СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII, ЛИНИЯ КЛЕТОК НКВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ БЕЛОК, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК C12P21/02 C12N5/10 C12N15/12 

Заявки, относящиеся к этой же тематике: Заявка Cho, обозначенная MSB-7241 (U.S. Ser. No. 09/209,920) "Гибридные клетки-хозяева человека для экспрессии генов млекопитающих" и заявка Cho и Chan, обозначенная MSB-7254 (U.S. Ser. No. 09/209,915) "Векторы с последовательностью концевого повтора вируса Эпштейна-Барр" содержат взаимосвязанный материал. Обе заявки зарегистрированы 10 декабря 1998.

Предшествующий уровень техники

Область: Данное изобретение относится к улучшенному способу получения фактора VIII и его производных. Способ в общем относится к конструированию векторов, трансфекции и выбору клеточных линий с улучшенной продукцией в безбелковых условиях. В частности это изобретение относится к процессу получения белка с прокоагулирующей активностью фактора VIII в промышленных масштабах.

Предшествующий уровень техники: Фактор VIII человека - это следовый гликопротеин плазмы, участвующий в качестве кофактора в активации факторов Х и IХа. Наследуемая недостаточность фактора VIII приводит к Х-связанному заболеванию гемофилии А, которое успешно лечится очищенным фактором VIII. Заместительная терапия гемофилии А развивалась от использования фактора VIII, получаемого из плазмы, до применения рекомбинантного фактора VIII, полученного клонированием и экспрессией кДНК фактора VIII в клетках млекопитающих (Wood et al., 1984, Nature 312: 330).

Фактор VIII имеет доменную организацию А1-А2-В-А3-С1-С2 и синтезируется в виде одноцепочечного полипептида из 2351 аминокислот, из которого вырезается сигнальный пептид из 19 аминокислот при транслокации в просвет эндоплазматического ретикулума. Из-за того, что фактор VIII плохо гликозилируется, было сложно достичь высокого уровня экспрессии (>0.2 пг/клетка/день) фактора VIII (Lind et al., 1995, Eur J Biochem. 232: 19-27; Kaufman et al., 1989, Mol Cell Biol. 9: 1233-1242). Экспрессия фактора VIII в клетках млекопитающих обычно на 2-3 порядка ниже, чем экспрессия других генов при использовании аналогичных векторов и методик. Продуктивность клеточных линий для получения фактора VIII находится в пределах 0.5-1 мкЕд/кл/д (0.1-0.2 пг/кл/д).

Было показано, что В-домен фактора VIII является несущественным для прокоагулирующей активности. Различные группы сообщали об улучшении экспрессии фактора VIII в клетках млекопитающих при использовании усеченных вариантов фактора VIII (Lind et al., 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Tajima et al., 1990, Proc 6^th Int Symp H.T. p.51-63; US Patent 5,661,008 Almstedt, 1997). Однако, уровень экспрессии вариантов фактора VIII оставался ниже 1 пг/кл/д для стабильного клона клеток.

Краткое изложение изобретения

Мы открыли (i) способ получения клеточных линий с очень высокой продуктивностью белков, обладающих прокоагулирующей активностью фактора VIII, и (ii) свободный от белков плазмы процесс получения белков, обладающих прокоагулирующей активностью фактора VIII.

Процесс получения белков, обладающих прокоагулирующей активностью фактора VIII, в промышленном масштабе. С использованием вновь созданных клеток хозяев были получены клоны клеток со специфической производительностью в пределах 2 - 4 пг/кл/д (10-20 мкЕд/кл/д). В бессывороточных условиях один клон поддерживал суточную продуктивность 2-4 пг/кл/д. Клоны с таким высоким уровнем продуктивности способны производить 3-4 миллиона единиц в день в 15-литровом перфузионном ферментере. По определению одна единица активности фактора VIII - это активность, содержащаяся в одном миллилитре плазмы. Один пг фактора VIII в общем эквивалентен 5 мкЕд активности FVIII.

В данной работе белок, обладающий прокоагулирующей активностью фактора VIII, - это белок, вызывающий активацию фактора Х в модельных системах in vivo и in vitro. В качестве неограничивающих примеров это определение включает полноразмерный рекомбинантный фактор VIII человека и фактор VIII с делетированным В-доменом, последовательность которого приведена на фиг.1.

Высокий уровень экспрессии белка, обладающего прокоагулирующей активностью фактора VIII, означает по крайней мере около 2 мкЕд/кл/д или более, предпочтительно 4 мкЕд/кл/д, наиболее предпочтительно 5 мкЕд/кл/д активности фактора VIII при наращивании в среде, свободной от белков плазмы; или по крайней мере 4 мкЕд/кл/д, предпочтительно 8 мкЕд/кл/д, наиболее предпочтительно 10 мкЕд/кл/д активности фактора VIII при наращивании в среде с добавлением полученного из плазмы белка. Если экспрессируемый белок - BDD-FVIII, то описанным здесь методом можно получить клеточные линии со специфической продуктивностью до 15 мкЕд/кл/д, предпочтительно до 20 мкЕд/кл/д.

При описании происхождения клеточных линий понятие "полученные из" неограниченно включает нормальное митотическое деление клеток и процессы типа трансфекции, слияния клеток или другие генноинженерные методы, используемые для изменения клеток или получения клеток с новыми свойствами.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - аминокислотная последовательность BDD-FVIII (SEQ ID NO:1).

Фиг.2 - последовательность концевого повтора (TR) из вируса Эпштейна-Барр (SEQ ID NO:2).

Фиг.3 - карта плазмиды pCIS25DTR.

Фиг.4(а) - получение клона 2OВ8.

Фиг.4(b) - сравнение продуктивности нескольких клонов в различных средах.

Представлены три пула данных двухмесячного исследования стабильности каждого клона.

Фиг.5 - объемная продуктивность клона 2OВ8.

Лучшие варианты осуществления изобретения

Исследование FVIII

Активность производных фактора VIII, полученных экспрессией рекомбинантного гена в метотрексат (МТХ)-устойчивых популяциях клеток, определяли хромогенным анализом. Активность измеряли при помощи набора Coatest® factor VIII:С/4 (Chromogenix, Molndal, Sweden) согласно инструкции производителя. В качестве стандартов измерения в этом исследовании использовали анти-гемофилийный фактор (фактор VIII) стандарта США, известный как MEGA I (Office of Biologics Research and review, Bethesda, MD). См. Barrowcliffe, 1993, Thromb Haem 70: 876.

Конструирование векторов экспрессии для FVIII с делетированным В-доменом

Последовательность FVIII с делетированным В-доменом (BDD) представлена на Фиг.1. 90-кДа и 80 кДа-цепи были соединены линкером, состоящим из 14 аминокислот. См. Chan, S.-Y., "Получение рекомбинантного фактора VIII в присутствии липосомоподобных веществ сложного состава" ("Production of Recombinant Factor VIII in the presence of Liposome-like Substances of Mixed Composition"), заявка на Патент США N 08/634,001, зарегистрированная 16 апреля 1996. Вектор экспрессии для BDD-FVIII был получен с использованием стандартных методов для рекомбинантных ДНК. Структура вектора экспрессии (pCIS25DTR) представлена на Фиг.3. Вектор содержит область транскрипции для BDD-FVIII и селективный маркер, дигидрофолят редуктазу (dhfr). Кроме того, для повышения эффективности интеграции в вектор была включена последовательность концевого повтора из вируса Эпштейна-Барр (Фиг.2), который обладает повышенным уровнем лекарственной селекции. Вектор по существу является конструкцией вектора (помещенного в АТСС под номером 98879), который был создан для включения транскрипционного участка, соответствующего последовательности, показанной на Фиг.1. Дополнительную информацию о последовательности концевого повтора можно найти в родственной патентной заявке Cho и Chan, обозначенной MSB-7254, включенной в данное описание путем ссылки, "Последовательность концевого повтора вируса Эпштейна-Барр повышает уровень лекарственной селекции", зарегистрированной в тот же день, что и данная заявка.

Специалисты в данной области техники могут конструировать и использовать аналогичные векторы для получения клеток, экспрессирующих белки, обладающие прокоагулирующей активностью фактора VIII. Например, кодирующие последовательности известных вариантов фактора VIII, сохраняющих прокоагулирующую активность, могут быть заменены на кодирующую последовательность BDD-FVIII. Также, вместо dhfr можно использовать другие селективные маркеры, такие как глутамин синтетаза (gs) или ген устойчивости к нескольким лекарствам (mdr). Выбор агента селекции должен проводиться согласно фактам, известным в данной области техники, т.е. для dhfr предпочтительным агентом селекции является метотрексат, для gs - метионин сульфоксиимин, а для mdr - колхицин.

Примеры

Получение клеточных линий, экспрессирующих BDD-FVIII: Трансфекция. селекция по лекарству и амплификация гена.

Клетки НКВ11 (депозитарный номер в АТСС - CRL 12568 - гибрид клеток 293S и человеческих клеток лимфомы Беркитта, см. заявку на Патент США Cho et al., поданную в тот же день, что и данная заявка, и обозначенную MSB-7241, включенную в данное описание путем ссылки) были трансфицированы 30 микрограммами ДНК pCIS25DTR методом электропорации при 300 вольт и 300 микрофарад (ВТХ Electro cell Manipulator 600) при использовании 2-мм кюветы (ВТХ #620). В сравнительном эксперименте, проведенном параллельно с клетками НКВ11, клетки CHO (яичника китайских хомяков) и 293S (почки эмбриона человека) трансфицировали при использовании катионного липидного реагента DMRIE-C (Life Technologies, Gaithersburg, MD) согласно протоколу, предлагаемому Life Technologies. Амплификацию трансфицированных клеток проводили при возрастающих концентрациях метотрексата (МТХ) (100 нМ, 200 нМ, 400 нМ и 800 нМ) при 1×10⁶ клеток на 96-луночный планшет в МТХ-селективной среде без гипоксантина и тимидина (среда DME/F12 без тимидина и гипоксантина с добавлением 5% диализованной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), поставляемой Hyclone, Logan, UT). Были учтены выросшие МТХ-устойчивые клетки и примерно через 2-3 недели после трансфекции была проверена секреция BDD-FVIII при использовании набора Coatest® factor VIII. Культивирование клеток проводили при 37°С в увлажняемом инкубаторе при 5% СО₂.

Клонирование с конечным разведением

Клоны единичных клеток (SCC) были получены при клонировании с конечным разведением (LDC) высоко продуцирующих популяций в 96-луночных планшетах в бессывороточных условиях. Клетки сеяли в количестве 1-10 клеток на лунку в среду DME/F12 с добавлением 10 мкг/мл рекомбинантного инсулина Humulin® (Lilly, Indianapolis, IN), 10X незаменимых аминокислолт (Life Technology, Gaithersburg, MD) и белковой фракции плазмы человека Plasmanate® (Bayer, Clayton, NC). Белковая фракция плазмы человека (НРР) Plasmanate® содержит человеческий альбумин (88%) и различные глобулины (12%). Клоны проверяли на продуцирование BDD-FVIII при использовании наборов Coatest® factor VIII. Клоны с наибольшей продуктивностью отбирали по оценке стабильности в шейкерных флаконах. Для клеток НКВ первый этап клонирования проводили при использовании селективной среды с добавлением 5% диализованной FBS. Второй этап клонирования проводили в среде без сыворотки, но с добавлением белковой фракции плазмы человека Plasmanate® при использовании первичных клонов единичных клеток, адаптированных в бессывороточной среде с добавлением белковой фракции плазмы человека Plasmanate®.

Получение клона НКВ 2OВ8

Как показано на Фиг.4(а), первичная популяция 1С1О была получена из клеток НКВ, трансфицированных pCIS25DTR, после амплификации с 400 нМ МТХ в селективной среде с 5% FBS. Один из первичных клонов единичных клеток (SCC), 1ОА8, полученный из 1С1O клонированном с конечным разведением при использовании селективной среды с добавлением 5% FBS, был адаптирован в бессывороточной среде с добавлением белковой фракции плазмы человека Plasmanate®. Неожиданно оказалось, что клон 1ОА8 обладает сильно повышенным уровнем продукции rFVIII на этом этапе (Фиг.4b). Таким образом, было проведено второе клонирование с конечным разведением в среде с добавлением белковой фракции плазмы человека Plasmanate®. Продуктивность клонов SCC (например, 2OВ8), полученных при втором клонировании с конечным разведением, была аналогична продуктивности клона 1ОА8, адаптированного при добавлении белковой фракции плазмы человека Plasmanate®. Клон 2ОВ8 обладал более высокими уровнями BDD-FVIII, чем исходный клон 1ОА8, полученный при первом клонировании с конечным разведением в среде, содержащей сыворотку. В заключение клон 2ОВ8 был адаптирован к росту в среде без белков плазмы (PPF). Образцы клона 2ОВ8 были помещены в Американскую Коллекцию Типов Культур (АТСС) (Manassas,VA) (номер в АТСС: CRL-12582).

Как показано в Таблице 1, клоны НКВ обладают сверхпродуктивностью по BDD-FVIII. В клетках НКВ наблюдалось 10-20-кратное увеличение продуктивности по сравнению с клонами, полученными после трансфекции клеток СНО и 293S. Клетки НКВ, не образующие больших клеточных агрегатов при росте в суспензионной культуре, являются предпочтительными для экспрессии белков, обладающих прокоагулирующей активностью фактора VIII.

Таблица 1Экспрессия FVIII и BDD-FVIII в клеточных линиях человека и грызунов Специфическая продуктивность (мкЕд/кл/д)*Производные FVIIIВНК293SСНОНКВПолноразмерный FVIII0.451.20.51.0BDD-FVIIIН.о.2.51.020*Среднее значение для 5 высокопродуцирующих клонов (в бессывороточной среде) И.о.= не определено

Адаптация клонов при отсутствии белков плазмы

Клоны НКВ, адаптированные к росту в виде бессывороточных суспензионных культур, далее адаптировали к росту без добавок белков плазмы. Этот процесс проводили в стерильных поликарбонатных шейкерных флаконах (Cornig, Cornig, NY) при плотности клеток примерно 0.5×10⁶ кл/мл при использовании среды, свободной от белков плазмы. Средой, свободной от белков плазмы (PPF), являлась среда DME/F12 с добавлением плуроника F68 (0.1%), CuSO₄ (50 нМ) и FeSO₄/EDTA (50 мкМ). Полную замену среды проводили каждые 48 часов, и шейкерные флаконы снова засевали при плотности 0.5×10⁶ кл/мл.

Ферментация клона 2OВ8

Продуктивность клона 2OВ8 оценивали в 15-литровом перфузионном ферментере. Ферментер засевали клетками клона 2OВ8 при плотности около 3×10⁶ кл/мл. Ферментер орошался со скоростью 4 объема в день бессывороточной средой, как описано в предыдущем абзаце. Во время периода оценки (45 дней) поддерживалась конечная плотность клеток 2×10⁷. Как показано на Фиг.5, в течение первых 4 недель ферментации клетки клона 2OВ8 орошались бессывороточной средой с добавлением белковой фракции плазмы человека Plasmanate® и были способны поддерживать высокую продуктивность. С 28 дня до конца ферментации клетки орошались той же бессывороточной средой, но без белковой фракции плазмы человека Plasmanate®. Как показано на Фиг.5, клетки продолжали продуцировать FVIII на высоком уровне в среде без белков плазмы. "Среда, свободная от белков плазмы" означает, что никаких белков, выделяемых из плазмы, к среде не добавлялось.

Обсуждение

Получение клеток НКВ обеспечивает безбелковую систему для получения не только BDD-FVIII, но и других терапевтических белков. Белки, полученные в клетках НКВ, гликозилированы по человеческой модели, что может увеличить время полужизни некоторых гликопротеинов in vivo. Эти клетки также могут быть использованы для получения аденовирусных и адено-ассоциированных линий, разрабатываемых для целей генотерапии.

Вышеприведенные примеры предназначены для иллюстрации изобретения, и специалисты в данной области техники могут использовать их варианты. Соответственно предполагается, что объем заявки ограничивается только нижеприведенной формулой изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения белка, обладающего активностью фактора VIII, в промышленных масштабах. Проводят трансфекцию клеток НКВ вектором pCIS25DTR, содержащим селективный маркер и последовательность, кодирующую белок, обладающий прокоагулирующей активностью фактора VIII. Отбирают клетки при помощи агента селекции и выделяют клоны, экспрессирующие на высоком уровне белок, обладающий прокоагулирующей активностью фактора VIII. Изобретение позволяет получить белок, обладающий активностью фактора VIII, с высоким выходом, а также линию клеток НКВ с улучшенной продукцией в безбелковых условиях. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

1. Способ получения и выделения белка, обладающего активностью фактора VIII, включающий выращивание НКВ клеток, обозначенных Американской коллекцией типов культур (АТСС) как CRL-12568, или НКВ 10А8 клеток, трансфицированных pCIS25DTR, или НКВ 1С10 клеток, трансфицированных pCIS25DTR, или НКВ 20В8 клеток, обозначенных как АТСС CRL-12582, которые содержат последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью фактора VIII, оперативно связанную с промотором, причем выращивание осуществляется в условиях, достаточных для экспрессии белка, обладающего активностью фактора VIII, и выделение белка, обладающего активностью фактора VIII.2. Способ по п.1, в котором белок имеет аминокислотную последовательность, обозначенную как SEQ ID NO:1.3. Способ по п.1, в котором белок экспрессируется на уровне, по крайней мере, 2 мкЕ/кл/д, когда клетки выращивают в среде, свободной от белков плазмы.4. Способ по п.3, в котором белок экспрессируется на уровне, по крайней мере, 4 мкЕ/кл/д.5. Способ по п.4, в котором белок экспрессируется на уровне, по крайней мере, 5 мкЕ/кл/д.6. Линия клеток НКВ 10А8, трансфицированная pCIS25DTR, которая экспрессирует белок, обладающий активностью фактора VIII.7. Линия клеток НКВ 1С10, трансфицированная pCIS25DTR, которая экспрессирует белок, обладающий активностью фактора VIII.8. Линия клеток НКВ 20В8, АТСС CRL-12582, которая экспрессирует белок, обладающий активностью фактора VIII.