СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, и может быть использовано в ранней диагностике дифтерийной инфекции (ДИ).

Этиологическая диагностика является одной из актуальных и сложных задач здравоохранения в решении проблемы ДИ на современном этапе.

В настоящее время здравоохранение располагает целым набором ускоренных методов качественного и количественного определения токсина в среде культивирования C. diphtheriae (И. К. Мазурова "Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции" - Докт. дисс. - М., 1993).

В основе наиболее широко известного и доступного метода качественного определения дифтерийного токсина - способа иммуннопреципитации в агаре по Оухтерлони лежит взаимодействие между токсином и антитоксином, которое происходит в плотных питательных средах в местах оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого C. diphtheriae, диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической противодифтерийной сыворотке. На этих участках выпадает преципитат в виде белых линий ("усов") (Приказ МЗ СССР N 450 от 02.04.1986 г.). Однако выявление дифтерийного токсина возможно только на третий - четвертый дни исследования первичного посева, то есть, после выделения чистой культуры возбудителя и постановки пробы на токсигенность. Следовательно, качественное выявление дифтерийного токсина с помощью реакции преципитации в агаре, требует много времени и трудозатрат и не обеспечивает экспресс-диагностику ДИ.

Известен способ выявления дифтерийного токсина на основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием коммерческого эритроцитарного дифтерийного диагностикума (Инструкция по применению эритроцитарного дифтерийного антительного диагностикума для определения токсина в РГНА. Утв. МЗ СССР от 17.12.1991 г.). Материалом для исследования служит надосадочная жидкость суточной бульонной культуры дифтерийной палочки. Постановка РНГА осуществляется в микропланшетах для иммуннологических реакций. Учет результатов РНГА можно проводить уже через 1,5 - 2 час после ее постановки. Однако время проведения всего цикла исследования (от момента взятия материала от больного составляет 20 - 24 час). К тому же этот метод предлагает одновременное исследование проб от нескольких больных на одном планшете, что вынуждает накапливать пробы и замедляет анализ.

Сотрудниками НИИ детских инфекций МЗ и МП РФ и НИИ высокомолекулярных соединений АН РФ (Санкт-Петербург) разработан довольно простой и доступный метод качественного определения дифтерийного токсина в сыворотке крови больных ДИ на основе реакции латекс-агглютинации - РЛА (А.Ю. Меньшикова, А. С. Кветная, Ю.В. Харитонова и др. "Реакция латекс-агглютинации для выявления дифтерийного токсина в сыворотке больных дифтерийной инфекцией" Сб. тр. НИИ детских инфекций, СПб, 1994, вып. 4, с. 67 - 77). Однако этот метод требует приготовления латексного диагностикума и применим в основном для выявления токсина при токсических и субтоксических формах ДИ.

Наиболее близким к прилагаемому способу, является метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения дифтерийного токсина при помощи моноклональных антител. Сущность метода заключается в следующем: сорбированные на поверхности планшетов моноклональные антитела к COOH-концевому участку B-фрагмента молекулы дифтерийного токсина (антитоксина) связывают находящиеся в исследуемых пробах дифтерийной культуры молекулы дифтерийного токсина и не связывают другие продукты микробного или иного происхождения, обеспечивая тем самым исключительно высокую специфичность метода. Со свободными эпитопами молекул антигена, связанного моноклональными антителами на твердой фазе, взаимодействуют конъюгированные с пероксидазой поликлональные антитела. При наличии в анализируемых пробах (бульонной культуре дифтерийной палочки) искомого антигена (дифтерийного токсина), образовавшийся комплекс "моноклональные антитела - дифтерийный токсин - поликлональные антитела с пероксидазой" проявляются субстратной смесью перекиси водорода с 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК). При положительной реакции появляется красновато-коричневое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию токсина в пробе. Отсутствие окраски или меньшая ее интенсивность по сравнению с отрицательным контролем свидетельствует об отсутствии токсина в пробе. (И.К. Мазурова, Е.Е. Потемкина, В.В. Свиридов, Е.М. Зайцев "Детекция токсина и оценка степени токсинообразования C. diphtheriae с помощью иммуноферментного анализа". Ж. микроб., 1989 - N 6.- С. 66).

Следовательно, ИФА, по сравнению с другими методами, обладает рядом преимуществ, главным из которых является высокая чувствительность, возможность автоматизации и стандартизации основных ингредиентов. Однако, имеется ряд причин, сдерживающих его широкое использование для ускоренной диагностики ДИ. Во-первых, многоэтапность его выполнения исключает экспрессность. Во-вторых, этот метод не обеспечивает детекцию дифтерийного токсина в биологических жидкостях организма, а только в бульонной культуре дифтерийной палочки, что предполагает обязательное выделение возбудителя. Кроме того, применение этого метода требует дорогостоящего оборудования.

С целью устранения вышеуказанных недостатков - ускорения, повышения чувствительности и упрощения детекции дифтерийного токсина, продуцируемого коринебактериями непосредственно в исследуемых пробах, авторы предлагают способ иммунологической экспресс-диагностики ДИ. Поставленные авторами цели достигаются тем, что в отличие от известного способа, выявление дифтерийного токсина (на основе ИФА), авторы впервые предлагают проводить не в культуральной жидкости, а на эпителиоцитах слизистой ротоглотки, полученных из биоптата слизистой ротоглотки. Для получения биоптатов слизистой ротоглотки авторы впервые применили щеточку от эндоскопа, монтированную на держателе для бактериологических петель, что обеспечивает получение более информативного материала (по сравнению со смывами, полученными ватно-марлевыми тампонами) и ее многократное использование. Полученный с помощью щеточки, биоптат предварительно промывают в ФСБ (pH 7,2 - 7,4) с 0,05% твином-20, наносят на предметное стекло, фиксируют в нейтральном формалине, затем наносят моноклональные антитела к COOH-концевому участку B-фрагмента молекулы токсина с последующим нанесением поликлональных антител с пероксидазой. При наличии на эпителиоцитах дифтерийного токсина, образовавшиеся комплексы "моноклональнык антитела - дифтерийный токсин-поликлональные антитела с пероксидазой" являются субстратной смесью перекиси водорода 5-АСК. Учет реакции производится в светооптическом режиме микроскопа "Биолам" под иммерсией (об x 90, ок x 7). Продукт реакции (дифтерийный токсин) выявляется в виде красновато-коричневых гранул, различной интенсивности их окраски, размеров.

Анализ известных способов на дату подачи заявки показывает, что не существует подобных способов, позволяющих детекцию токсина на эпителиоцитах в слизистой ротоглотки при ДИ. Это позволяет нам сделать вывод о существенности отличий заявляемого способа.

Основные этапы проведения предполагаемого способа заключаются в следующем:
1. Получение биоптата слизистой ротоглотки с помощью щеточки от эндоскопа, монтированной на держателе.

2. Промывка в ФСБ (7,2 - 7,4) с 0,05% раствором твина-20 (5 мин).

3. Нанесение отмытых эпителиоцитов на предметное стекло.

4. Фиксация в холодном ацетоне (t +4^oC) (20 мин).

5. Обработка в 15 - 20% растворе сахарозы на ФСБ (pH 7,2 - 7,4) (30 мин).

6. Промывка в ФСБ (7,2 - 7,4) (30 мин).

7. Обработка перекисью водорода 0,3% водного раствора (30 мин).

8. Промывка в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (30 мин).

9. Нанесение на препарат моноклональных антител к COOH-концевой части B-фрагмента молекулы дифтерийного токсина (1 час, 37^oC).

10. Промывка в ФСБ (7,2 - 7,4) с 1% бычьим сывороточным альбумином (30 мин).

11. Нанесение на препарат поликлональных антител, конъюгированных пероксидазой (1 час, 37^oC).

12. Промывка в ФСБ (7,2 - 7,4) трижды по 5 мин.

13. Окраска водным раствором, содержащим 0,05% 5-АСК и 0,025% перекиси водорода (10 мин).

14. Окраска водным раствором (1 : 10) гематоксилина (10 мин).

Одновременно с постановкой реакции на предметных стеклах проставляются контрольные реакции с биоптатом слизистой здорового человека (отрицательный контроль) и очищенным дифтерийным токсином (анатоксином) с активностью 300 1F/мл (положительный контроль).

Использование предложенного нами способа выявления дифтерийного токсина непосредственно в биологическим материале в течение нескольких час (6 час), позволяет рассматривать его как экспресс-метод постановки этиологического диагноза ДИ.

Впервые, предложенный нами способ позволяет также выявить даже незначительные количества дифтерийного токсина, адсорбированного на мембранах чувствительного эпителия.

В качестве доказательств приводим следующие примеры:
1. П. Саша, 13 лет, и/б 2237, д-з: дифтерия ротоглотки, локализ форма:
кровь РЛА отр. (2 час)
культура ИФА пол. (48 час)
биоптат ИФА пол. (6 час)
2. Ч. Дима, 12 лет, и/б 1317, д-з: длительное бак/нос:
кровь РЛА отр. (2 час)
культура ИФА пол. (48 час)
биоптат ИФА пол. (6 час)
Приведенные примеры свидетельствуют о высокой чувствительности и экспрессности разработанного метода.

Кроме того, апробация способа на клиническом материале детей с ДИ и другими нозологическими формами (антигенами, инфекционный мононуклеоз) показала его высокую специфичность. Положительные результаты (обнаружение токсина в биоптатах) получены только при исследования проб от больных ДИ и носителей (таблица).

К вышеизложенному следует также добавить следующее преимущество способа в сравнении с прототипом. Впервые разработанный способ выявления дифтерийного токсина позволяет обнаруживать иммунные комплексы (дифтерийный токсин - IgG) у привитых и носителей, а также свободный токсин у непривитых, благодаря применению моноклональных антител к COOH-концевой части B-фрагмента молекулы дифтерийного токсина.

Таким образом, авторами впервые предложен способ экспресс-диагностики различных форм ДИ (в том числе и носительства), которые позволяют уже через 6 час после взятия материала (биоптата слизистой ротоглотки), избегая парентеральных вмешательств и выделения культуры возбудителя, основываясь на принципах иммунопероксидазного метода и результатов клинического и цитобактериоскопического исследований в первый день обследования установить ранний этиологический диагноз ДИ.

Изобретение может быть использовано, в частности в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний диагностики инфекций. Выявляют дифтерийный токсин в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител при этом постановку реакции осуществляют на эпителиоцитах слизистой ротоглотки, которые предварительно промывают в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,2 - 7,4 с 0,05% твином-20, биоптат слизистой ротоглотки наносят щеточкой от эндоскопа на стекло, фиксируют в ацетоне и обрабатывают в 15-20%-ном растворе сахарозы и ФСБ (7,2 - 7,4) с 1%-ным раствором бычьей сыворотки альбумина. Затем наносят моноклональные антитела к СООН-концевому участку В-фрагмента молекулы токсина с последующим нанесением поликлональных антител с пероксидазой и субстратной смеси 5-АСК и при выпадании антител красно-коричневого цвета диагностируют инфекцию. Способ обеспечивает ускорение, повышение чувствительности и упрощение детекции дифтерийного токсина. 1 табл.

Способ экспресс-диагностики дифтерийной инфекции путем выявления дифтерийного токсина в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител, отличающийся тем, что постановку реакции осуществляют на эпителиоцитах слизистой ротоглотки, которые предварительно промывают в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с pH 7,2 - 7,4 с 0,05% твином-20, наносят на предметное стекло, фиксируют в ацетоне, обрабатывают в 15 - 20%-ном растворе сахарозы и ФСБ (7,2 - 7,4) с 1%-ным раствором бычьей сыворотки альбумина, после чего наносят моноклональные антитела к COOH-концевому участку В-фрагмента молекулы токсина, а затем поликлональные антитела с пероксидазой и субстратную смесь - 5-АСК и при обнаружении в светооптическом микроскопе красно-коричневых гранул диагностируют дифтерийную инфекцию.