СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША Российский патент 2005 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике коклюша, и может быть использовано в практике здравоохранения при постановке раннего этиологического диагноза.

Коклюш продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения, поскольку несмотря на активную иммунизацию детского населения в настоящее время имеют место высокие показатели заболеваемости и повсеместное распространение с периодически регистрируемыми эпидемическими подъемами. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 60 млн случаев и свыше 500 тыс. летальных исходов. Заболеваемость коклюшем по России возросла на 32%.

На современном этапе коклюш характеризуется тяжелым течением у детей раннего возраста с развитием угрожающих жизни осложнений, формированием резидуальных последствий и сохраняющейся летальностью. Нередко имеет место атипичное течение коклюша у детей старшего возраста и взрослых, как правило, у привитых детей и у детей с незавершенной схемой иммунизации.

Частота регистрации, многообразие клинических форм, появление диких возбудителей коклюша, низкий процент бактериологического подтверждения клинического диагноза обосновывают необходимость разработки и внедрения новых современных методологических подходов, обеспечивающих постановку своевременной и квалифицированной этиологической диагностики коклюша.

Известен метод культуральной диагностики коклюша, при котором производится посев исследуемого материала на оптимальные питательные среды и выделение чистой культуры с последующей идентификацией возбудителя.

Вместе с тем несмотря на то, что выделение культуры B.pertussis является абсолютным тестом для установления этиологического диагноза, метод имеет ряд недостатков. Выделение культуры B.pertussis требует высокоэффективных селективных питательных сред и биполярного микроскопа, что затрудняет его широкое использование. Кроме того, метод отличается трудоемкостью и низкой эффективностью, не обеспечивает точности и отличается длительностью проведения анализа: на его выполнение требуется от 5 до 7 дней, метод малоэффективен, высеваемость составляет 11-20% в высококвалифицированных лабораториях [Тимченко В.Н. Коклюш у детей в современных условиях //Учебно-методическое пособие. - СПб.: ГПМА, 2000. - 20 с.].

Известен также метод ретроспективной серологической диагностики на основе реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностических препаратов отечественного производства. Сущность метода заключается в обнаружении в исследуемых парных сыворотках специфических антител, которые забирают на 2-3 неделе заболевания с интервалом 1-2 недели. Но несмотря на его явные преимущества перед культуральным метод отличается трудоемкостью, низкой эффективностью, не обеспечивает точности, отличается продолжительностью проведения анализа, так как антитела выявляются в крови только со второй недели болезни, диагностическое значение метод серологической диагностики может иметь только для изучения характера гуморального специфического ответа, исследуя парные сыворотки в динамике заболевания. Кроме того, выполнение его требует парентерального вмешательства. [Инструкция по бактериологическим и серологическим исследованиям при коклюше и паракоклюше, МЗ СССР, Москва, 1983].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ диагностики коклюша методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием ослиной диагностической сыворотки, описанный в методических рекомендациях Казанского государственного медицинского института им. С.В.Курашова [Амфитеатрова Н.Ф. с соавт. Новые методы ранней и экспресс-диагностики коклюша. Мет. рекомендации. - Казань, 1992]. Материалом для исследования является слизь с задней стенки глотки, 48-72 часовые подозрительные колонии из первичных посевов, выделенные чистые культуры, смывы 5-суточных первичных посевов со среды выращивания после получения отрицательных результатов бактериологического исследования. Готовят 3 препарата: 1 опытный (исследуемый субстрат) и 2 для контроля иммунологической специфичности (жидкий коклюшный диагностикум). После фиксации в 96° этиловом спирте на подсушенные препараты наслаивают ослиную диагностическую коклюшную агглютинирующую сыворотку и выдерживают в термостате при 37°С в течение 15 минут. Затем на опытный препарат и препарат, используемый в качестве положительного контроля, наслаивают люминесцирующую сыворотку против глобулинов осла, а на препарат, используемый как отрицательный контроль, наслаивают люминесцирующую сыворотку против глобулинов лошади. Далее препараты выдерживают во влажной камере при 37°С в течение 15 минут и просматривают под люминесцентным микроскопом.

Этот способ позволяет получить результат анализа через 5 часов, дает положительные результаты в 67% случаев при исследовании с первой по десятую недели болезни (максимум положительных результатов может быть получен на ранних сроках обследования). Вместе с тем, этот способ достаточно трудоемок, предлагает одновременное исследование проб от больного, подозрительных колоний 48-72 первичных посевов и смывы 5-суточных первичных посевов со среды выращивания, что замедляет анализ и вынуждает накапливать пробы, не обеспечивает точности и отличается длительностью проведения анализа, не дает прогноза течения заболевания и не позволяет оценить морфофункциональное состояние слизистой фарингеального эпителия.

Для устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают способ иммунологической экспресс-диагностики коклюша, позволяющий выявить антигены коклюшной палочки в гортанно-глоточных смывах методом непрямой иммунофлюоресценции в материале, исследуемом на присутствие корпускулярных антигенов коклюшной палочки, согласно изобретению в качестве исследуемого материала используют браш-биоптат слизистой задней стенки глотки, который наносят последовательно на предметное стекло в виде двух капель d=0,5 мм: первая капля - выявление антигенов, вторая - выявление специфического секреторного иммуноглобулина А. Рядом наносят две капли суточной культуры коклюшной палочки d=0,5 мм для положительного (третья капля) и отрицательного (четвертая капля) контроля; после фиксации в ацетоне в первую и третью капли добавляют гипериммунную человеческую сыворотку, во вторую каплю добавляют суточную культуру коклюшной палочки, в четвертую - сыворотку, не содержащую антител к коклюшной палочке, после инкубации во влажной камере во все четыре капли добавляют антивидовую диагностическую люминесцентную сыворотку и при обнаружении ярко-зеленого специфического свечения по периферии клеток выявляют: в первой капле антигены коклюшной палочки, во второй капле - специфический секреторный иммуноглобулин А, при специфическом свечении в третьей капле и отсутствии свечения в четвертой капле диагностируют коклюш через 2 часа после забора материала

Технический результат изобретения заключается в повышении точности и экспрессности.

Авторами впервые предложен способ экспресс-диагностики коклюша, который позволяет поставить предварительный диагноз уже через 2 часа после взятия браш-биоптата у больного на анализ, основываясь на результатах реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), причем предложенный способ может быть использован в практике любой бактериологической лаборатории, а постановка РНИФ на предметном стекле позволяет производить анализ отдельного образца браш-биоптата от больного сразу после взятия материала на анализ.

Авторами впервые предложено использовать в качестве исследуемого материала браш-биоптат слизистой с задней стенки глотки, так как это более информативный материал, который позволяет при однократном заборе получить достаточное количество эпителиальных клеток (1000000 клеток/мл), в отличие от метода, предложенного Н.Ф.Амфитеатровой, которая использует в качестве исследуемого материала смыв с задней стенки глотки.

Согласно изобретению в отличие от вышеуказанных способов предлагается осуществлять постановку реакции непрямой иммунофлюоресценции непосредственно на эпителиоцитах, зафиксированных на предметном стекле. Повышение чувствительности предложенного метода выявления корпускулярных антигенов коклюшной палочки в биологическом материале достигается использованием комплекса методических приемов. Так, после фиксации ацетоном проводится обработка эпителиоцитов 1% раствором бычьего сывороточного альбумина на ФСБ (рН 7,2-7,4), предшествующая нанесению специфических антител, устраняет неспецифические факторы, имеющиеся на эпителиоцитах. Кроме того, предлагаемый метод позволяет оценить морфофункциональное состояние слизистой фарингеального эпителия по следующим закономерностям: наличие разрушенных эпителицитов и нитей фибрина, присутствие мононуклеаров и выраженная вакуолизация эпителицитов, наличие полинуклеаров с фагоцитарной активностью. Выявленные морфофункциональные изменения состояния фарингеального эпителия ротоглотки позволяют установить сопутствующую патологию ротоглоточного кольца. Помимо этого метод позволяет сделать прогноз течения заболевания по оценке местного специфического иммуноглобулина А: иммуноглобулин А отсутствует при затяжных формах коклюша, тогда как определяется в достаточной концентрации при легких и среднетяжелых формах коклюша.

Предложенный впервые комплекс методических приемов, выполняемых в процессе выявления корпускулярных антигенов коклюшной палочки на эпителиоцитах, является обязательным. Невыполнение их искажает результаты и не позволяет дать объективную оценку результатов для постановки диагноза, не обеспечивает точности.

Предлагаемый способ экспресс-диагностики коклюша осуществляют следующим образом. Доставленные в лабораторию браш-биоптаты слизистой фарингеального эпителия (гортанно-глоточный смыв) последовательно наносят на предметное стекло в виде двух капель d=0,5 мм, первая капля служит для выявления антигенов, вторая - для выявления специфического секреторного иммуноглобулина А, рядом для постановки положительного (третья капля) и отрицательного (четвертая капля контроля) наносят две капли d=0,5 мм суточной культуры коклюшной палочки. Затем проводят фиксацию в ацетоне при +4°С в течение 10-20 минут. Индикацию корпускулярных антигенов коклюшной палочки и специфического секреторного иммуноглобулина А производят в реакции непрямой иммунфлюоресценции (РНИФ). При постановке РНИФ на зафиксированные ацетоном препараты наносят диагностикум: в первую и третью (положительный контроль) капли добавляют гипериммунную человеческую сыворотку, во вторую каплю добавляют суточную культуру коклюшной палочки, в четвертую - сыворотку, не содержащую антител к коклюшной палочке (отрицательный контроль). Препараты помещают во влажную камеру (чашки Петри с увлажненной ватой) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 20 минут. После инкубации препараты промывают струей водопроводной воды (с целью удаления несвязанной с коклюшным корпускулярным антигеном гипериммунной коклюшной сыворотки), ополаскивают в двух порциях ФБР (рН 7,2-7,4), подсушивают. Подсушенные препараты (второй этап реакции) затем подкрашивают антивидовой люминесцирующей сывороткой с одновременным контрастированием. Для этого во все четыре капли добавляют сыворотку против глобулинов человека с альбумином, меченым родамином. Препараты помещают во влажную камеру, инкубируют в термостате при 37°С в течение 20 минут и промывают дважды по 5 минут в ФБР (рН 7,2-7,4), ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Объем капель для анализа 20-50 мкл. Учет результатов реакции проводится в падающем свете на люминесцентных микроскопах различной системы. При работе на люминесцентном микроскопе МЛ-2 используют систему светофильтров БС-2, ФС-4, С3С7-2, иммерсионные объективы, обозначенные буквой “Л” (90), апертура диафрагмы 1,25; окуляр 7° или 10°, сила тока на пульте при микроскопе 4,5 А. Оценка интенсивности свечения производится по четырехплюсовой системе:

++++ - очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастируемая с телом клетки.

+++ - яркая люминесцирующая периферия клетки.

++ - или + - слабое

свечение периферии клетки.

(минус) - люминесценция клеток отсутствует.

Положительным результатом считается яркая флюоресценция с зеленоватым светом по периферии (в области оболочки коклюшной палочки), четко контрастирующая с темным телом клетки, при отрицательном результате в контрольной части мазка. Морфология вида, как правило, сохраняется. Оценка препарата должна проводиться комплексно с учетом таких показателей, как яркость и цвет специфической флюоресценции, локализация и структура свечения (свечение оболочки), а также количество адгезированных на эпителиоцитах коклюшных палочек в поле зрения.

Анализ известных способов на дату подачи заявки, показывает, что не существует подобных способов, позволяющих выявить корпускулярные антигены коклюшной палочки непосредственно на фарингеальных эпителиоцитах, колонизованных B.pertussis. Это позволяет сделать вывод о существенности отличий заявляемого способа. Предлагаемый способ экспресс-диагностики коклюша позволяет, основываясь на результатах реакции непрямой иммунофлюоресценции на эпителиоцитах, поставить предварительный диагноз уже через 2 часа после взятия материала на анализ. Забор материала исключает парентеральное вмешательство, постановка реакции и учет результатов не требуют дорогостоящего оборудования, обеспечивает точность.

В качестве доказательств приводим следующие примеры:

1. Х. Лиза, 1 год 4 мес. и/б 1083, д-з: ОРВИ, бронхит:

Кровь РА титр противококлюшных антител 1/256 (3 неделя болезни). Культуральный метод отриц. (5 суток) Биоптат РНИФ положит. (2 часа).

2. С. Соня, 2 года 6 мес, и/б 2255, д-з: ОРВИ, обструктивный бронхит:

Кровь РА титр противококлюшных антител 1/64 (2 неделя болезни). Культуральный метод отриц. (5 суток) Биоптат РНИФ положит. (2 часа).

3. П. Марина, 16 лет, № анализа 97, д-з: бронхит, длительный кашель (10 дней): Кровь РА титр противококлюшных антител 1/16 (2 неделя болезни). Культуральный метод отриц. (5 суток) Биоптат РНИФ положит. (2 часа).

Приведенные примеры свидетельствуют о высокой чувствительности и экспрессности разработанного метода, его точности.

Кроме того, апробация способа на клиническом материале детей с диагнозом: “Коклюш” и другими нозологическими формами (бронхит, ОРВИ, “длительно кашляющие”) показала его высокую специфичность и чувствительность. Положительные результаты получены как на начальной стадии развития заболевания, так и при затяжном, длительном течении заболевания, после нескольких курсов антибактериальной терапии, в отличие от культурального способа (таблица).

Результаты исследования гортанно-глоточных смывов в РНИФ и культуральным методомВсего обследовано детей с подозрением на коклюшВ том числе, диагноз подтвержден Высевом культуры В. PertussisВыявлением корпускулярного коклюшного антигена в РНИФ Абсолютные%Абсолютные%52910419,749593,6

В отличие от культурального (процент подтверждения составил 19,7%) в РНИФ диагноз подтвержден у 93,6% больных, что на 73,9% увеличило процент подтвержденных случаев.

Кроме того, с помощью предлагаемого метода обеспечивается ранняя экспресс-диагностика коклюша, так как уже через 2 часа с момента доставки в бактериологическую лабораторию мазков, полученных от больных с подозрением на коклюш, удается подтвердить этиологический диагноз.

Кроме того, РНИФ позволяет выявить варианты штаммов В.pertussis, утративших способность к размножению под действием антибактериальной терапии, что существенно повышает эффективность предложенного способа, особенно у длительно “кашляющих” с неподтвержденным диагнозом.

Непрямой метод флюоресцирующих антител позволяет обнаружить клетки В.pertussis, содержащиеся в исследуемом материале в небольших количествах - 10³-10⁵ микробных клеток в 1 мл исследуемого материала.

Таким образом, авторами впервые предложен способ экспресс-диагностики коклюша, который позволяет уже через 2 часа после взятия материала (браш-биоптата слизистой с задней стенки глотки), избегая парентеральных вмешательств и выделения культуры возбудителя, основываясь на принципах реакции непрямой иммунофлюоресценции и результатах клинического и цитоскопического исследований в первый день обследования установить ранний этиологический диагноз коклюша, преимуществом предлагаемого метода экспрессного выявления корпускулярных антигенов коклюшной палочки является его высокая чувствительность и специфичность, простота и точность, доступность и возможность использования как в ранней экспресс-диагностике клинических форм коклюша, так и при массовых скрининговых обследованиях населения на коклюшное бактерионосительство.

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для постановки раннего этиологического диагноза. Сущность изобретения состоит в том, что исследование проводят в браш-биоптате слизистой задней стенки глотки, в реакции непрямой иммунофлуоресценции определяют наличие антигена коклюшной палочки и специфического секреторного иммуноглобулина A (IgA) и при одновременном выявлении в исследуемом материале антигена коклюшной палочки и специфеского секреторного IgA диагностируют коклюш. Техническим результатом является повышение точности диагностики и укорочение сроков постановки диагноза.

Способ экспресс-диагностики коклюша путем выявления антигенов коклюшной палочки в реакции непрямой иммунофлуоресценции, отличающийся тем, что исследование проводят в браш-биоптате слизистой задней стенки глотки, определяют наличие антигена коклюшной палочки и специфического секреторного иммуноглобулина A (IgA) и при одновременном выявлении в исследуемом материале антигена коклюшной палочки и специфического секреторного IgA диагностируют коклюш.