Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении. Создан вакцинный штамм вируса гриппа (Ortomyxoviridae, род Influenza) подтипа A(H7N9) - А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) для профилактики потенциально-пандемического гриппа подтипа A(H7N9) среди взрослых и детей в случае его распространения в человеческой популяции.
В начале 2013 г. впервые были зарегистрированы случаи заражения людей новым вирусом гриппа птиц подтипа A(H7N9), и по данным на ноябрь 2013 г. подтверждено инфицирование 139 людей, включая 45 смертельных случаев. Опасность данных вирусов заключается в том, что они вызывают тяжелые респираторные заболевания у млекопитающих, и при этом являются низкопатогенными для птиц, что способствует их персистенции в популяции птиц. Кроме того, вирусы A(H7N9) характеризуются наличием в геноме множественных маркеров адаптации к клеткам млекопитающих, что создает предпосылки для возникновения новой пандемии A(H7N9). Для того чтобы избежать разрушительных последствий новой пандемии, необходимо иметь в наличии вакцинные штаммы A(H7N9) для своевременной вакцинации наиболее уязвимых групп населения.
Применяемые в настоящее время для профилактики сезонного гриппа А вакцины подтипов A(H1N1) и A(H3N2) не могут вызывать выраженную защитную реакцию в случае возникновения пандемической ситуации, вызванной широким распространением вирусов подтипа A(H7N9), к которым у населения нет иммунитета.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), используя в качестве источника поверхностных антигенов вирус гриппа птиц А/Ануи/1/2013 (H7N9). Штамм А/Ануи/1/2013 (H7N9), выделенный от человека во время вспышки гриппа H7N9 в Китае в 2013 году, был получен из коллекции Центра по контролю и профилактике заболеваний США (CDC ID №2013759189).
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - температурочувствительный, холодоадаптированный штамм вируса гриппа, используемый для получения живых гриппозных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации, в результате чего образуются реассортанты с вакцинной формулой генома 6:2 - 6 генов, кодирующих внутренние белки вириона (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), наследуются от безвредного донора аттенуации, а два поверхностных антигена (гемагглютинин и нейраминидаза) наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма. Известен вакцинный штамм А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) [Патент №2183672, опубл. 20.06.02], а также вакцинный штамм А/17/Малайзия/04/11 (H3N2) [Патент №2319744, опубл. 19.04.06] на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Прототипом полученного вакцинного штамма подтипа A(H7N9) является вакцинный штамм подтипа A(H7N3) - А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) для профилактики гриппа в случае наступления пандемии, вызванной вирусами гриппа подтипа A(H7N3) [Desheva J, Rudenko L, Rekstin A, Swayne D, Cox N, Klimov A. Development of candidate H7N3 live attenuated cold-adapted influenza vaccine. In: Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza VI, Toronto, Ontario, Canada, June 17-23, 2007 (Ed. Jacqueline M Katz). (2007)]. Однако вирус гриппа подтипа A(H7N9) значительно отличается от вакцинного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) по антигенным свойствам, в результате чего иммунный ответ на вакцинацию вирусом А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) будет неэффективным в отношении нового вируса A(H7N9). Кроме того, один из важных антигенов вируса - гликозилированный белок нейраминидаза (NA) - существенно различается у вирусов H7N3 и H7N9: гомология по их аминокислотному составу не превышает 50% [Gamblin SJ, Skehel JJ. Influenza hemagglutinin and neuraminidase membrane glycoproteins. The Journal of biological chemistry 285(37), 28403-28409 (2010)]. Такие различия в последовательностях N3 и N9 нейраминидаз говорят о низкой вероятности выработки кросс-реактивных антинейраминидазных антител против NA подтипа N9 после вакцинации штаммом А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3).
Реассортантный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) был получен методом генетической реассортации потенциально-пандемического вируса гриппа А/Ануи/1/2013 (H7N9) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации, по методу, описанному ранее [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4, - С.387-395.]. Методом частичного секвенирования участков генов установлено, что вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу от эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9).
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ
Поверхностные антигены вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) гемагглютинин и нейраминидаза - являются идентичными родительскому вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9) по результатам их прямого нуклеотидного секвенирования.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВНУТРЕННИХ ГЕНОВ И НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ
Показано, что все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации [Klimov A.I., Сох N.J., Yotov W.V. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus. Virology. 1992:86:795-797], присутствуют в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) (табл.1). Дальнейшее полногеномное секвенирование вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) не выявило дополнительных мутаций во внутренних генах вируса.
АНТИГЕННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА
Изучение антигенных свойств показало, что эпидемический вирус А/Ануи/1/2013 (H7N9) и его холодоадаптированный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) являются антигенно идентичными (взаимодействие с гомологичной типоспецифической сывороткой согласно ФСП ЛСР-002340/09-250309 [Фармакопейная статья предприятия (ФГУП «НПО «Микроген») на Ультрагривак® - вакцину гриппозную живую для профилактики гриппа птиц. ФСП ЛСР-002340/09-250309]. Показатели взаимодействия вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) и родительского штамма А/Ануи/1/2013 (H7N9) с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Ануи/1/2013 (H7N9), были идентичными (табл.2).
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА
Для оценки генетической стабильности реассортантного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проводили 5 серийных пассажей в 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионах. После пассирования проводили полногеномный сиквенс вируса. Показано, что нуклеотидная последовательность вируса остается неизменной в результате серийных пассажей, что указывает на высокую степень генетической стабильности вакцинного штамма.
РЕПРОДУКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИННОГО ШТАММА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ
В таблице 3 представлены показатели репродукции в развивающихся куриных эмбрионах вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) при разных температурах инкубации. Показано, что реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проявлял высокую репродуктивную активность при оптимальной температуре инкубации 33°С. Подобно донорскому родительскому штамму А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), реассортантный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) приобрел ts- и са-фенотип. Он хорошо репродуцировался при пониженной до 26°С температуре и практически утратил способность к размножению при повышенной до 38-39°С температуры. Родительский вирус А/Ануи/1/2013 (H7N9), напротив, отличался температуроустойчивостью при 39°С и низкой репродукцией при 26°С.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-34°С в течение 48 часов - 10,2 lg ЭИД50/мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
Вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 40°С составляет 8,5 lg ЭИД50/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°С и 26°С равна 2,6 lg ЭИД50/мл).
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Пример получения вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) представлен в прилагаемом паспорте.
Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского 04.07.2013 года под №2738.
ПАСПОРТ ШТАММА
Пример. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИННОГО ШТАММА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ХОРЬКАХ
Известно, что наиболее пригодной моделью животных для изучения гриппозных вакцин являются хорьки (Mustela putoris furo). Гриппозная инфекция у этих животных и у человека сходна по симптоматике, течению инфекции, распространению вируса в организме и индукции гуморального иммунного ответа [Langlois I. Viral diseases of ferrets. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2005; 8 (1):139-160.]. Поэтому исследование безвредности и степени аттенуации вакцинного штамма А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) проводили на этих животных.
Хорьков заражали вакцинным штаммом А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) или родительскими вирусами интраназально 0,5 мл аллантоисной жидкости, содержащей 107 50%-ных эмбриональных инфицирующих доз вируса (ЭИД50). Репликацию вируса определяли путем титрования носовых смывов и мазков из зева хорьков каждые 2 сутки после заражения. Для титрования вируса использовали культуру клеток MDCK, а титры вируса выражали в 50%-ных тканевых цитопатических дозах (ТЦИД50). Также концентрацию вируса определяли в гомогенатах тканей зараженных животных (носовые ходы, трахея, легкие, мозг) на 4 сутки после введения вируса. Вакцинный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), как и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), являлся аттенуированным для хорьков, поскольку размножался только в тканях верхних дыхательных путей, но не в легких или мозге. Вирус дикого типа А/Ануи/1/2013 (H7N9) реплицировался до высоких титров в легких и тканях мозга, что говорит о его вирулентности (табл.4).
Иммуногенность вакцинного штамма оценивали путем определения титров сывороточных антигемагглютинирующих антител через 2 недели после иммунизации. Вакцинный реассортант А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) был иммуногенным для хорьков: среднегеометрический титр антител в реакции торможения гемагглютинации с гомологичным антигеном достигал значения 127 (табл.5).
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, безвредностью для хорьков, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации, а также иммуногенностью.
Характеристики полученного вакцинного штамма соответствуют требованиям Фармакопейной статьи ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения у взрослых и детей, поэтому заявляемый штамм обладает, помимо новизны и изобретательского уровня, техническим результатом, т.е. пригоден для производства живой гриппозной вакцины.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Гонконг/2017/75108 (H7N9) для производства потенциально пандемической живой интраназальной гриппозной вакцины | 2018 |
|
RU2685121C1 |
РЕАССОРТАНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА RN9/13-HUMAN A(H6N9) ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К НЕЙРАМИНИДАЗЕ ПРИ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ВАКЦИНАЦИИ | 2014 |
|
RU2587629C1 |
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/MALLARD/НИДЕРЛАНДЫ/00/95(H7N3) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ И ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН | 2012 |
|
RU2507256C2 |
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ И ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ | 2011 |
|
RU2464309C1 |
ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А/17/НОВАЯ КАЛЕДОНИЯ/99/145 (Н1N1) В КАЧЕСТВЕ ДОНОРА АТТЕНУАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПОДТИПА Н2N2, ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ ВИРУСА ГРИППА А/17/КАЛИФОРНИЯ/66/4412 (Н2N2) И А/17/ТОКИО/67/912 (Н2N2) (ВАРИАНТЫ). | 2011 |
|
RU2556834C2 |
Штамм вируса гриппа ИнфлюБакт-H7/PspA для производства комбинированной вакцины против вируса гриппа А и бактериальной пневмонии, вызываемой Streptococcus pneumoniae | 2021 |
|
RU2776196C1 |
ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/КАЛИФОРНИЯ/ 04/6 (Н3N2) И ДОНОР АТТЕНУАЦИИ А/ЛЕНИНГРАД/134/17/К7/57 (Н2N2) ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2006 |
|
RU2315101C2 |
РЕАССОРТАНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/СЕРЕБРИСТАЯ ЧАЙКА/САРМА/06/887 (H6N1) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ | 2015 |
|
RU2606026C1 |
Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/КАНЗАС/2017/631 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей | 2019 |
|
RU2732610C1 |
Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Гуандун-Маонань/2019/211 (H1N1)pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей | 2022 |
|
RU2793387C1 |
Изобретение относится к области микробиологии. Вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под №2738. Представленный вакцинный штамм А/17/Ануи/2013/61 (H7N9) характеризуется сочетанием таких полезных признаков как антигенная специфичность эпидемического вируса А/Ануи/1/2013 (H7N9), структура генома, оптимальная для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительность и холодоадаптированность, безвредност для хорьков, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации, а также иммуногенность. 5 табл.
Вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, А/17/Ануи/2013/61 (H7N9), депонированный в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского 04.07.2013 года под №2738, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.
DESHEVA J et al., Development of candidate H7N3 live attenuated cold-adapted influenza vaccine, In: Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza VI, Toronto, Ontario, Canada, June 17-23, 2007, International Medical Press Ltd., 2008, p.591-592 | |||
ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/СИДНЕЙ/97/76(Н3N2) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ | 1999 |
|
RU2159812C1 |
RU 2011128981 А 20.01.2013 |
Авторы
Даты
2015-09-20—Публикация
2013-12-30—Подача