с применением закрепленных человеческих моноцитов. Уровень паразитамии был примерно 8-10%, а человеческие моноциты получали из светлого слоя кровяного сгустка, как описано ниже. Мононуеклеарные клетки периферической крови выделяли из свежеотобранного безбляшкового светлого слоя кровяного сгустка, выделенного из образцов крови здоровых взрослых доноров обоего пола. Выделенные клетки единожды промывали чуть теплой PBS с добавлением 10 мМ глюкозы (PBS-G) и ресуспензировали по 5×106 клеток/мл в ледяной среде RPMI 1640 с добавлением 23 мМ NaHCO3 и 25 мМ Hepes, рН 7,4 (RMBH). К клеткам, на 20 минутут при 4°С, добавляли Dynabeads M450 Pan В и Pan Т (Dynal) в пропорции 4:1. В-лимфоциты и Т-лимфоциты удаляли, так как этого требует инструкция производителя. Оставшиеся моноциты дважды промывали в RMBH, ресуспензировали в среде для культивирования клеток AIM V (Gibco) при 1×106 клеток/мл. Отбирали слой, содержащий моноциты, промывали PBS-G при 37°С и ресуспензировали в среде AIM V при 1×106 кл/мл. Очищенные таким образом клетки были моноцитами более чем на 90%, что определяли по экспрессии CD14.
Фагоцитоз опсонизированных, зараженных паразитами RBC (РЕ) определяли следующим образом. Фагоцитоз только что взятых из сыворотки опсонизированных РЕ инициировали, смешивая 10 РЕ/моноцит. Для улучшения контакта между РЕ (зараженными паразитами эритроцитами) и моноцитами, суспензию короткое время центрифугировали (150×g в течение 5 сек при комнатной температуре). Для предотвращения склеивания моноцитов после центрифугирования и во время всего инкубационногго периода, клетки поддерживали в суспензированном состоянии при 5×106 кл/5 мл в среде AIM V в тефлоновых чашках диаметром 6 см (Heraeus) во влажном инкубаторе (95% воздуха, 5% CO2) при 37°С. В среднем, по меньшей мере, 90% моноцитов фагоцитировали РЕ, как это было определено проверкой под микроскопом. Контрольные клетки содержали в аналогичных условиях без фагоцитоза.
Количественная оценка фагоцитоза проведена описанным ранее биолюминисцентным способом (Е.Schwarzer, et al., Br. J. Haematol. 1994 88:740-745).
Обработки эритроцитов и культуры паразитов были следующими. Для выделения эритроцитов (RBC) использовали (Rh+) свежую кровь. Промытые RBC инфицировали паразитами на стадии шизонт/трофозоид (свободным от микоплазмы штаммом Palo Alto). Определенные стадии паразитов выделяли способом Percoll-mannitol. Вкратце, нормальные, зараженные паразитом на стадии шизонта RBC (SPE), выделенные по градиенту Percoll-mannitol, (паразитамия >95% SPE) смешивали с RBC суспензированными в среде для выращивания (среда RPMI 1640, содержащая 25 ммоль/л Hepes, 20 ммоль/л глюкозы, 2 ммоль/л глютаминута, 24 ммоль/л NaHCO3, 32 мг/л гентамицина и 10% человеческой сыворотки АВ или А, рН 7,30) для того, чтобы начать культивирование синхронизированных культур при выбранных уровнях гематокрита. Прививочную паразитамию устанавливали на уровне 20% нормальных SPE, для выделения зараженных паразитами на стадии кольца RBC (RPE), и в 5% нормальных SPE, для выделения зараженных паразитами на стадии трофозоида RBC (ТРЕ). Через 14-18 часов после прививки паразиты находились на стадии кольца первого цикла, через 34-33 ч паразиты находились на стадии трофозоида первого цикла и через 40-44 ч после прививки паразиты были на стадии шизонта первого цикла. RPE, ТРЕ и SPE выделяли по градиенту Percoll-mannitol. Паразитамия обычно была 8-10% RPE и >95% ТРЕ. Незараженные и зараженные паразитами RBC просчитывали электронным способом. Для оценки полной паразитамии и относительной доли в ней RPE, ТРЕ и SPE в указанные сроки из культуры готовили слайды, окрашивали красителем для паразитов Diff-Quik™ и просматривали под микроскопом около 400-1000 клеток.
Воздействие соединений формулы 1, таких как BrEA в зараженных паразитами RBC исследовали с применением различных концентраций соединения, например, BrEA, например 0,5 μМ, 1 μМ, 25 μM и 50 μМ. Зараженные паразитами на стадии трофозоида RBC, зараженные паразитом на стадии шизонта RBC или зараженные паразитами на стадии кольца RBC исследовали, как это описано выше.
Пример 13. Клинические испытания на малярии человека. Был разработан режим клинических испытаний, который включал около 15-20 пациентов. На стадиях режима I, I/II или II пациентов в незначительной степени инфицировали одним или более паразитом рода Plasmodium и они показывали слабые симптомы заболевания (паразитамия менее 8-10% RBC). До начала опытов пациентов факультативно исследовали на инфекции HIV, HCV, ТВ и Cryptosporidium. Пациентам с одной или более совместной инфекцией проводили стандартное лечение совместной инфекции. Для лечения пациенты были госпитализированы в течение 1 недели. Одну или две группы доз, например 25, 50 или 100 мг/день BrEA, назначали парентерально, например, внутримышечной, подкожной или внутривенной инъекцией на 3, 4 или 5 день той недели, когда пациентам вводили дозы. Дозирование проводили каждый день или по дробному графику, например 2, 3 или 4 дозы при одной дозе, назначаемой через день.
Состав, содержащий BrEA, был таковым, как здесь описано, например, состав примера 1 или состав, который содержал 100 мг/мл BrEA, ПЭГ300 ˜30% об/об, пропиленгликоль 30% об/об, бензилбензоат 30% об/об и бензиловый спирт 2% об/об. На 5-7 день, если наблюдаемое снижение паразитамии было меньше 50%, пациентам проводили стандартное лечние от малярии (мефлохин). Во время недели лечения и в течение 1, 2, 3 или более недель после, периодически брали анализы крови для определения паразитамии, фармакокинетики, плазменных цитокинов (например, IL-2, IL-4, IL-10, IGF1, γIFN, GM-CSF), и внутриклеточных цитокинов (например, IL-2, IL-4, IL-10, IGF1, μIFN, GM-CSF). Факультативно, примерно через 2-12 недель после начальных дозировок, пациентов лечили повторно с применением аналогичного режима, который использовали в начальном режиме дозировок.
Было проведено примерное открытое изучения состава BrEA, назначаемой внутримышечно пациентам с частичным иммунитетом, имеющим неосложненную малярию. Состав содержал 100 мг/мл BrEA, ПЭГ300 ˜30% об/об, пропиленгликоль 30% об/об, бензилбензоат 30% об/об и бензиловый спирт 2%. Пациенты будут оставаться в госпитале в качестве постоянных пациентов в течение первых 7 дней исследования. Пациенты будут получать одну внутримышечную инъекцию 50 мг или 100 мг BrEA ежедневно в течение 5 следующих друг за другом суток. Ежедневные анализы в течение первых 7 дней и вплоть до 14 дня опытов могут включать определение паразитамии (дважды в день), химии, гематологии и уровней лекарственного препарата (фармакокинетические анализы). Если после 7 дня опытов наблюдаемые уровни паразитамии снизятся, и пациент будет клинически стабилен, пациента могут перевести на дневное наблюдение по паразитамии (дважды в день) в течение еще до 7 дней в качестве находящегося в госпитале пациента. Если же, в любой промежуток времени во время опытов, пациент станет клинически нестабильным, опыты будут прерваны и пациенту могут предложить стандартное лечение малярии. Пациенты с дефицитом энзима глюкозо-6-фосфатной дегидрогеназы могут быть исключены, так как BrEA ингибирует этот энзим. Другие обстоятельства, которые могут привести к исключению пациентов из режима, включают пациентов, имеющих один из следующих диагнозов: сильная анемия (гематокрит <21% или гемоглобин <7 г/дл), почечная или печеночная недостаточность в анамнезе и/или по результатам анализов, респираторными нарушениями, о чем свидетельствует диспнея или уровень дыхания ≥30 в минуту, гипертония (систолическое давление крови <90 мм ртутного столба), тахикардия (сердечный ритм >130 ударов в минуту), беременность или кормление грудью у женщин, в значительной степени активные параллельные заболевания (острые медицинские диагнозы, требующие специального лечения, пациенты с паразитамией мазков периферической крови >10%.
Образцы крови, для дальнейшего клинического определения маркеров активации или иммунологического анализа (например, анализ на внутриклеточные или внеклеточные интерлейкины IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, γIFN и TNFα), могут быть взяты от каждого пациента.
Пример 14. Приготовление липосом. Липосомы, подходящие для парентерального назначения, готовят следующим образом. 400 мг фосфатидилхолина и 80 мг BrEA растворяют в хлороформе и метаноле (2 к 1 об/об) и раствор высушивают испарением с перемешиванием при пониженном давлением. Полученную в результате этого пленку, регидратируют добавлением 8,0 мл 0,9% м/об раствора NaCl и встряхиванием раствора. Факультативно измеряют размер липосом, например, фотонной корреляционной спектроскопией (Malvern Zetasizer 3000 или ее эквивалентом). Для снижения среднего размера меньше 400 мн, липосомы факультативно нормируют по величине, например, сонификацией или фильтрацией, используя подходящие фильтры. Сходные процедуры используют при подготовке липосомных препаратов, которые содержат соединение формулы 1 в количестве 15-100 мг/мл. Состав используют для орального или парентерального введения соединения (например, внутримышечно, подкожно, внутривенно).
Пример 15. Приготовление циклодекстрина. Содержащие BrEA циклодекстриновые составы готовят следующим образом. 45 г гидроксипропил-β-циклодекстрина добавляют к 1 л стерильного физиологического раствора и смесь перемешивают в течение 4-24 часов до получения прозрачного раствора. Для получения концентрации 20 мг/мл добавляют не микронизированную BrEA и смесь перемешивают до получения прозрачного раствора. Смесь стерилизуют путем фильтрации с применением фильтра с размером пор 0,2 μм и переносят в стерильные контейнеры. Схожие процедуры применяют для приготовления циклодекстринового состава, который содержит соединение формулы 1 в концентрации примерно 15-100 мг/мл. Состав используют для назначения препарата орально, парентерально (внутримышечно, подкожно, внутривенно), или буккально, или способом под язык.
Пример 16. Приготовление суппозиториев. Состав, содержащий соединение формулы 1, такое как BrEA, в виде супозиториев готовят следующим способом. Отмеряют достаточное количество немикронизированной BrEA, для того чтобы получить желаемое количество суппозиториев, которые содержат по 500 мг BrEA каждое. Для получения желаемых характеристик, например, содержания свободных жирных кислот около 0,1% м/м, уровня омыляемости около 242, содержания йода примерно 3, влажности примерно 0,1% м/м и точки плавления в закрытом капилляре около 35°С, BrEA смешивают с основой суппозитария, например, триглицеридом из съедобных растительных масел.
Пример 17. Клиническое лечение HCV человека. Пациентку женского пола, инфицированную HIV и HCV, три дня подряд внутривенно дозировали BrEA, используя состав, который содержал 20 мг/мл BrEA в 45% м/об гидроксипропил-β-циклодекстрине и физиологическом растворе. По 4 мл состава (80 мг BrEA) пациентке назначали каждые 4 ч в течение 3 дней лечения. Измеренный на PCR уровень HCV у пациентки до дозировок был 6,5 Log10, уровень HCV на первый день дозирования был 6,2 Log10, на 3й день дозирования 5,5 Log10 и через три дня после того, как была введена последняя доза 4,9 Log10. Уровни РНК HIV, определенные при помощи PCR, были 5,2 Log10 (до дозирования), 5,8 Log10 (первый день), 5,9 Log10 (третий день) и 5,4 Log10 (день 6). Титр NK клеток (кл/мм3) был 28,41 и 38 до дозирования, день 0 и день 3.
Пример 18. Состав. Состав, содержащий 100 мг/мл BrEA, ˜30% об/об ПЭГ300, 30% об/об пропиленгликоля, 30% об/об бензилбензоата и 2% об/об бензилового спирта, был приготовлен суспензированием BrEA в полиэтиленгликоле 300 и последовательным добавлением пропиленгликоля и бензилбензоата для образования раствора, который разбавляли до окончательного желаемого объема добавлением пропиленгликоля. Процедура описана ниже.
Расчетное количество полиэтиленгликоля 300 добавляли в сосуд для смешивания. Затем, при перемешивании, в сосуд добавляли расчетное количество BrEA и перемешивали в течение, по меньшей мере, 5 минутут до образования гладкой, кремообразной жидкости, пропиленгликоль был добавлен в сосуд и все это смешивали в течение, по меньшей мере, 5 минут для получения однородной суспензии. Расчетное количество бензилбензоата добавляли в сосуд и смешивали в течение примерно 5 минут для получения прозрачной жидкой суспензии. Пропиленгликоль добавляли для получения желаемого конечного состава и смешивали в течение примерно 5 минут. Раствор лекарственного препарата переносили в аппарат, делящий на объемные части для разлива по 1,2 мл в ампулу. Под давлением азотом раствор фильтровали через два 0,2 μМ поливинилиденовых флюоридных фильтра один за другим в 2 сс ампулы желтого стекла. Ампулы запечатывали покрытыми тефлоном крышками из бутиловой резины и опечатывали вкруговую.
Пример 19. Клинический режим лечения условно-патогенных инфекций. Двойное, случайное, слепое, контролируемое плацебо изучение внутримышечного назначения 100 мг BrEA на последней стадии HIV инфицированного пациента при риске оппортунистических инфекций (ОИ). HIV-1 серопозитивные пациенты с титром CD4 клеток ≤100 кл/мм3, РНК HIV в 1×106 копий/мл и счете по Kamofsky, по меньшей мере, 60, были выбраны для потенциального включения в режим. Пациенты во всех клинических режимах должны были понять и подписать форму письменного информированного согласия до начала отборочных анализов.
В составе из примера 16 была использована BrEA. Назначение лекарственного препарата или носителя должно происходить в течение от 3 до 5 следующих друг за другом суток, за чем следует около 35-90 дней наблюдения, например 37 дней наблюдения. Пример режима лечения включает 5 дней лечения, за которыми следует 37 дней наблюдения, что повторяют до общего количества в 7 курсов в течение 42 недель. Уровень падения ОИ, так же как и время до решения (проблемы) или контроля над ОИ определяют и сравнивают с контрольной группой (получающей) плацебо. Для гарантии за пациентами можно наблюдать ежемесячно в течение 2 или 3 месяцев после завершения исследований. Наблюдаемое уменьшение ОИ или состояний, связанных с ВИЧ, например, таких как туберкулез (ТБ), кандидиоз, Pneumocystis pneumonia (PCP), диарея, или саркома Капоши, можно считать режимной границей. Если пациент диагностируется одной или более режимной специфической оппортунистической инфекцией, по режиму может быть начато режимное лечение ОИ, например, флюконазолом для кандидоза или в случае PCP, триметопримом и сульфаметоксазолом или дапсоном. Сходные режимы используют с другими соединениями формулы 1.
Example 20. Пример 20. Клинический режим для HIV человека. Пациентов, инифицированных HIV, дозируют внутримышечными инъекциями 25-200 мг BrEA, используя состав, содержащий 100 мг/мл BrEA, ПЭГ300 ˜30% об/об, пропиленгликоль 30% об/об, бензилбензоат 30% об/об и бензиловый спирт 2% об/об. Пациентов дозируют один раз в день в течение 5 следующих друг за другом суток, за чем следует период времени (продолжительностью) 28 дней или дольше, без лечения BrEA. Затем пациентам обеспечивают еще один курс в течение 5 последовательных дней дозирования BrEA, за чем следует период без дозирования в течение, по меньшей мере, 28 суток. Обеспечивают до 5 курсов лечения по 5 дней с последующими 28 днями без дозирования. Затем, используя пробы крови или плазмы пациентов, методом поточной цитометрии и другими известными методами анализа, исследуют иммунологическую реакцию. Подклассы иммунных клеток или другие измеряемые маркеры анализируют в течение 24 часов после получения пробы от каждого пациента. Меченые антитела, например, анти CD антигенные антитела, конъюгированные с флюоресцентными красителями (FITC, фикоэритрин, аллофикоцианин или PerCP) готовят и используют в соответствии со стандартными способами, используя коммерчески доступные реагенты, см., например, PharMingen, 1998 Research Products Catalog, technical protocols на стр.732-774, human cell surface molecules на стр.182-295 and mouse, rat and hamster cell surface molecules на стр.2-173 and cytokine and chemokine reagents на стр.344-489.
Клинический режим представляет собой открытое, со стадиями 1/11, случайное изучение 3 уровней дозировок BrEA, назначаемых внутримышечно HIV-инфицированным пациентам, которые ранее лечения не получали. Следует иметь (разные) 3 группы лечения, а каждая труппа состоит их двух подгрупп (подгруппа А и подгруппа В). Пациенты из подгрупп А и подгрупп В будут получать во время исследования одинаковые дозы BrEA. Если пациенты в результате лечения, полученного в течение исследований в подгруппе А и подгруппе В, ощущают антивирусную реакцию (титр РНК HIV по меньшей мере на 0,5 log ниже среднего наблюдаемого и базового уровней), или улучшение (любое уменьшение титров РНК HIV ниже среднего наблюдаемого и базового уровней), то пациенты могут продолжать получать 5-дневные курсы лечения составом BrEA из примера 2 в дозах, которые они получали первоначально. Такой курс лечения может быть повторен вплоть до 6 раз.
Во время исследоний всех пациентов можно проверять на уровни РНК HIV (Chiron Quantiplex™ анализ разветвленных цепей ДНК), подгруппы Т клеток, [CD4/CD8], провирусные HIV ДНК (РВМС), интерлейкины [IL-2, 4, 6, 8, 10, и 12] (сыворотка), γIFN (сыворотка), аналогичный инсулину фактор роста [IGF-1] (сыворотка) и фактор некроза опухоли [TNF] (сыворотка). Можно проводить количественное РВМС совместное культивирование (клетки) на подгруппе из пробы от пациента. Можно проводить анализы на дополнительные маркеры активации. Планируются анализы по спискам химиии и гематологии и анализ мочи. Дополнительно, пациентов, совместно инфицированных вирусами гепатита В и/или С, малярией или туберкулезом, можно регулярно наблюдать по титру вируса или микробиологическим культурам. Серийные пробы крови и мочи можно отбирать у подгруппы пациентов для фармакокинетических определений после первого дозирования в подгруппе А и после последнего дозирования в подгруппе В.
Лечение может состоять более чем из одной внутримышечной инъекции. Внутримышечные инъекции можно назначать в разные точки (например, правое или левое плечо, бедро или ягодицы) и однократная доза в 100 мг или 200 мг BrEA может быть введена пациентам в виде двух или более поддоз, меньших чем 100 мг (например, 50 мг).
В данном исследовании рассматривается два раздела, раздел 1 и раздел 2. Оба раздела, состоят из двух частей, части А и части Б. Первые 12 пациентов, вовлеченных в исследование будут участвовать в плане, описанном в разделе 1. Оставшиеся 24 пациента будут участвовать в исследовании в разделе 2. Далее представлен план каждого раздела.
Часть А будет заключатся в однократной внутримышечной инъекции состава BrEA. День, когда пациент получает инъекцию, будет днем 1 исследования. Пациенты, находящиеся в фармакокинетической подгруппе будут сдавать серийные анализы крови и мочи, начиная с 1 дня исследования. Часть В исследования начинается на 8 день исследования (Раздел 1) или на 15 день исследования (Раздел 2).
Часть В раздела 1 заключается в 5 следующих друг за другом внутримышечных инъекциях составов из примера 1 в тех же дозах, какие получали в части А исследования. День, в который пациент получает первую дозу, будет примерно 8-12 днем исследований. За 5-дневным курсом лечения следует примерно 28-дневный период наблюдения (или приблизительно 32 дня, от первой дозировки на 8 день до начала второго курса лечения на 40-й день). Во время периода наблюдения, пациентов просят возвращаться в клинику еженедельно для различных анализов. Пациенты, входящие в фармакокинетическую подгруппу, будут сдавать серийные анализы крови и мочи, начиная примерно с 12-17 дня исследований.
Раздел 2 части В заключается в 5 следующих друг за другом ежедневных внутримышечных инъекциях состава из примера 2 в той же дозе, какую получают пациенты в части А исследований. День, когда пациенты получают первую дозу, будет примерно 15 днем исследований. За 5-дневным курсом лечения следуют приблизительно 45-дневный период наблюдения (или приблизительно 49 суток, после первого дозирования на 15 день, до начала следующего курса на 64 день исследования). Во время периода наблюдений, пациентов просят навещать клинику еженедельно для различных анализов. Пациенты, входящие в фармакокинетическую подгруппу, будут сдавать серийные анализы крови и мочи, начиная примерно с 19 дня исследований.
Обеспечение выборочности в данном исследовании на повышение доз производят следующим образом. Если 4 из 12 пациентов в группе завершают 5-дневный курс ежедневного дозирования по части В и не ощущают серьезных, связанных с лекарственным препаратом, отрицательных явлений, после проведения консультаций спонсора и исследователей, происходит их перевод на следующий, более высокий уровень доз.
Первые 4 пациента, включенные в исследование, будут зачислены в группу с 50 мг дозами. Если (они) не ощущают отрицательных явлений, следующие 8 субъектов будут случайным образом зачислены либо в 50 мг, либо 100 мг дозовую группу в соотношении 1:2. Если у пациентов, получающих 100 мг, не происходит никаких серьезных, связанных с лекарственным препаратом, отрицательных явлений, тогда следующих 24 пациентов случайным образом распределяют в одну из групп, получающих 50, 100 или 200 мг в соотношении 1:2:3.
Если 4 из 12 пациентов в дозовой группе ощущают серьезные, связанные с лекарственным препаратом, явления (градация III или IV), на тот же самый уровень доз дополнительно записывают еще 2 пациентов. Помимо этого, перевод пациентов на следующий уровень доз может быть временно приостановлен до достижения безопасности. Если один из 2 дополнительных пациентов чувствует серьезные, связанные с лекарственным препаратом явления, дозирование на данном уровне доз будет прекращено. После консультации спонсора и исследователей, дополнительные пациенты могут быть вовлечены в исследование доз в промежутке между лимитирующей группой по дозам и следующей группой по дозам, для определения максимально переносимой дозы (MTD). Включение дополнительных пациентов на определенный уровень доз будет определено в поправке режима.
Результаты показали, что однократная доза в 50 мг или 100 мг BrEA увеличивает количество активированных CD8+ и CD4+ Т клеток (например, CD8+, CD69+, CD25- клетки), которые циркулируют в крови пациента. Также увеличивается число циркулирующих предшественников дендритных клеток, NK клеток, LAK клеток и клеток, которые передают функцию ADCC (зависящую от антител, передаваемую клетками цитотоксичность, передаваемую подгруппами иммунных клеток CD8+, CD16-). Дальнейшее увеличение обычно наблюдают при дозировании в течение 5 следующих друг за другом суток.
Ниже некоторые результаты суммированы. Курсы 1, 2 и 3 относятся к каждому отдельному 5-дневному курсу лечения по одной ежедневной инъекции BrEA (50 или 100 мг BrEA на инъекцию) каждый день. На диаграммах внизу НЕ2000 относится к составу, содержащему 100 мг/мл BrEA, ПЭГ300 ˜30% об/об, пропиленгликоль 30% об/об, бензилбензоат 30% об/об и бензиловый спирт 2% об/об. Приведенные ниже данные были получены из проб крови пациентов при базовом уровне (в тот день, когда было начато дозирование) и в различное время после того, как пациенты получили, по меньшей мере, одну дозу BrEA. Результаты указывают на значительное увеличение популяции иммунных клеток и профилей экспрессии цитокинов, сявзанных с имунной реакцией Th1. Пациенты в данном режиме начально имели титры CD4, по меньшей мере, 200 на мм3 и нагрузку РНК HIV в сыворотке, равную 5,000 to 1×106 копий РНК/мл. После дозирования одним курсом BrEA (5 дней ежедневных внутримышечных инъекций), все пациенты показали увеличение уровней иммунных клеток, включая активированные CD8 Т клетки (например, CD8+, CD69+, CD25-), LAK клетки, (например, CD8+, СD16+, CD38+), NK клетки (например, CD8-, CD16+), ADCC клетки (например, CD8-, CD16+) и дендритные клетки (Lin-, HLA-DR+, CD11c+ или Lin-, HLA-DR+, CD123+). Производство CD4 IL-10 в среднем упало от среднего в 66% до 4% клеток, тогда как CD4 IFNγ перешло от среднего в 8% до 63%, что ведет с сдвигу производства цитокинов от Th2 к Th1.
В нижеприведенных диаграммах данные ниже базового уровня отмечены "BL" или "pre".
bПарные значения t теста
cТест неопределим на базовом уровне для пациентов, получивших второй и третий курсы, базовые уровни от начала 2го курса =6.4
d% CD4
eБазовые значения от 8 дня (представляют первые пять дней лечения) -
Пример 21. Лечение симптомов инфекции HIV. Два инфицированных HIV пациента с хронической диарреей были дозированы BrEA, как это описано ниже. Состав BrEA (40 мг/мл BrEA в 25% об/об ПЭГ 300, 12,5% об/об этаноле, 5% об/об бензилбензоате, ˜57,5% об/об пропиленгликоле) назначалась подкожно. Пациенты получили 60 мг BrEA по 1,5 мл ежедневно в течение 10 суток. Во время периода дозировок диаррея прекратилась. После окончания 10-дневного периода диаррея возобновилась. У других пациентов, получающих BrEA орально, диаррея также уменьшилась.
Пример 22. Подкожные составы. Состав BrEA готовили в основном так, как описано здесь. Состав, содержащий 50 мг/мл BrEA, 40% об/об ПЭГ, 2% бензилового спирта, 2% бензилбензоата и ˜66% об/об пропиленгликоля (qs). Состав в особенности хорош для подкожного введения соединения.
Пример 23. Приготовление полугидрата BrEA процедура 1. Исходную BrEA готовили бромированием эпиандростерона, за чем следовала кристаллизация из метанола. Полугидрат готовили путем растворения 25 г исходной BrEA в 75 мл дефлегмированного этанола при средней степени перемешивания. К раствору BrEA медленно добавляли 12,5 мл воды, поддерживая раствор в дефлегмированном состоянии перемешиванием. Раствор продолжали перемешивать и затем позволяли раствору остыть до примерно 20-25°С и хранили при 20-25°С в течение примерно 15 минут для получения суспензии кристаллов полугидрата BrEA. Кристаллы выделяли фильтрацией, промывали раствором 25 мл воды и этанола (5:1 об/об) при примерно 20-25°С и затем сушили под вакуумом примерно в течение 13 часов при 50-60°С до постоянного веса продукта. Преимущественно кристаллы были в форме палочек или иголочек с небольшим включением других форм, таких как таблетки.
Процедура давала возможность получить 22,5 г полугидрата BrEA (выход 90%) с содержанием воды 2,6% м/м, как определено методом KF, чистотой 100% по анализу HPLC, спектром FTIR с пиками карбонила при 1741 см-1 и 1752 см-1. FTIR сканирование BrEA показало единственный карбонильный пик при 1749 см-1. DSC сканирование показало три эндотермы. Одна имеет широкий, невысокий пик с началом при 109-110°С и заканчивающимся при 150°С. Этот широкий DSC пик согласуется с потерей воды кристаллами полугидрата при повышении температуры образца. Вторая эндотерма при примерно 83-100°С согласуется с потерей образцом небольшого количества остаточного этанола. DSC сканирование безводной BrEA не имеет широкой эндотермы, которая наблюдается у полугидрата. Также согласуется с потерей воды из полугидрата при температурах выше 100-150°С острый третий пик эндотермы при DSC сканировании полугидрата при примерно 163-164°С, который является точкой плавления безводной BrEA. FTIR получили, используя способ USP <197>, в котором образец полугидрата BrEA готовили на KBr. Термограмму DSC получили сканированием от 25 до 250°С при скорости нагрева 10°С/минут.
Пример 24. Приготовление полугидрата BrEA процедура 2. Полугидрат готовили растворением 10 г исходной BrEA в 40 мл дефлегмированного ацетона при умеренном перемешивании. К раствору BrEA медленно добавляли 4,0 мл воды, поддерживая раствор в дефлегмированном состоянии перемешиванием. При постоянном перемешивании раствора ему позволяли остыть до 20-25°С примерно в течение 15 минут для получения суспензии кристаллов полугидрата BrEA. Кристаллы выделяли фильтрованием, промывали раствором 6,0 мл вода: ацетон (10:1 об/об) при примерно 20-25°С и затем сушили под вакуумом в течние ночи (примерно 13-15 часов) при 50-60°С до постоянного веса продукта. Процедура давала выход 7,0 г полугидрата BrEA (выход 70%) с содержанием воды 2,6%, как это было определено KF анализом и FTIR спектром с пиками карбонила при 1741 см-1 и 1752 см-1.
Пример 25. Анализ размера частиц полугидрата BrEA. Кристаллы полугидрата BrEA готовили точно так, как здесь описано, и измеряли, используя аппарат для определения размера частиц (Malvern instruments). Была использована модель для полидисперсного образца и объемно распределительного типа. Анализ показал разброс размеров диаметров кристаллов от примерно 0,5 мкм до примерно 880 μм. Около 90% кристаллов имело диаметр примерно от 20 мкм до примерно 220 μм и большинство кристаллов имело диаметр примерно 30-200 мкм. Средний размер диаметра кристаллов был около 93 мкм. Удельная площадь поверхности кристаллов была примерно равна 0,25 м2/г.
Специалистам должно быть понятно, что различные описанные здесь специфические варианты реализации изобретения, соединения или составы, в еще не до конца установленной мере могут быть в дальнейшем модифицированы с тем, чтобы включить другие целесообразные признаки, например, как это показано на любом из конкретных вариантов реализации изобретения здесь или в цитируемых источниках.
Дополнительные примеры
Пример 26. Применение соединений формулы 1 для лечения воздействия ионизирующего излучения. Влияние отдельных соединений формулы 1 на выживание самок мышей B6D2F1, получивших летальную дозу облучения, сравнивали с контрольной группой животных, которым вводили только носитель. Животных подвергли полному облучению организма дозой до 10 Гр (Грэй) при 2,5 Гр/мин с помощью источника 137Cs. Всего использовали 5 групп по 12 животных в каждой группе. Группам 1, 2, 3 и 5 вводили опытный препарат в объеме 100 мкл путем подкожной инъекции в течение трех последовательных дней, при этом первую дозу вводили в течение 2-4 ч с последующим облучением. Группе 4 опытный препарат вводили в объеме 50 мкл путем внутримышечной инъекции в течение трех последовательных дней. Состав представлял собой суспензию, содержащую 0,1% м/об карбоксиметилцеллюлозы, 0,9% м/об хлорида натрия и 0,05% об/об фенола. Состав перемешивали, чтобы равномерно ресуспендировать соединение формулы 1 перед отбором в шприц, и вводили животным, в течение нескольких минут втягивая в шприц, чтобы предотвратить осаждение в шприце.
Группы животных лечили следующим образом. Группа 1 получала только носитель путем ежедневной подкожной инъекции в течение 3 последовательных суток. Группа 2 получала 0,6 мг в 100 мкл суспензии 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ена путем ежедневной подкожной инъекции в течение 3 последовательных дней. Группа 3 получала 3,0 мг в 100 мкл суспензии 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ена путем ежедневной подкожной инъекции в течение 3 последовательных суток. Группа 4 получала 0,6 мг в 50 мкл суспензии 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ена путем ежедневной внутримышечной инъекции в течение 3 последовательных суток. Группа 5 получала 0,6 мг в 100 мкл суспензии 3β-гидрокси-17β-аминоандрост-5-ена путем ежедневной подкожной инъекции в течение 3 последовательных суток.
За выживанием животных наблюдали в течение 21 суток после облучения и получили следующие результаты. Количество выживших животных указано ниже для дней 6, 7, 12 и 21. Результаты показывают, что соединения формулы 1 увеличивали процент выживания субъектов, доза ионизирующего облучения которых в противном случае являлась бы летальной и достаточной для индуцирования иммуносупрессии.
Пример 27. Применение соединений формулы 1 для лечения супрессии врожденного иммунитета, вызванной химиотерапией. Приматам вводили дозу карбоплатина, достаточную для подавления врожденного иммунитета у животных. Подавление врожденных иммунных реакций контролировали, определяя содержание нейтрофилов в различное время. Такой анализ использовали для определения влияния соединения формулы 1 на продолжительность и тяжесть нейтропении. Восьми группам макак циномолгус в возрасте 3,5-8 лет, весом примерно 2,5-8 кг, путем внутривенной инфузии вводили в течение 30 минут 35 мг/кг карбоплатина в стерильном растворе 10 мг/мл в 0,9% растворе хлорида натрия. Затем каждому животному вводили 1 раз в сутки выбранные соединения с формулой 1 в течение 5 последовательных дней, начиная со 2 суток после инфузии карбоплатина. Животные в контрольной группе 1 (4 животных - 2 самца и 2 самки) получали подкожно инъекцию 1,0 мл состава, не содержащего соединения формулы 1. Каждая из групп 2-7 включала по 3 животных (1 самец, 2 самки), и каждому животному вводили инъекцию указанного соединения объемом 1,0 мл. Инъекцию вводили подкожно в межлопаточную область спины, а животным группы 4 - внутримышечно в бедро (каждый день меняли бедро). Ниже указаны суточные дозы.
мг/кг
1
(4)
Контрольное
0
подкожно
0.9% м/об хлориды натрия,
0.05% об/об фенола
2
(3)
1
42.5
подкожно
карбоксиметилцеллюлозы,
0.9% м/об хлорида натрия,
0.05% об/об фенола
3
(3)
1
7.65
подкожно
карбоксиметилцеллюлозы,
0.9% м/об хлорида натрия,
0.05% об/об фенола
4
(3)
1
2.52
внутримышечно
карбоксиметилцеллюлозы,
0.9% м/об хлорида натрия,
0.05% об/об фенола
(3)
1
подкожно
глицерин
(3)
1
подкожно
7
(3)
2
2.55
подкожно
карбоксиметилцеллюлозы,
0.9% м/об хлорида натрия,
0.05% об/об фенола
** Соединение 1 - 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ен; соединение 2 - 3β-гидрокси-17β-аминоандрост-5-ен; контрольный состав не содержал соединения формулы 1.
Пробы крови объемом примерно 1-1,5 мл брали в следующие дни: 5 (до карбоплатина), 2 (до карбоплатина), 1 (базовый уровень), 3, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 24 день для анализа циркулирующих нейтрофилов до и после введения карбоплатина. Среднее содержание нейтрофилов для каждой группы на базовом уровне в 1 сутки до введения карбоплатина изменялось в пределах от 2830 нейтрофилов/мм3 до 4240 нейтрофилов/мм3. Этот анализ позволил определить эффективность применения соединений формулы 1 для снижения длительности и/или тяжести нейтропении. Результаты показали, что на 24 сутки среднее количество дней, когда животные группы 1 (контрольной) имели содержание нейтрофилов менее 500 нейтрофилов/мм3 и, соответственно, страдали тяжелой нейтропенией, составляло 5,25 суток. Животные группы 2 страдали тяжелой нейтропенией на 24 сутки в среднем 0,67 суток, животные группы 3 страдали тяжелой нейтропенией на 24 сутки в среднем 1,33 суток, животные группы 4 страдали тяжелой нейтропенией на 24 суток в среднем 4,67 суток, и животные группы 6 страдали тяжелой нейтропенией на 24 сутки в среднем 2,33 суток. В группах 5 и 7 ни одно животное не страдало тяжелой нейтропенией после введения карбоплатина. Эти результаты показали, что соединения формулы 1 способны смягчать или полностью предотвращать тяжелую нейтропению, связанную с иммуносупрессивной химиотерапией, у приматов.
В связанном с этим протоколе приматам вводили одноразовую инъекцию карбоплатина 35 мг/кг и установили, что дробное введение приматам 3β-гидрокси-17β-аминоандрост-5-ена один раз в неделю в количестве 4,2 мг/кг в течение трех недель дало практически такие же результаты, как наблюдавшиеся при суточном дозировании в течение 5 последовательных суток в количестве 2,5 мг/кг 3β-гидрокси-17β-аминоандрост-5-ена, несмотря на то, что суммарная доза соединения, использовавшаяся в обоих протоколах дозирования, была практически идентичной. Эти результаты показывают, что соединения формулы 1 можно эффективно использовать в протоколах дробного дозирования, при этом они сохраняют практически полную активность.
Пример 28. Применение соединений формулы 1 для лечения подавления врожденного иммунитета, связанного с воздействием ионизирующего излучения. Мышей подвергали облучению ионизирующим излучением с достаточной дозой для подавления врожденного иммунитета у животных. Подавление врожденных иммунных реакций контролировали, определяя содержание нейтрофилов. Такой анализ использовали для определения влияния соединения формулы 1 на продолжительность и тяжесть нейтропении. Несколько соединений формулы 1 включали 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ен, 3β,17α-дигидроксиандрост-5-ен, 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен, 3,17-диоксоандрост-4-ен, 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен-17-он, 3β-гидрокси-16α-бромо-5α-андростан-17-он, 16α-фторо-17α-гидроксиандрост-5-ен и 16α-фторо-17β-гидроксиандрост-5-ен. Мышам (самкам B6D2F1 или самцам С3Н/HeN) вводили подкожно инъекции соединения формулы 1 в носителе PEG 400 за 24 часа до или через 1 час после тотального облучения всего тела гамма-излучением. Суммарные дозы составляли от 20 мг/кг до 320 мг/кг. В экспериментах на выживание доза облучения составляла от 9 до 13 Гр. Наблюдали за выживанием животных. Некоторые соединения формулы 1, в частности 16α-фторо-17α-гидроксиандрост-5-ен, 16α-фторо-17β-гидроксиандрост-5-ен, 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен и 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ен, показали увеличение выживания животных в течение 20 суток по сравнению с контрольной группой животных, не получавшей лечения. Влияние соединений формулы 1 на содержание циркулирующих нейтрофилов проверяли с помощью мышей, которые получали соединение в количестве 30 мг/кг за 24 часа до облучения дозой 3 Гр. Пробы крови отбирали через два дня после облучения, когда нейтрофилы были существенно подавлены. Некоторые соединения формулы 1, включая 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен и 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ен, повышали уровень циркулирующих нейтрофилов в опытной группе мышей по сравнению с мышами, которым вводили только носитель.
Пример 29. Эффективная соматическая доставка 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ена и его метаболизм. Буккальный состав, содержащий 20 мг/таблетка 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ена вводили примату. 5 таблеток использовали для введения примату 100 мг соединения. Соединение вводили в форме буккальной таблетки, содержащей 20 мг соединения в одной таблетке.
После введения 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ена собирали мочу и проверяли содержание соединений в моче. Обнаруженные соединения анализировали способами газовой хроматографической масс-спектрометрии и ядерного магнитного резонанса и идентифицировали 3α,17β-дигидрокси-16α-фтороандрост-5-ен. Следов исходного соединения не обнаружили. Результаты показали, что (1) трансбуккальное введение 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ена чрезвычайно эффективно для обеспечения соматической доставки соединение, (2) исходное соединение 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен почти полностью превратилось в 3α,17β-дигидрокси-16α-фтороандрост-5-ен в результате метаболизма in vivo у приматов и (3) 3α,17β-дигидрокси-16α-фтороандрост-5-ен является активным соединением, которое ответственно за биологическую активность, связанную с исходным соединением, в частности, за противораковую и противовоспалительную активность и активность при травмах и неврологических нарушениях.
Пример 30. Метаболизм 16α-бромоэпиандростерона (16α-бромо-17-оксоандростана). Составы, содержащие 16α-бромоэпиандростерон перорально вводили пациентам, страдающим ВИЧ. Вводимые дозы содержали 50 мг 16α-бромоэпиандростерона. После введения 16α-бромоэпиандростерона отбирали пробы мочи и сыворотки и анализровали присутствующие в них соединения. В моче обнаружили глюкуроновую кислоту или сульфатные конъюгаты 3α,16α-дигидрокси-17-оксо-5α-андростана, 3β,16α-дигидрокси-17-оксо-5α-андростана, 3α,16α,17β-тригидрокси-5α-андростана и 3β,16α,17β-тригидрокси-5α-андростана. Ни одна из проб не содержала обнаруживаемого количества 16α-бромоэпиандростерона. Введение 16α-бромоэпиандростерона некоторым животным, включая приматов, также показало, что исходное соединение 16α-бромоэпиандростерон не было обнаружено в сыворотке или в моче в какое бы то ни было время после введения соединения животному. Эти результаты показывают, что 16α-бромоэпиандростерон является пролекарством и что такие соединения, как 3α,16α-дигидрокси-17-оксо-5α-андростан, 3β,16α-дигидрокси-17- оксо-5α-андростан, 3α,16α,17β-тригидрокси-5α-андростан и 3β,16α,17β-тригидрокси-6α-андростан являются биологически активными соединениями, связанными с полезными эффектами применения 16α-бромоэпиандростерона для лечения клинических состояний, в частности ВИЧ или малярийной инфекции, аутоиммунных нарушений, воспалительных состояний или иммуносупрессивных состояний, связанных с ВИЧ-инфицированием или старением.
Пример 31. Регулирование ферментной активности. Способность соединений с формулой 1 регулировать ферментную активность установили с помощью экспериментальной модели на животном, которая позволила провести анализ уровня термогенных ферментов печени. Анализируемые ферменты представляли собой митохондриальную глицерофосфатную дегидрогеназу или цитозольную декарбоксилирующую малатдегидрогеназу в печени крыс. В качестве живой модели использовали крыс, в пищу которым вводили соединение с формулой 1 и сравнивали уровень ферментов в печени после приема пищи, содержащей соединение с формулой 1, в течение 6 дней. Животных, которые не получали соединения с формулой 1, использовали в качестве контрольных для определения базового уровня ферментов. Введение термогенных ферментов с помощью терапевтических агентов в общем случае является полезным в клинических состояниях, в частности, при диабете, когда регулирование веса или снижение ожирения является желательным. Выбранные соединения формулы 1 растворяли в диэтиловом эфире или этаноле, добавляли в измельченный корм для крыс (Purina) и сушили на воздухе, чтобы ввести соединение в пищу. Соединения присутствовали в пище в пределах от 0,01% по массе до 0,2% по массе. Затем крыс в течение 6 суток кормили пищей, содержащей соединение с формулой 1, чтобы индуцировать термогенную печеночную цитозольную декарбоксилирующую малатдегидрогеназу и/или митохондриальную глицерофосфатную дегидрогеназу. Уровень печеночной цитозольной декарбоксилирующей малатдегидрогеназы и митохондриальной глицерофосфатной дегидрогеназы у контрольных крыс, которые получали корм, не содержащий соединений формулы 1, сравнивали с ферментыми уровнями у животных, которые получали соответствующие соединения.
Соединения формулы 1, которые использовали для модели на крысах, представляли собой соединения андростана и андростена с замещением и без замещения, включая 3β,7β,16α,17β-тетрагидроксиандрост-5-ен, 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ен, 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен, 3β,7β,16α-тригидрокси-17-оксоандрост-5-ен, 3β-гидрокси-7,17-диоксоандрост-5,15-диен, 3β-гидрокси-7,17-диоксо-14β-андрост-5,15-диен, 3β-пропионокси-7-оксо-16α-гидрокси-17-оксоандрост-5-ен, 3β,17β-дигидрокси-7,16-диоксоандрост-5-ен, 3β-гидрокси-7,16,17-триоксоандрост-5-ен и 3β,15β-дигидрокси-17-оксоандрост-5-ен; сложные эфиры, в частности, 3β,17β-диацетокси-7β-гидроксиандрост-5,16-диен, 3β-ацетокси-7,17-диоксо-16α-бромоандрост-5-ен, 3β-ацетокси-7,17-диоксо-15β-гидроксиандрост-5-ен, 3β-пропионокси-7,17-диоксо-15β-гидроксиандрост-5-ен, 3β-пропионокси-7,17-диоксо-15β,16α-дигидроксиандрост-5-ен, 3β-ацетокси-7β-гидрокси-16α-бромо-17-оксоандрост-5-ен, 3β-ацетокси-16α-бромо-17-оксоандрост-5-ен, 3β,7β-диацетокси-16α-бромо-17-оксоандрост-5-ен, 3β,16β-диацетокси-7α-гидрокси-17-оксоандрост-5-ен, 3β,16β-диацетокси-7β-гидрокси-17-оксоандрост-5-ен, 3β-ацетокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-ацетокси-7-оксо-17β-стеароиландрост-5-ен, 3β-ацетокси-7-оксо-17β-стеароиландростан, 3β-ацетокси-7,16,17-триоксоандрост-5-ен, 3β-пропионокси-7,16,17-триоксоандрост-5-ен и 3β-пропионокси-7,17-диоксо-14α-андроста-5,15-диен, 3β-ацетокси-7β,17β-дигидроксиандрост-5-ен, 3β-пропионокси-16β-гидрокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-пропионокси-16α-гидрокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-пропионокси-16β-гидрокси-7,17-диоксоандрост-5-ен и 3β,15β,16α-триацетокси-7,17-диоксоандрост-5-ен; простые эфиры, включая простые алкильные эфиры, замещенные простые алкильные эфиры и простые силиловые эфиры, в частности, 3β-t-бутилдиметилсилиокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β,17β-t-бутилдиметилсилиокси-7-оксоандрост-5-ен, 3β-(1'-этокси)этокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-метокси-17-оксоандрост-5-ен, 3β-метокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-метокси-7β,17β- дигидроксиандрост-5-ен, 3β-ацетокси-7-метокси-17-оксоандрост-5-ен, 3β-метокси-7-оксо-17β-гидроксиандрост-5-ен, 3β-метокси-7-оксо-17β-ацетоксиандрост-5-ен, 3β-t-бутилокси-7,17-диоксоандрост-5-ен и 3β-додеканокси-7,17-диоксоандрост-5-ен; смешанные сложные эфиры и простые эфиры, в частности, 3β-ацетокси-7β,17β-ди-t-бутилдиметилсилиокси-андрост-5-ен и 3β-ацетокси-7-оксо-17β-t-бутилметилсилилоксиандрост-5-ен; замещенные и незамещенные сахариды, в частности, метил-1-O-(7,17-диоксоандрост-5-ен-3β-ил)-β-D-глюкопираносидуронат, метил-2,3,4-три-O-ацетил-1-O-(7,17-диоксоандрост-5-ен-3β-ил)-β-D-глюкопираносидуронат, метил-1-O-(3β-ацетоксиандрост-5-ен-17β-ил)-β-D-глюкопираносидуронат, метил 1-O-(3β-ацетокси-7-оксоандрост-5-ен-17β-ил)-β-D-глюкопираносидуронат и метил 1-O-(3β,17β-диацетокси-7-оксоандрост-5-ен-7β-ил)-β-D-глюкопираносидуронат; карбонаты, в частности, 3β-карбометокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-карбометокси-7,17β-дигидроксиандрост-5-ен, 3β-карбоэтокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-карбоаллилокси-7,17-диоксоандрост-6-ен, 3β-карбо-изо-бутилокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β,17β-дикарбометокси-7-оксоандрост-5-ен, 3β-карбооктилметокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-карбо(9-флуоренил)метокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, 3β-карбоэтокси-7β,17β-дигидроксиандрост-5-ен и 3β-карбооктилокси-7β,17β-дигидроксиандрост-5-ен; соединения, содержащие другую защитную группу, в частности, защитную группу этилендиокси для карбонильной части, например, 3β-метокси-7-оксо-17,17-этилендиоксиандрост-5-ен, 3β-метокси-7β-гидрокси-17,17-этилендиоксиандрост-5-ен, 3β-метокси-7α-гидрокси-17,17-этилендиоксиандрост-5-ен, 3β-(2-тетрагидропиранилокси)-7,17-диоксоандрост-5-ен, где группа 2-тетрагидропиранилокси является гидроксильной защитной группой, которая содержит гетероцикл тетрагидропирана и 3β-пропионокси-15β,16β-эпокси-7,17-диоксоандрост-5-ен, где группа 15β,16β-эпокси - защитная группа 1,2-диола. Опытные соедиения обычно индуцировали образование декарбоксилирующей малатдегидрогеназы или одновременно декарбоксилирующей малатдегидрогеназы и митохондриальной глицерофосфатной дегидрогеназы в отличие от контрольных животных, которые не получали в пище соединия формулы 1. Ферментные уровни обычно превышали примерно на 120-300% такие же ферментные уровни у контрольных крыс, не подвергавшихся лечению. Эти результаты показали, что данные соединения являются биологически активными терапевтическими агентами. Результаты показали также, что соединения формулы 1, содержащие свободные гидроксильные или карбонильные (оксо)группы, являются биологически активными. Аналогиные соединения формулы 1, содержащие защитную группу, в частности ацетат, пропионат, 17,17-этилендиокси и/или t-бутилдиметилсилокси, также билогически активны.
Пример 32. Регулирование активности стероидного рецептора. Способность соединений с формулой 1 регулировать активность рецептора определили в линии клеток рака простаты человека, которая содержала рецептор андрогена человека и репортерный ген люциферазы, который был связан с вирусом LTR опухоли молочной железы мыши и реактивным элементом рецептора андрогена человека. В присутствии рецептора андрогена, который связан с его лигандом дигидротестостероном, реактивный элемент рецептора андрогена человека увеличивает транскрипцию репортерного гена люциферазы, как описали S.Yeh и С.Chang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5517-5521 1996, H.Miyamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4440-4444 2003. Контрольные клетки инкубировали в течение 24 часов в присутствии 1 нМ дигидротестостерона, чтобы определить уровень экспрессии репортерного гена. Соединение формулы 1 добавили к клеткам, которые инкубировали в присутствии 1 нМ дигидротестостерона, чтобы определить их способность подавлять увеличение экспрессии репортерного гена, вызываемое дигидротестостероном, связанным с андрогенным рецептором. Испытали соединения с формулой 1, в частности, 3β,7α,17β-тригидроксиандрост-5-ен, 3β-ацетокси-17-оксоандрост-1,5-диен, 3β-гидрокси-17-оксоандрост-1,5-диен и 3β-ацетокси-17,17-этилендиоксиандрост-1,5-диен, который является аналогом 3β-ацетокси-17-оксоандрост-1,5-диена с защитной группой в карбонильной (оксо)группе в 17 позиции. Установили, что эти соединения формулы 1 подавляют экспрессию репортерного гена, который был опосредован комплексом фактора транскрипции андрогенного рецептора - дигидротестостерона. Эти результаты показали, что соединения формулы 1 могут подавлять способность андрогенного рецептора увеличивать экспрессию реактивных генов андрогенного рецептора. Такая активность полезна при лечении клинических состояний, в частности доброкачественной гиперплазии простаты, рака простаты и связанных состояний иммунной дисфункции, например иммуносупрессии и воспаления.
Пример 33. Применение соединений формулы 1 для лечения подавления врожденного иммунитета. Мышам породы Balb/c вводили дозу циклофосфамида, достаточную для подавления врожденного иммунитета у животных. Реакцию подавления врожденного иммунитета контролировали с помощью анализа содержания нейтрофилов в различное время. Этот анализ использовали для определения влияния соединений формулы 1 на продолжительность и тяжесть подавления врожденного иммунитета по результатам восстановления нейтрофилов. Животным вводили инъекцию 200 мг/кг циклофосфамида, а также соответствующую инъекцию один раз в день в 1, 2, 3, 4 и 5 день после введения циклофосфамида. При этом контрольная группа животных получала инъекцию только носителя без соединения формулы 1, а опытной группе животных вводили 5 мг/день 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ена, 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ена или 3β,17β-дигидрокси-7-оксоандрост-5-ена. У животных, которые получали соединения формулы 1, содержание нейтрофилов на 6 и 7 день было выше, чем у контрольной группы, или минимальный уровень содержания нейтрофилов был выше, чем у контрольной группы. Эти результаты показали, что соединения с формулой 1 снижают влияние иммуносупрессии.
Пример 34. Применение соединений формулы 1 для лечения неврологических и травматических состояний. Способность соединений формулы 1 регулировать неврологическую когнитивную функцию определили в нескольких протоколах. В одном протоколе соединения формулы 1 использовали в модели мозговой травмы на самцах крыс породы Sprague-Dawley весом 300-400 г, чтобы показать влияние этих соединений на снижение ухудшения двигательных навыков после мозговой травмы. Модель такого бокового регулируемого коркового сотрясения представляет собой модель клинической травмы головы у человека. (С.Dixon et al., J. Neurosci. Methods 39:253-262 1991). Дозу 25 мг/кг испытемого соединения, 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ена, или контрольного носителя, не содержащего соединения формулы 1, вводили один раз в день (внутрибрюшинная инъекция) через 30 мин, 2 ч или 12 ч после того, как животным наносили регулируемую мозговую травму, а затем снова - через 24 ч и 48 ч после мозговой травмы. Второй контрольной группе животных не причиняли мозговой травмы, а только вводили инъекцию носителя, который не содержал соединения формулы 1. При этом использовали 5 групп животных, группа 1 - не травмированные, не подвергаемые лечению контрольные животные, группа 2 - травмированные, не подвергаемые лечению контрольные животные, группа 3 - травмированные животные, которых начали подвергать лечению через 30 минут после нанесения мозговой травмы, группа 4 - травмированные животные, которых начали подвергать лечению через 2 ч после нанесения мозговой травмы и группа 5 - травмированные животные, которых начали подвергать лечению через 12 часов после нанесения мозговой травмы. Результаты показали, что животные, которым не наносили мозговой травмы, через 3 дня после мозговой травмы были способны выполнить испытание по прохождению перекладины, которое заключалось в прохождении по перекладине шириной 2,5 см и длиной 1 м. Животные проходили по перекладине, чтобы спастить от неприятных ощущений, которые вызывало воздействие освещения мощностью 200 Вт и 90 дБ белого шума. При испытании по прохождению перекладины ни одна из 17 крыс группы 1 не упала с перекладины. В группе 2 9 животных из 26 упали с перекладины, что показывает отрицательное влияние мозговой травмы на неврологические рефлексы крыс. В группах 3 (24 животных) и 5 (16 животных) по 1 животному из каждой группы упало с перекладины, в то время как в группе 4 (23 животных) с перекладины упало 4 животных. В других испытаниях по прохождению перекладины животным вводили 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен перед наненсением крысам регулируемой мозговой травмы, при этом группы животных, подвергнутых лечению и травмированию, прошли испытание лучше, чем травмированные контрольные животные, не получавшие лечения. Эти результаты показали, что соединение формулы 1 уменьшает влияние регулируемого неврологического нарушения у крыс и поэтому полезно для лечения мозговой травмы, благодаря улучшению неврологических рефлексов у травмированных животных.
В другом протоколе 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен вводили крысам породы Sprague-Dawley в вышеописанной модели бокового регулируемого коркового сотрясения, чтобы показать влияние данного соединения на снижения ухудшения памяти после регулируемой мозговой травмы. В этом протоколе влияние регулируемой мозговой травмы, описанной выше, на обучение определяли с помощью протокола водяного лабиринта Морриса (R.Morris J. Neurosci. Methods 11:47-60 1984), который является обычной моделью для определения влияния терпевтического лечения на память. В вышуказанных группах 3, 4 и 5 животные, подвергнутые лечению, имели лучшую функцию памяти, чем травмированные, но не подвергруные лечению животные контрольной группы 2.
В следующем протоколе соединения формулы 1, 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен и 3β-гидрокси-16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен, использовали для уменьшения воспаления, индуцированного интерлейкином-1β в мезангиальных клетках крыс in vitro. Показали, что оба соединения уменьшают синтез про-воспалительного медиатора СОХ-2. Эти результаты подтверждают, что указанные соединения могут частично функционировать, уменьшая воспаление, которое способно вызывать повреждения тканей в различных клинических состояниях, включая травмы и неврологические нарушения.
В другом протоколе определяли способность соединения формулы 1 - 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен - улучшать память у животных после мозгового инсульта. В этом протоколе использовали указанное соединение, чтобы ослабить влияние глобальной ишемии головного мозга на модели песчанок. Песчанкам перевязали сонные артерии на 5 мин, чтобы вызвать ишемию головного мозга. Затем каждому животному ввели подкожно по 5,0 мг в день 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ена в форме 0,1% суспензии карбоксиметилцеллюлозы в 0,9% физиологическом растворе. Состав вводили песчанкам за 2 суток до закупорки артерий, в день операции за два часа до анестезии, и затем в течение 4 суток. Для оценки обучаемости и памяти использовали сухопутный вариант водяного лабиринта Морриса с использованием семян подсолнечника в качестве поощрения. В группе 1 с имитацией лечения было 5 животных, а в контрольной группе было 3 животных, у которых была вызвана ишемия без лечения указанным соединением. У животных группы 3 (3 животных) вызвали ишемию и лечили их указанным соединением. Результаты показали, что после 5 или более тренировочных занятий подвергнутые лечению животные были способны находить поощрительный корм быстрее, чем животные группы 2. На последнем тренирвоочном занятии среднее время, которое требовалось животным для нахождения поощрительного корма +/- SEM составляло 6,9+/-0,9 сек для животных группы 1, 46,9+/-13,6 сек для животных группы 2 и 14,8+/-4,8 сек для животных группы 3. Эти результаты показали, что 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен способен улучшать обучаемость и память у животных после ишемической травмы головного мозга.
В целом полученные результаты показали, что соединения с формулой 1 (1) уменьшают последствия регулируемого неврологического нарушения и являются полезными для лечения травмы головного мозга путем улучшения неврологических рефлексов, (2) улучшают память и обучаемость после травматического поражения головного мозга и поэтому полезны для лечения или уменьшения потери памяти и (3) уменьшают воспаление и поэтому полезны для лечения нарушений, в частности неврологических нарушений, например, болезни Альцгеймера и рассеянного склероза, а также аллергии и связанных нарушений, в частности атопической астмы, аллергических респираторных заболеваний, аллергического ринита и фиброза легких, при которых воспаление может вносить вклад в поражение тканей или прогрессирование заболевания.
Пример 35. Применение соединений формулы 1 для уменьшения потери костной массы. Способность соединений формулы 1 уменьшать потерю костной массы определили с помощью модели ожоговой раны на мышах. Значительные травмы, включая термические повреждения, обычно приводят к существенной потере костной ткани у человека и млекопитающих. В данном протоколе у самцов мышей породы Balb/c в возрасте 90-100 дней весом около 25 г вызывали регулируемый термический ожог, который привел к существенной потере костной массы в течение нескольких недель после ожога. Использовали группы, каждая из которых включала 10 животных. Животных в группе 1, которых не подвергали ни ожогу, ни лечению, использовали для получения базовых значений при различных измерениях костной плотности и веса, в частности, кортикальной зоны перонеотибиальный спонгиозной костной массы в прокисмальном большеберцовом метафизе. Животным контрольной группы 2 вводили носитель (0,11% карбоксиметилцеллюлозы в 0,9% физиологическом растворе, подкожная инъекция), но не создавали ожога. У животных контрольной группы 3 вызвали термический ожог и вводили им только носитель. У животных контрольной группы 4 вызвали термический ожог и лечили их путем введения 3,0 мг 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ена (в носителе) каждому животному, начиная со времени создания термического ожога и затем через 48 ч после создания ожога 3 раза в неделю в течение 4 ч. По окончании периода лечения животных из групп 2-4 умертвили и кости каждого животного подвергли сканированию для определения плотности, чтобы установить потерю костной массы, вызванную термическим ожогом. Контрольные животные группы 2, у которых не вызывали ожога, но которым вводили только носитель, не имели существенной потери костной массы по сравнению с базовыми животными в группе 1. У животных группы 3, у которых был вызван ожог, но которых не лечили указанным соединением, наблюдали существенную потерю костной массы по сравнению с животными групп 1 и 2. Животные группы 4, у которых вызвали ожог и которых лечили 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-еном, имели существенно меньшую потерю костной массы, чем животные группы 3.
В другом протоколе соединение формулы 1, 3α,17β-дигидрокси-19-норандрост-4-ен, использовали для увеличения роста костей у мышей породы Swiss Webster. Использовали группы из 8-10 самок в возрасте 6 или 8 месяцев с удаленным яичником. Результаты показали, что рост костей у животных с удаленным яичником подавляется вследствие пониженного содержания гормонов роста, которые способствуют росту костей. Животных группы 1, которым удалили яичники, но которые не получали лечения использовали в качестве контрольных. Каждому животному группы 2 с удаленным яичником вводили 7,6 мг 3α,17β-дигидрокси-19-норандрост-4-ена и использовали их в качестве опытной группы. Животные группы 2 по сравнению с животными контрольной группы 1 имели больший размер костей (кортикальная ширина) и повышенное содержание сывороточного остеокластина. Аналогичные результаты получили у самцов мышей породы Swiss Webster, подвергнутых орхиэктомии, в возрасте 6 или 8 месяцев.
Эти результаты показали, что соединения формулы 1 уменьшают потерю костной массы, увеличивают рост костей и поэтому являются полезными для (1) лечения или замедления прогрессирования потери костной массы в клинических состояниях, в частности при травме и остеопорозе, и (2) увеличения роста костей.
Пример 36. Применение соединений формулы 1 для лечения подавления врожденного иммунитета, связанного с воздействием ионизирующего излучения. Мышей облучали дозой ионизирующего излучения, которая была достаточной, чтобы подавить врожденный иммунитет у животных. Реакции подавления врожденного иммунитета контролировали, анализируя содержание нейтрофилов. Этот анализ использовали для определения влияния соединений формулы 1 на продолжительность и тяжесть нейтропении. Протокол был практически таким же, как в примере 27. В качестве соединения формулы 1 использовали 3β,17β-дигидрокси-16α-фтороандрост-5-ен. Мышам, подвергавшимся лечению, вводили подкожные инъекции 0,6 мг 3β,17β-дигидрокси-16α-фтороандрост-5-ена в носителе (0,1% карбоксиметилцеллюлозы в 0,9% физиологическом растворе) через 3-4 ч после гамма-облучения всего тела. Контрольной группе мышей вводили только носитель через 3-4 ч после облучения. Доза облучения в экспериментах на выживание составляла от 9 до 13 Гр. Контролировали выживание животных. На 14 день выжило 50% контрольных животных и 67% животных, подвергнутых лечению. Это показывает, что 3β,17β-дигидрокси-16α-фтороандрост-5-ен уменьшает подавление врожденного иммунитета, связанное с облучением летальной дозой излучения.
Пример 37. Применение соединения формулы 1 для лечения аллергического неврологиеского нарушения. Соединения формулы 1, 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ен и 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен, использовали для лечения у мышей экспериментального аллергического энцефаломиелита, который является аллергическим демиелинизирующим заболеванием центральной нервной системы. Эту модель используют в качестве экспериментальной модели на животном рассеянного склероза человека, поскольку она имеет патологические и клинические характеристики, аналогичные болезни человека (С.Fressinaud et al., Rev. Med. Intern. 11:201-208 1990). В этой модели на животном клинические симптомы, в частности вялый хвост, небольшая слабость задних конечностей или тяжелая слабость задних конечностей с умеренной атаксией появляются примерно на 10-11 день или позднее после иммунизации мышей, не подвергаемых лечению. Иммунизация инициирует иммунную реакцию, которая вызывает постепенное поражение ткани центральной нервной системы, что в свою очередь приводит к появлению нарушения двигательной функции у животных. В данном протоколе самцов мышей B10. PL иммунизировали с помощью подкожной инъекции 400 мкг фрагмента N-ацетил-ASQKRPSQRSK синтезированного мышиного миелинового основного белка в полном адъюванте Фрейнда, содержащем 200 мкг клеточных фрагментов Mycobacterium tuberculosis, а мышам SJL/J вводили инъекцию 150 мкг фрагмента HCLGKWLGHPDKF мышиного протеолипидного белка (PLP) в полном адъюванте Фрейнда, содержащем 200 мкг клеточных фрагментов Mycobacterium tuberculosis. Контрольным животным вводили инъекцию 0,1 мл носителя (2% полисорбата 80, 0,05% фенола, 0,1% карбоксиметилцеллюлозы, 0,9% физиологического раствора), в то время как опытным животным вводили инъекцию 0,1 мл носителя, содержащего 3,0 мг 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-ена или 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ена. Мышам B10.PL вводили инъекцию один раз в день, начиная с того дня, как мыши были иммунизированы, и затем один раз в день после этого. У контрольных животных клинические симптомы появились на 11 сутки после иммунизации, в то время как у животных, подвергавшихся лечению 3β,7β,17β-тригидроксиандрост-5-еном, симптомы не появлялись до 19 суток после иммунизации, а у животных, которым вводили 16α-фторо-17-оксоандрост-5-ен, существенных симптомов не наблюдали во все время действия протокола, которое составляло 25 суток. В течение цикла протокола животные, которых лечили одним из двух соединений, имели более низкую среднюю клиническую степень тяжести в любое время от 0 до 21 суток после иммунизации.
Одним из аспектов прогрессии заболевания в данной модели является присутствие воспалительного состояния, которое сопровождает поражение ткани центральной нервной системы. Предварительное введение иммунизированным самкам мышей одного из соединений формулы 1 существенно уменьшало количество клеток CD4+, образующих TNF-α из центральной нервной системы, что указывает на снижение уровня повреждения ткани центральной нервной системы. Содержание некоторых маркеров воспаления, в частности TNF-α, TNF-β и М1Р-1α, которые определяли с помощью защитного анализа РНК-зы, уменьшалось в ткани спинного мозга иммунизитрованных самок мышей, что указывает на пониженный уровень воспаления у мышей, подвергнутых лечению соединением формулы 1, по сравнению с контрольными животными, не подвергнутыми лечению.
Эти результаты показывают, что введение животным соединений формулы 1 уменьшает воспаление и существенно замедляет прогрессирование повреждения ткани, что является полезной биологической активностью для лечения или замедления прогрессирования неврологических нарушений, в частности болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона или рассеянного склероза.
Изобретение относится к композициям, содержащим полугидрат 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она и один или более эксципиент, обычно при этом композиция содержит менее 3% воды. Композиции полезны при получении улучшенных фармацевтических составов. Описываются способы прерывистого дозирования стероидных соединений, таких как аналоги 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-она и композиций, пригодных при таких режимах дозирования. Описываются также композиции и способы ингибирования патогенной (вирусной) репликации, улучшение симптомов, связанных с нарушениями иммунного отклика и модулирование иммунного отклика у субъекта с использованием указанных соединений и их аналогов. Описываются способы получения и применения этих иммуномодуляторных композиций. 11 н. и 52 з.п. ф-лы, 3 табл., 13 ил.
отличающийся одним или несколькими из следующих параметров: 1) эндотермическим поглощением, составляющим примерно 100°С +/-2°С при измерении способом калориметрического анализа с дифференциальным сканированием, 2) наличием двух полос поглощения карбонила примерно при 1741 и 1750 см-1 при измерении способом инфракрасной абсорбционной спектроскопии с преобразованием Фурье, 3) содержанием воды, составляющим примерно от 2,4 мас.% до примерно 2,6 мас.% при измерении титрационным способом Карла Фишера, и 4) наличием 1, 2, 3 или более пиков в спектре рентгеновской дифракции на порошке (XRD) при значениях угла тета примерно 17,8°+/-0,2°; 23,8°+/-0,2°; 24,2°+/-0,2°; 26,9°-27,2+/-0,2°; 28,6°+/-0,2°; 30,1°+/-0,2° и 32,2°+/-0,2° тета, при этом пики XRD определяют с помощью излучения Cu-Кα.
безводный 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он,
аморфный 16α-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он, а также 16β-бромо-3β-гидрокси-5α-андростан-17-он.
где R1 представляет собой -ОН, -SH, сложный эфир, простой эфир, сложный тиоэфир, простой тиоэфир или карбонат;
R2 представляет собой -Н, -ОН, =O, -SH или =S;
R3 представляет собой -ОН, =O, -SH, =S, -F, -Cl, -Br или полимер;
R4 представляет собой -ОН, -SH, -NH2, -NH-С(O)-С1-С20 алкильную группу с возможным замещением, сложный эфир, простой эфир, карбонат, карбамат или полимер;
R5 представляет собой -СН3 или -СН2OH;
R6 представляет собой -Н, -СН3 или -СН2OH;
R8 представляет собой -CHR10-, где R10 представляет собой -Н или алкильную группу с возможным замещением; и
R9 представляет собой -CHR10- или -О- где R10 представляет собой -Н, -F, сложный эфир или простой эфир.
где R1 представляет собой -ОН, -SH, сложный эфир, аминокислоту, простой эфир, простой тиоэфир, карбонат или карбамат;
R2 представляет собой -М, -ОН, -SH, сложный эфир, амино кислоту, простой эфир, простой тиоэфир, карбонат или карбамат;
R3 представляет собой -Н, -ОН, -SH, галоген, сложный эфир, простой эфир, простой тиоэфир, карбонат или карбамат;
R4 в β-конфигурации представляет собой -ОН, -SH, сложный эфир, амино кислоту, простой эфир, простой тиоэфир, карбонат или карбамат;
R4 в α-конфигурации представляет собой алкил с возможным замещением или алкинил с возможным замещением;
R6 представляет собой -Н или низший алкил и
R9 представляет собой -СН2-, -CHR10- или -О-, где R10 представляет собой -ОН, -О, =СН2, сложный эфир, простой эфир или С1-8 алкил.
и R4 в α-конфигурации представляет собой С1-4 алкил или С2-4 алкинил или производное его сложного эфира или простого эфира.
и R4 в α-конфигурации представляет собой С1-4 алкил или С2-4 алкинил, или его сложного или простого эфира.
где пунктирные линии представляют собой возможные двойные связи;
R1 представляет собой -Н, -ОН, -SH, сложный эфир, сложный тиоэфир, фосфат, простой эфир, простой тиоэфир, карбонат, карбамат или аминокислоту;
R2 представляет собой -ОН, =O, -SH, =S, алкильную группу с возможным замещением, алкенильную группу с возможным замещением или алкинильную группу с возможным замещением;
R3 представляет собой -Н, -ОН, =O, -SH, =S, галоген, сложный эфир, сложный тиоэфир, простой эфир, простой тиоэфир, карбамат алкильную группу с возможным замещением, алкенильную группу с возможным замещением или алкинильную группу с возможным замещением;
R4 в β-конфигурации представляет собой -ОН, -SH, сложный эфир, сложный тиоэфир, сложный фосфоэфир, сложный фосфотиоэфир, сложный фосфоноэфир, сложный фосфинэфир, сложный сульфитный эфир, сложный сульфатный эфир, простой эфир, простой тиоэфир, карбонат, тиоацеталь, или полимер;
R4 в α-конфигурации представляет собой -Н, алкильную группу с возможным замещением, алкенильную группу с возможным замещением или алкинильную группу с возможным замещением;
R6 представляет собой -Н или алкильную группу с возможным замещением
и
R9 представляет собой -CHR1, где R10 представляет собой -Н, -ОН, =O, -SH, =S, галоген, сложный эфир, простой эфир, карбонат, тиоацеталь, простой, алкильную группу с возможным замещением, алкенильную группу с возможным замещением или алкинильную группу с возможным замещением.
Приоритеты: 23.03.99 пп.1-63. 16.06.99 уточнение признаков по пп.1-63. 08.10.99 уточнение признаков по пп.1-63. 08.11.99 уточнение признаков по пп.1-63.
| Подъемный гак большой грузоподъемности | 1960 |
|
SU133995A1 |
| US 4956355, A, 11.09.1990 | |||
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ СТОПОРЕНИЯ РЕЗЬБОВОГО СОЕДИНЕНИЯ | 1972 |
|
SU429187A1 |
