Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и биотехнологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) путем исследования клеточной взвеси лимфоцитов с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ).

По данным Россельхознадзора РФ за 2022 год лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующую позицию в рейтинге самых диагностируемых инфекций [Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации. Отчеты по эпидситуации в стране: сайт Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор): https: // fsvps.gov.ru/ru/iac/rf/ezhekvartalnyj-otchet]. Многие исследователи считают его эпидемически опасным и ответственным за развитие раковых заболеваний за счет возможности передачи возбудителя от животных человеку [Aida Y., Murakami H., Takahashi M., Takeshima S-N. Mechanisms of pathogenesis induced by bovine leukemia virus as a model for human T-cell leukemia virus // Front Microbiol. - 2013. - Vol. 8 (4). - P. 328.].

Методом, обладающим максимальной чувствительностью и высокой специфичностью, позволяющим с высокой эффективностью выявлять инфицированных ВЛКРС животных, а также дифференцировать инфицированных телят от телят с колостральными антителами является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Высокая стоимость оборудования и реактивов для ПЦР не позволяет ее рассматривать как метод массовой диагностики. Помимо этого, в развитии вирусной инфекции существуют периоды, имеющие очень низкий уровень ДНК провируса. В таких случаях, несмотря на высокую чувствительность ПЦР, более информативными являются серологические методы диагностики [Beier D., Blankenstein P., Fechner H. Possibilities and limitations for use of the polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. - 1998. - Vol. 105. - P. 408-412.]

Другим методом прямого выявления вируса является реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), обладающая рядом преимуществ: простота, скорость постановки, специфичность и экономичность.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота [Патент RU 2767688 С1 Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патентообладатель ФГБНУ «Омский АНЦ», опубл.18.03.2022, Бюл. №8], включающий забор проб крови, выделение на градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества клеточной взвеси лимфоцитов, приготовление из нее мазков и постановку РНИФ.

Основным недостатком данного метода является необходимость применения в качестве компонента реакции стандартной люминесцирующей кроличьей антисыворотки против глобулинов быка, ранее выпускаемой НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва), но прекратившей в настоящее время его производство. Индивидуальный заказ этого компонента увеличивает стоимость диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что экономически не целесообразно. К тому же применение этого реагента усложняет анализ проведения реакции из-за введения дополнительной стадии, тем самым увеличивая длительность ее постановки.

Техническим результатом является упрощение постановки реакции, сокращение времени и снижение материальных затрат на ее проведение.

Техническим решением способа постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота является: выделение лимфоцитов из крови крупного рогатого скота центрифугированием в градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества (тразографа или его аналога). Из выделенной взвеси лимфоцитов делают мазок типа «высушенной капли», высушивают при комнатной температуре, фиксируют в 96 % этиловом спирте 30 минут, затем наносят 50 мкл диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС в рабочем разведении 1:640, инкубируют во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трижды промывают дистиллированной водой, подсушивают при комнатной температуре в условиях затемнения и просматривают в люминесцентном микроскопе.

Также осуществляют контроль реакции с антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота и физиологическим раствором. Для оценки интенсивности свечения используют четырех крестовую систему: (++++) - очень яркая люминесценция, четко контрастирующая на темном фоне; (+++) - яркая люминесценция; (++) или (+) - слабое свечение; (-) - отсутствие люминесценции.

За положительный результат принимают специфическое свечение антигена с оценкой в четыре, три креста.

Отличительными признаками предложенного способа является то, что осуществляется прямое окрашивание диагностическими флуоресцирующими иммуноглобулинами против ВЛКРС зафиксированных на стекле мазков с высушенной клеточной взвесью лимфоцитов. Предлагаемый способ позволяет сократить время постановки реакции в 2,0 раза и упростить ее за счет исключения одной из двух стадий инкубаций, необходимых для постановки РНИФ, а также снизить ее стоимость за счет уменьшения трудозатрат и исключения необходимости использования дорогостоящего компонента реакции - стандартной люминесцирующей кроличьей антисыворотки против глобулинов быка.

Получение, определение активности и специфичности диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС.

Получают сыворотку крови от больной лейкозом в гематологической стадии коровы. С этой целью проводят инкубацию отобранной периферической крови в термостате при температуре 37°С в течение 60 мин, затем в холодильнике при температуре 4°С в течение 4-х часов. Образовавшийся сгусток фибрина отделяют от стенок пробирок с помощью стеклянной палочки или проволоки. Прозрачную жидкость, отделенную от кровяного сгустка, центрифугируют при 1500 об/мин. в течение 10 минут. Полученную таким образом сыворотку сливают в чистую сухую пробирку в объеме не менее 20 мл, затем инактивируют на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут, центрифугируют при 10 000 об/мин 20 минут для удаления агрегированных белков.

Получают глобулиновую фракцию методом высаливания [Кубица Ю. Иммунофлюоресценция. - М.: Медицина, 1967. - С. 84-85] в насыщенном растворе сернокислого аммония (542 г соли в 1 л дистиллированной воды) в условиях холодильника 4°С в течение 20 минут на магнитной мешалке. Отчищают глобулиновую фракцию от сернокислого аммония центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость выливают, а осадок с сернокислым аммонием растворяют в 0,15 М растворе хлористого натрия и фильтруют через колонку сефадекс G-25. Очищенные иммуноглобулины (Ig) проверяют в качественной реакции на наличие солей аммония с реактивом Нейслера (50 мкл глобулиновой фракции смешивают с 50 мкл реактива Нейслера). В случае положительной реакции (желтое окрашивание) повторяют фильтрацию через колонку сефадекс G-50. Затем определяют количество белка по биуретовой реакции спектрофотометрическим методом.

Проводят мечение глобулинов люминесцентным красителем флюоресцеин 5-изотиоционатом (FITC) на магнитной мешалке в условиях холодильника 4°С в течение 16-18 часов из расчета FITC 0,05 мг: Ig 1 мг белка (1:20) предварительно растворив краситель в карбонатно-бикарбонатного буфере (рН 9,2). Очищают от краски с помощью гельфильтрации на колонке сефадекс G-50.

Оценку активности и специфичности проводят разведением опытных диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС в 0,9% физиологическом растворе с 1:80 до 1:1280, учитывают активность красящего титра иммуноглобулинов по максимальному разведению, обеспечивающему окраску препарата не ниже 3-х крестов. Рабочим разведением считают титр в 2 раза меньший красящего титра - 1:640 (табл. 1).

Таблица 1 - Определение активности и специфичности диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС Компоненты реакции антиген опытные диагностические флуоресцирующие
иммуноглобулины против ВЛКРС ¹иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие бруцеллезные 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 ²вакцинный штамм Brucella abortus 19 ++ + - - - ++++ ++++ ++++ +++ +++ ³антиген
вируса лейкоза ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++ + - - -

Примечание:

¹иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие бруцеллезные - иммуноглобулины диагностические, флуоресцирующие бруцеллезные сухие Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (рекомендуемое инструкцией рабочее разведение 1:32);

²вакцинный штамм Brucella abortus 19 - «Вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма Brucella abortus 19 живая сухая» производства Щелковского биокомбината г. Москва;

³антиген вируса лейкоза, положительная контрольная сыворотка против ВЛКРС - набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота Курской биофабрики г. Курск.

Результаты, представленные в таблице, демонстрируют, что полученные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины против ВЛКРС специфичны в отношении антигена ВЛКРС в 100% случаях, о чем свидетельствует положительная реакция (свечение не менее трех крестов) и отрицательная с антигеном B. abortus 19.

Таким образом, описанный способ способствовал получению диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против вируса лейкоза крупного рогатого скота с высокой активностью в титре 1:640 - 1:1280.

Сущность изобретения поясняется на конкретном примере выполнения способа.

Пример. Испытание диагностической эффективности реакции иммунофлуоресценции в производственных условиях

Проводят производственное испытание предлагаемого способа путем отбора проб крови от крупного рогатого скота, принадлежащего двум сельскохозяйственным формированиям Омской области с различным эпизоотическим статусом по лейкозу. В хозяйстве (А) с широким распространением вирусной инфекции (до 70 % инфицированных коров в стаде) по результатам серологических исследований в реакции иммунной диффузии (РИД) производят отбор проб крови от 50 РИД-негативных и от 50 РИД-позитивных коров и исследуют в ПЦР, а также с помощью известного способа и предлагаемого способа. РИД-негативный крупный рогатый скот (n=50) из благополучного по лейкозу хозяйства (Б) служил в качестве контроля.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

При исследовании 50 РИД-позитивных коров в 100 % случаях отмечают положительную реакцию иммунофлюоресценции, проведенную как по известному [Патент RU 2767688 С1 Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота], так и по предлагаемому способу. В то же время у двух животных, несмотря по положительную серологическую реакцию, ПЦР оказалась отрицательной, что можно связать с наличием низкого уровня провирусной ДНК у этих животных.

Таблица 2 - Сравнительный анализ диагностической эффективности реакции иммунофлюоресценции, проведенной по известному и предлагаемому способу Хозяйство Статус животных Кол-во
проб ПЦР Реакция иммунофлюоресценции Известный способ Предлагаемый способ (-) (+) (-) (+) (-) (+) А РИД (-) 50 45 5 42 8 42 8 РИД (+) 50 2 48 0 50 0 50 Б (контроль) РИД (-) 50 50 0 50 0 50 0

Следует отметить, что как с помощью известного, так и предлагаемого способов постановки реакции иммунофлюоресценции среди РИД-негативного поголовья было дополнительно выявлено 8 носителей ВЛКРС, что составило 16 %, тогда как ПЦР позволил идентифицировать провирус только у 5 животных (10 %).

Диагностические исследования РИД-негативных коров из благополучного по лейкозу хозяйства подтвердили отсутствие вирусной инфекции.

На следующем этапе в этих же хозяйствах проводят испытание диагностической эффективности предлагаемого метода на телятах в возрасте до 5-и месяцев.

С этой целью в хозяйстве (А) по результатам исследований в ПЦР проводят отбор проб крови от 19 голов ПЦР-негативного молодняка крупного рогатого скота и от 21 животного носителя провирусной ДНК и исследуют в реакции иммунофлюоресценции по известному и предлагаемому методам. Еще 40 ПЦР-негативных теленка из благополучного по лейкозу хозяйства служили в качестве контроля.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Сравнительный анализ диагностической эффективности реакции иммунофлюоресценции, проведенной по известному и предлагаемому способу на телятах до 5-месячного возраста Хозяйство Статус животных Количество проб Реакция иммунофлюоресценции Известный способ Предлагаемый
способ (-) (+) (-) (+) А ПЦР (-) 19 18 1 18 1 ПЦР (+) 21 0 21 0 21 Б (контроль) ПЦР (-) 40 40 0 40 0

Во всех случаях у ПЦР-негативных телят из благополучного по лейкозу хозяйства была подтверждена отрицательная реакция иммунофлюоресценции, что подтверждало специфичность диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС.

По результатам диагностических исследований в хозяйстве (А) у всех носителей ДНК провируса регистрировалось специфическое свечение. У одного ПЦР-негативного теленка выявлен антиген ВЛКРС как при постановке реакции иммунофлюоресценции известным, так и предлагаемым методом.

Таким образом, установлена идентичная диагностическая эффективность реакции иммунофлюоресценции независимо от способа ее постановки, превосходящая по своей чувствительности ПЦР и подтверждающая в 100 % случаях результаты РИД у коров в случаях ее несоответствия с ПЦР (РИД+, ПЦР-).

Несмотря на одинаковую чувствительность с известным способом, предлагаемый способ постановки РИФ с использованием диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов в титре 1:640 позволяет уменьшить стоимость диагностики лейкоза крупного рогатого скота путем исключения дорогостоящего компонента реакции (стандартной люминесцирующей кроличьей антисыворотки против глобулинов быка), использования антигена вируса лейкоза из набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота только для контроля реакции, снижения расхода наконечников для дозатора и амортизации термостатного оборудования, а также трудозатрат специалиста. Помимо этого, способ позволяет сократить время постановки реакции в 2 раза за счет исключения одной из двух стадий инкубаций, необходимых для постановки РНИФ (дополнительные затраты времени на нанесение на мазок положительной сыворотки с трехкратным промыванием мазка - 6,5 минут и на инкубацию - 30,0 минут). Способ может быть использован как альтернативный метод ПЦР диагностики.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Способ включает стадии забора проб крови, приготовление мазков из клеточной взвеси лимфоцитов, выделенных из крови центрифугированием на градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества. Для постановки реакции иммунофлуоресценции используют диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины в титре 1:640 - 1:1280 против ВЛКРС, полученные из сыворотки крови больной коровы в клинико-гематологической форме, инактивированной при 56°С в течение 30 мин с последующим выделением глобулиновой фракции методом высаливания в насыщенном растворе сернокислого аммония с отчисткой ценрифугированием и гельфильтрацией на колонке сефадекс G-25, меченные флюоресцеин 5-изотиоционатом в рабочем разведении 1:20. Способ позволяет выявить вирус ВЛКРС на ранних стадиях развития заболевания, способствует сокращению времени проведения исследования. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

1. Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий забор проб крови, приготовление мазков из клеточной взвеси лимфоцитов выделенных из крови центрифугированием на градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества, отличающийся тем, что на фиксированный мазок наносят 50 мкл диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС в рабочем разведении 1:640, инкубируют во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трижды промывают дистиллированной водой, подсушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе с использованием четырехкрестовой системы для оценки интенсивности свечения, контроль реакции осуществляют с антигеном ВЛКРС и физиологическим раствором.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины против ВЛКРС получены из сыворотки крови больной коровы в клинико-гематологической форме, инактивированной при 56°С в течение 30 мин, с последующим выделением глобулиновой фракции методом высаливания в насыщенном растворе сернокислого аммония с отчисткой центрифугированием и гельфильтрацией на колонке сефадекс G-25, меченные флюоресцеин 5-изотиоционатом в рабочем разведении 1:20.