СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ГЕМОФИЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ "b" У ДЕТЕЙ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к новой медицинской биотехнологии и может быть использовано в клинической практике как метод ранней диагностики гемофильной инфекции «b» у детей.

Гемофильная инфекция «b» является крайне актуальной проблемой в мире, так как характеризуется широким распространением, тяжелым течением и высокой летальностью среди детей раннего возраста. Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что инфекция, вызванная Н. influenzae типа «b» (Hib-инфекция), имеет широкое распространение на территории России и является актуальной проблемой здравоохранения.

Возбудителем гемофильной инфекции «b» является Haemophilus influenzae типа «b», принадлежащая к граммотрицательным микроорганизмам, маркерами вирулентности которой, как известно, является принадлежность штаммов к капсульному типу «b». Гемофильная инфекция занимает второе место после пневмококковой, осложняющих течение ОРВИ. В настоящее время лишь 10 видов ее из существующих (более 20) рассматриваются как возбудители бронхитов, пневмоний и отитов. В последние годы наблюдается рост заболеваемости менингитом, менингоэнцефалитов и генерализованных форм заболеваний, вызванных гемофильной палочкой типа b. Последние нередко осложняются субдуральным выпотом, инфарктом мозга и других органов, неправильной секрецией антидиуретического гормона, затяжным течением, что определяет неблагоприятные исходы заболевания (летальность до 19% по данным США) и резидуальные последствия в виде интеллектуальной недостаточности.

Повсеместная распространенность гемофильной инфекции, разнообразие клинических форм, тяжесть течения с неблагоприятными исходами, а также высокие показатели заболеваемости и летальности, особенно среди детей, требуют совершенствования методов диагностики этих заболеваний.

Выделение и идентификация возбудителя в настоящее время затруднена в связи с появлением устойчивых к пенициллину и другим антибиотикам штаммов, недостатком диагностических препаратов и отсутствием питательных сред отечественного производства.

Применяемый в настоящее время алгоритм проведения бактериологической диагностики Hib-инфекции, регламентированный приказом Минздрава №535 от 22 апреля 1985 г., предусматривает подтверждение диагноза выделением культуры возбудителя. Однако метод очень громоздкий, его осуществление требует до 3-х и более дней, при этом эффективность метода остается низкой.

Известен микроскопический способ постановки ориентировочного диагноза путем изучения мазков из материала (крови, СМЖ), полученного от больных с подозрением на гемофильную инфекцию (Колуканов И.Е., Чайка Н.А. Гемофильная инфекция. СПб., 1998, 60 с.). Однако оценка микроскопической картины препаратов представляется особенно сложной по отношению к гемофильным бактериям и, в частности, Н. influenzae типа «b», так как выявление в мазке мелких инкапсулированных грамотрицательных палочек, расположенных беспорядочно друг относительно друга, позволяет лишь предположить присутствие гемофильной палочки.

Известны способы экспресс-диагностики Hib-инфекции, сущность которых заключается в выявлении антигенов гемофильной палочки типа «b» в билогических жидкостях (СМЖ, крови и моче) с помощью реакций иммунодиффузии (РИД), встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) и радиоиммунного анализа (РИА) (Колуканов И.Е., Чайка Н.А. // Гемофильная инфекция. /СПб., 1998, 60 с.). Однако при постановке этих реакций имеет место большое количество перекрестных реакций с полисахаридами других капсульных микроорганизмов, например пневмококков, менингококков и других, что в конечном счете, не обеспечивает точности постановки диагноза. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность методов использование их ограничивается технической сложностью и возможностью облучения персонала при использовании РИД.

Оптимальные результаты в диагностике гемофильной инфекции типа «b» получены с помощью иммуноферментного анализа - ИФА. Принцип метода заключается в том, что мышинными моноклональными антителами против H. influenzae «b» сенсибилизируется поверхность твердофазного носителя. При внесении в лунки исследуемого материала (СМЖ, сыворотки крови больного) в случае наличия в нем антигена «Hib» образуется комплекс «антиген + антитело», связанный с поверхностью носителя. После добавления антивидовой сыворотки, меченной ферментом, меченные антитела взаимодействуют с комплексом «антиген + антитело», образуя новый комплекс. Для его выявления добавляют раствор субстрата, который под воздействием фермента меняет цвет, что указывает на положительный результат (Колуканов И.Е., Чайка Н.А. //Гемофильная инфекция. /СПб., 1998, 60 с.).

Однако несмотря на высокую чувствительность описанного метода ИФА оказался не перспективным в плане ограниченной возможности ее применения для широкого использования. Сложность получения мышинных моноклональных антител Hib, и в связи с этим отсутствие до настоящего времени стандартных тест-систем для постановки ИФА в значительной степени снижает точность результатов диагностики.

Наиболее близким к предлагаемому авторами способу экспресс-диагностики гемофильной инфекции «b» является способ выявления антигенов Hib в материалах, полученных от больных, с помощью реакции агглютинации латекса - РАЛ (Богданович Т.М. и соавт. //Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам H. influenzae/. «Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия», 2000, №2, Том 2, С.93-109). Принцип реакции заключается в агглютинации на стекле частиц латекса, на поверхности которых адсорбированы антитела против H.influenzae «b» при смешивании с сывороткой крови или СМЖ больного с целью выявления в них антигена. Реакция технически проста, чувствительна и специфична. Для выявления антигенов H. influenzae «b» за рубежом и в нашей стране испытаны коммерческие наборы для латекс-агглютинации, в том числе диагностический латексный набор "Slidex meningite - Kit 5» bioMerieux (France), который является дорогостоящим и, более того, с весьма ограниченным сроком хранения (не более 3-х месяцев). Кроме того, реакция имеет ограниченную область использования исследуемого материала, поскольку позволяет (согласно инструкции) выявлять антиген только в ликворе. Между тем, довольно часто (до 30% случаев) при инвазивной инфекции, обусловленной гемофильной палочкой «b», развиваются септические формы заболевания, при которых возбудитель циркулирует в крови. Таким образом, несмотря на высокую чувствительность РАЛ в ранней диагностике гемофильных «b» менингитов она абсолютно не применима в диагностике сепсиса гемофильной этиологии.

Основываясь на этом, разработка принципиально нового способа ранней диагностики Hib-инфекции является весьма актуальной задачей. Авторы решили эту задачу, заявляя способ выявления антигенов гемофильной палочки типа «b» в сыворотке крови и СМЖ больных гемофильной инфекцией с помощью реакции агглютинации латекса. В качестве исследуемого материала, кроме ликвора, может быть использована (по показаниям) и сыворотка крови, а в качестве частиц-носителей иммуноглобулина (антител против гемофильной палочки типа «b») 1,2% взвесь монодисперсного полистирольного латекса. Постановку РАЛ осуществляют на предметном стекле, учет результатов проводят через 2-3 мин после смешивания реагентов и по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинатов частиц латекса судят о присутствии в исследуемом материале антигенов гемофильной палочки типа «b».

Технический результат заключается в повышении точности, экспрессности, что обеспечивает назначение и проведение своевременной терапии.

Этот результат достигается тем, что выявляя антиген гемофильной палочки в реакции агглютинации латекса авторы предлагают выделять иммуноглобулин G из гипериммунной сыворотки кролика, иммунизированного конъюгированной вакциной «Act-Hib», которой сенсибилизируют 1,2% взвеси частиц монодисперсного полистиролового латекса (d=0,8 ммк), затем на предметное стекло наносят 50 мкл сенсибилизированного латекса и 20 мкл ликвора или 20 мкл сыворотки крови, смешивают и по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинатов через 2-3 мин при положительных результатах реакции с пробой сыворотки крови ставят диагноз «генерализованная форма гемофильной инфекции «b» с пробой ликвора - острый гнойный менингит гемофильной этиологии «b».

Авторы впервые для повышения точности в качестве частиц-носителей используют 1,2% взвесь монодисперсного полистирольного латекса с характеристиками, наиболее подходящими для сорбции иммуноглобулинов G против антигенов гемофильной палочки «b». Так, путем отработки параметров сорбции латексных частиц антителами к антигенам гемофильной палочки «b» авторам удалось подобрать оптимальные размер и концентрацию латексных частиц и для эффективной сенсибилизации латексных частиц использовать монодисперсные полистирольные латексы диаметром частиц 0,8 ммк с концентрацией 1,2% взвеси частиц.

Авторы успешно использовали модель кролика для получения качественной гипериммунной сыворотки с большим содержанием фракции антител класса иммуноглобулина G против антигенов гемофильной палочки «b» благодаря апробированию высококачественной коммерческой конъюгированной вакцины «Act-Hib», фирма Пастер Мерье, Франция). Таким образом, авторам удалось впервые получить максимальное количество антител против «Hib» для сенсибилизации латексных частиц, что обеспечивает наиболее точную постановку диагноза. Неочевидно полученные результаты авторы связывают, как оказывается, с тем, что специфическую фракцию иммуноглобулина класса G получают из гипериммунной сыворотки кроликов, иммунизированных вакциной (Act-Hib), содержащей очищенный полисахарид H. influenzae «b» - основной типовой антиген возбудителя. Кроликов иммунизируют вакциной, созданной на основе конъюгированного капсульного полисахарида Hib - полирибозил-рибитол-фосфата (ПРФ) со столбнячным анатоксином, используемым в качестве белкового носителя, с помощью которого авторам удалось получить гипериммунную сыворотку с большим содержанием IgG против антигенов гемофильной палочки «b».

Как показали экспериментальные исследования, в результате которых был выявлен факт, а именно белок-носитель (столбнячный анатоксин), входящий в состав вакцины, не вызывает образования специфических антитоксических противостолбнячных антител. Его функция заключается в участии в механизме презентации ПРФ-антигена Т-лимфоцитам и, таким образом, в индукции Т-зависимого иммунного ответа. Анти-ПРФ антитела, вырабатываемые в ходе гуморального иммунного ответа в результате вакцинации, как утверждают исследователи, относятся к классу IgG (Parke J.C, Schneerson R., Reimer M., Robbinson J.B. et al./ Clinical and immunologic responses to H.influenzae type b tetanus toxoid conjugate vaccine in infants ingected at 3,5.7 and 18 mounths of age.// J. pediatr., 1991; 118:184-190).

Таким образом, основываясь на вышеизложенном, авторы впервые, используя механическую сорбцию полистирольных латексных частиц именно специфическим иммуноглобулином класса IgG (в концентрации 10 мкг/мл), получили высоко специфический препарат для выявления антигенов гемофильной палочки типа b. Авторами впервые экспериментальным путем были подобраны условия сенсибилизации для получения латексного диагностикума: к 2 мл 1,5% латекса добавляли 0,5 мл разведенных фосфатным буфером 1:10 иммуноглобулинов класса G против антигенов гемофильной палочки «b» в концентрации 1,0 мг/мл (конечная концентрация латекса - 1,2%, концентрация иммуноглобулина класса G - 0,4 мг/мл). Для эффективной сорбции антител к частицам латекса выбран следующий режим инкубации: на аппарате встряхивания при температуре 18-20°С, в течение двух часов, затем при температуре 37°С в течение 18 часов.

Авторы предлагают в качестве положительного контроля использовать коммерческий стандартный препарат - Act-Hib вакцину, содержащую определенное количество ПРФ (полирибозил-рибитол-фосфата) - основного специфического компонента капсульного материала гемофильной палочки «b», специфически реагируемого со специфическим иммуноглобулином класса G, адсорбированным на латесных частицах.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. У пациента, поступившего в стационар с подозрением на инвазивную гемофильную инфекцию (гнойный менингит или сепсис гемофильной природы), производят забор материала-пробы сыворотки крови или спинномозговой жидкости (СМЖ), которые немедленно отправляют в бактериологическую лабораторию для осуществления диагностики: одновременно бактериологического посева для выделения возбудителя Hib-инфекции и постановки экспресс-метода - реакции агглютинации латекс. Способ экспресс-метода, то-есть реакции агглютинации латекса, осуществляют следующим образом. Постановку РАЛ проводят при комнатной температуре (18-20°С). При исследовании одного образца СМЖ или сыворотки крови на предметное стекло наносят 50 мкл диагностического латекса - латекс, сенсибилизированный специфическим иммуноглобулином класса G против Hib, в который добавляют 20 мкл исследуемого материала и смешивают. Через 1-3 мин учитывают результат РАЛ. Время постановки и учета РАЛ составляет 20-30 мин с момента доставки проб в лабораторию. В качестве положительного контроля служит образец, содержащий антигены Hib (вакцина - Act-Hib), отрицательного - образец 1,2% взвеси ненагруженного латекса.

Результаты РАЛ учитываются визуально по 4-крестной системе:

4+ - образование крупных хлопьев агглютината на просветленном фоне капли;

3+ - образование крупных хлопьев агглютината на фоне капли без просветления;

2+ - образование отчетливого мелкозернистого осадка по всему объему капли;

1+ - слабая зернистость по всему объему капли.

- равномерно-гомогенная молочно-белая суспензия, отсутствие агглютинации (отрицательная РАЛ).

Результат оценивают как положительный в случае 4+, 3+ и 2+ в первой и третьей капле, результат оценивают как отрицательный, если первая капля сохраняет однородный молочно-белый цвет, идентичный капле с контрольным отрицательным образцом (вторая капля).

Заявляемый способ может быть подтвержден следующими примерами.

Пример 1.

Фамилия, имя П.Дарья

Пол Ж

Дата рождения / возраст 09.07.02

№истории болезни №6918

Дата поступления 18.08.05 Диагноз: генерализованная гемофильная инфекция

 ЛикворКровьПосевОтр.Н. influenzae «b» - культураLAR - по авторскому способуОтр.Н. influenzae «b» - антигеныLAR - «Kit-5»Отр.Отр.Цитоз2880/3 Формулан 95% Сахар3,5 ммоль/л Белок0,33 г/л Окраска по ГрамуГрам (-) палочки 

Как видно из приведенных данных (пример 1), РАЛ оказалась положительной только с пробой сыворотки крови и была отрицательной с пробой ликвора. Таким образом, ранний этиологический диагноз генерализованной инфекции (сепсиса) гемофильной этиологии «b» установлен на основании обнаружения с помощью РАЛ антигенов гемофильной палочки «b» только в пробах сыворотки крови больного. Тогда как РАЛ с использованием коммерческого латексного диагностического набора «Kit-5» оказалась отрицательной как с пробой ликвора, так и с пробой сыворотки крови, что указывает на большую эффективность разработанного авторами способа экспресс-диагностики других клинически значимых форм гемофильной инфекции, например генерализованных форм (сепсиса). Результат подтвержден «золотым» стандартом - выделением культуры возбудителя Н. influenzae «b» из крови больного.

Пример 2.

Фамилия, имя К.Илья

Пол М

Дата рождения / возраст 18.10.98

№ истории болезни 3076

Дата поступления 02.04.05 г. Диагноз: острый бактериальный менингит гемофильной природы

 ЛикворКровьПосевH.influenzae «b» - культураОтр.LAR - по авторскому способуН.influenzae «b» - антигеныН.influenzae «b» - антигеныLAR - «Kit-5»Н. influenzae «b» - антигеныОтр.Цитоз50944/3 Формулан 98% Сахар2,9 ммоль/л Белок0,66 г/л Окраска по ГрамуГрам (-) палочки 

Как видно приведенных данных (пример 2), ранний этиологический диагноз установлен на основании положительной реакции в авторской РАЛ, то-есть на основании обнаружения антигенов гемофильной палочки «b» как в крови, так и ликворе больного острым бактериальным менингитом, реакция оказалась отрицательной с пробой крови с использованием коммерческого латексного диагностикума «Kit-5». Результат подтвержден «золотым» стандартом - выделением культуры возбудителя Н. influenzae «b» из ликвора больного.

Пример 3.

Фамилия, имя К.Настя

Пол Ж

Дата рождения / возраст 23.04.00 г.

№ истории болезни №7994

Дата поступления 27.09.05 г.

Диагноз: генерализованная форма менингококковой инфекции

 ЛикворКровьПосевN. meningitidisN. meningitidisLAR - по авторскому способуОтр.Отр.LAR - «Kit-5»Отр.Отр.Цитоз12544/3 Формулан 98% Сахар3,0 ммоль/л Белок0,49 г/л Окраска по ГрамуГрам (-) диплококки 

Как видно из приведенных данных (пример 3), реакция агглютинации латекса с применением авторского способа с пробами сыворотки крови и ликвора у больного с диагнозом «генерализованная форма менингококковой инфекции», установленным выделением чистой культуры N. meningitides, оказалась отрицательной, что подтверждает точность постановки раннего этиологического диагноза Hib-инфекции.

При разработке способа были использованы образцы ликвора (48 проб) и сыворотки крови (38 проб) от больных детей, находившихся в клинике острых нейроинфекций НИИ детских инфекций (г.Санкт-Петербург) в период 2003-2005 гг., с диагнозами: «острый бактериальный менингит, менингоэнцефалит и генерализованная инфекция гемофильной этиологии». Результаты клинических испытаний РАЛ свидетельствовали о высокой специфичности авторской РАЛ, так как % совпадения положительных результатов при сравнении стандартного (культурального) метода и РАЛ составили 100%. Кроме того, проведенные испытания указывали на высокую чувствительность РАЛ. Так, в восьми отрицательных пробах ликвора, полученных от больных острым бактериальным менингитом, и девяти отрицательных пробах сыворотки крови от больных с сепсисом, не подтвержденных культуральным способом (то-есть без выделения культуры возбудителя), с помощью только РАЛ были выявлены антигены гемофильной палочки «b», что позволило подтвердить дополнительно этиологический диагноз острого бактериального менингита гемофильной этиологии в 16,7% случаев, генерализованной гемофильной инфекции - в 17, 15% случаев (табл.1).

Таблица 1
Результаты сравнительной оценки методов выделения культуры гемофильной палочки «b», выявления антигенов гемофильной палочки «b» в ликворе и крови с помощью авторской РАЛ и коммерческого латексного диагностического набора «Kit-5»Клинические формы гемофильной инфекции «b»Всего случаев, подтвержденных выделением культуры гемофильной палочки типа «b» и в РАЛ (авторской и использованием набора «Kit-5»)Всего случаев, подтвержденных выявлением антигенов гемофильной палочки типа типа «b» только в авторской РАЛВсего случаев, подтвержденных выявлением антигенов гемофильной палочки типа типа «b» только в РАЛ с использованием набора «Kit-5»«острый бактериальный менингит, менигоэнцефалит гемофильной этиологии» n=48 случаев, проб40, 83,3%8, 16,7%8, 16,7%«генерализованная гемофильная инфекция» («сепсис») n=35 случаев, проб29, 82,85%9, 17,15%- (антигены Hib не выявлялись)

Таким образом, оценка специфичности, чувствительности и точности, а также результаты сравнительной оценки результатов РАЛ с использованием коммерческого набора «Kit-5» позволяют считать, что способ, разработанный авторами, может быть рекомендован для широкого использования в практическом здравоохранении для постановки раннего этиологического диагноза Hib - инфекции. Способ отличается высокой специфичностью, точностью и экспрессностью и пригоден для установления раннего этиологического диагноза при других клинически значимых формах гемофильной инфекции «b».

Способ относится к новой медицинской биотехнологии и может быть использован в клинической практике как метод ранней диагностики гемофильной инфекции у детей. Способ выявления антигенов гемофильной палочки типа «b» в сыворотке крови и СМЖ больных гемофильной инфекцией проводят с помощью реакции агглютинации. В качестве исследуемого материала используют как ликвор, так и сыворотку крови, а в качестве частиц-носителей (d=0,8 мкм) иммуноглобулина (антител против гемофильной палочки типа «b») - 1,2% взвесь монодисперсного полистирольного латекса. Постановку реакции агглютинации осуществляют на предметном стекле, на которое наносят 50 мкл сенсибилизированного IgG против антигенов гемофильной палочки «b» и 20 мкл ликвора или 20 мкл сыворотки крови. Учет результатов проводят через 2-3 мин после смешивания реагентов и по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинатов частиц латекса судят о присутствии в исследуемом материале антигенов гемофильной палочки типа «b». Способ обеспечивает экспрессивность и точность диагностики. 4 табл.

Способ экспресс-диагностики гемофильной инфекции «b» у детей путем выявления антигенов гемофильной палочки «b» в реакции агглютинации латекса, отличающийся тем, что выделяют иммуноглобулин G из гипериммунной сыворотки кролика, иммунизированного конъюгированной вакциной «Act-Hib», которым сенсибилизируют 1,2% взвесь частиц монодисперсного полистерольного латекса (d=0,8 ммк), затем на предметное стекло наносят 50 мкл сенсибилизированного латекса и 20 мкл ликвора или 20 мкл сыворотки крови, смешивают и по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинатов через 2-3 мин при положительных результатах реакции с пробой сыворотки крови ставят диагноз «генерализованная форма гемофильной инфекции «b», с пробой ликвора - острый гнойный менингит гемофильной этиологии «b».