СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКОВ, МЕЧЕННЫХ МЕТАЛЛОМ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 G01N27/26 

Описание патента на изобретение RU2249217C2

Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, а именно к диагностике патологических состояний при анализе биологического объекта.

Используемые в настоящее время методы диагностики требуют сложного и дорогостоящего оборудования, т. к. они основаны на спектрофотометрической регистрации аналитического сигнала. Применяемые в этом методе в качестве метки антитела против человеческих иммуноглобулинов конъюгированы с ферментом пероксидазой хрена. Процесс конъюгирования является дорогостоящей, трудоемкой процедурой, кроме того, фермент как органическая макромолекула со специфической функцией не устойчив. В случае электрохимического способа определения необходимо привлечение дополнительных медиаторных систем, которые являются также неустойчивыми реагентами.

Известен способ определения патологических состояний, в котором используют человеческий сывороточный альбумин и ионы висмута в качестве модели для иммуноэлектрохимического анализа. Комплексообразователь, используемый для конъюгации антител и ионов висмута - диэтилтриаминпентаацетат (ДТА). Подложка - электроды, изготовленные методом трафаретной печати. На поверхность электродов наносят раствор нечеловеческого сывороточного альбумина (ЧСА), затем инкубируют 30 минут в блокирующем растворе (фосфатный буфер рН=7.2, твин-20) и стандартный раствор, содержащий 10 мг/мл ЧСА-ДТА-Висмут. Сигнал регистрируют методом инверсионной потенциометрии. Берут свободный реагент, содержащий 1,0 М раствор соляной кислоты и 20 мг/мл Hg2+, капают на рабочую поверхность. Ртуть, совместно выделенная, после покрытия образует нерастворимое соединение с висмутом. Потенциограмму регистрируют одновременно с процессом химического окисления (J. Wang and В. Tian "Thick-Film Electrochemical Immunosensor Based on Stripping Potentiometric Detection of a Metal Ion Label." Anal.Chem. 1998, 70, 1682-1685).

Недостатком такого способа является применение в процессе анализа соединений ртути, которые являются токсичными, а также высокая трудоемкость и сложность процесса.

Известен способ определения патологических состояний, при котором диагностируют Hanta-вирус в плазме крови. Анализ основан на образовании иммунокомплекса антиген-антитело с последующим взаимодействием в растворе антител против человеческих антител, меченных пероксидазой. В реакционную смесь добавляют H2O2 и KI. Последующую детекцию пероксидазной метки проводят в режиме амперометрии. Энзим служит катализатором при окислении иодида в йод в присутствии перекиси. Регистрируют ток восстановления йода (Rajesh Krishan, Andrey L. Ghindilis, Plamen Atanasov, Ebtisam Wilkins, Jim Montoya, and Frederick T.Koster "Fast Amperometric Immunoassay for Hantavirus Infection". Electroanalysis 1996, 8, №12, 1131-1134).

Недостатком такого способа является применение в анализе дорогостоящего неустойчивого фермента, а также необходимость использования дополнительных реактивов (Н2О2 и KI). Детекцию метки проводят косвенно, предварительно окислив иодид, а только затем регистрируют восстановление иода.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения патологических состояний биологических объектов, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, присоединение метки к иммунокомплексу и последующую детекцию метки для оценки патологического состояния. При этом используют коллоидное золото в качестве иммуноэлектрохимической метки с гусиными иммуноглобулинами против человеческих антител (М.В. Gonzales Garsia, A. Costa Garsia "Adsorptive stripping voltammetric behaviour of colloidal gold and immunogold on carbon paste electrode". Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38, 1995, стр. 389-395).

Недостатком данного способа является следующее: применяемые в этом способе антитела - гусиные иммуноглобулины против человеческих антител являются дорогими реактивами, также этот способ неприменим ни к одной диагностически значимой, реальной системе по определению белков или макромолекул.

Предлагаемое изобретение направлено на упрощение метода анализа, снижение его стоимости, повышение достоверности результатов диагностирования, расширение спектра определяемых объектов.

Это достигается тем, что в качестве электрода используют толстопленочный графитсодержащий электрод, иммунокомплекс на котором включает антиген, антитело и метку, причем в качестве метки используют конъюгат белка неимунного происхождения и металлов, при этом о патологическом состоянии судят по реакции окисления металлов.

Указанные отличительные признаки существенны. Использование толстопленочного графитсодержащего электрода, обладающего высокой сорбционной способностью обеспечивает устойчивое формирование иммунокомплекса с последующей инкубацией в растворе белка неиммунного происхождения, меченного металлом. Применение белка неимунного происхождения конъюгированного с металлом в качестве метки существенно удешевляет и упрощает процесс диагностирования и с учетом оценки по реакции окисления металлов повышает точность и достоверность определения.

На фигуре 1 изображен общий вид разового толстопленочного графитового электрода, где 1 - подложка из стеклотекстолита, 2 - дорожка из графитовой пасты, 3 - слой изолятора или цементита, 4 - рабочая поверхность электрода. Предлагаемое изобретение характеризуется следующими примерами.

На фигуре 2 изображены анодные вольтамперограммы окисления золота, зарегистрированные, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.

На фигуре 3 изображены анодные вольтамперограммы окисления серебра, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.

На фигуре 4 изображены анодные вольтамперограммы окисления серебра, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.

На фигуре 5 изображены анодные вольтамперограммы, зарегистрированные, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего антитела к альфа-фетопротеинам, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего антитела к альфа-фетопротеинам.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В качестве подложки берут разовый толстопленочный графитовый электрод с плоской поверхностью. На подложку из стеклотекстолита 1 наносят дорожку из графитовой пасты 2. После отверждения пасты при 120°С изолируют нерабочую поверхность электрода цементитом 3. На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при температуре 37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного коллоидным золотом. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М соляная кислота. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 1,0 В (окисление золота) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенпиостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.2). В организме пациента обнаружено 0,002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.

Пример 2.

На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Проводят инкубацию с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.3). В организме пациента обнаружено 0,002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.

Пример 3.

На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.4). В организме пациента обнаружено 0,00002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.

Пример 4.

На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (альфа-фетопротеина). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в высокоспецифической фракции антител (иммуноглобулинов G из гипериммунных сывороток) в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют буферный раствор при рН=7,2. Концентрация антител - 0,005 мг/мл. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.5).

Использование предлагаемого способа позволяет упростить и удешевить процедуру электрохимического анализа за счет использования в качестве подложки разового графитового толстопленочного электрода, более доступного по получению и дешевого конъюгата белка не иммунного происхождения и металла, проведением в предлагаемом способе окисления металла методом анодной вольтамперометрии.

Похожие патенты RU2249217C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ/АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ 2013
  • Козицина Алиса Николаевна
  • Малышева Наталья Николаевна
  • Глазырина Юлия Александровна
  • Матерн Анатолий Иванович
  • Иванова Алла Владимировна
RU2550955C1
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 2013
  • Козицина Алиса Николаевна
  • Митрофанова Татьяна Сергеевна
  • Матерн Анатолий Иванович
RU2538153C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2009
  • Брайнина Хьена Залмановна
  • Козицина Алиса Николаевна
  • Глазырина Юлия Александровна
  • Ходос Марк Яковлевич
RU2397243C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В АНАЛИЗИРУЕМОЙ СРЕДЕ 2013
  • Козицина Алиса Николаевна
  • Малышева Наталья Николаевна
  • Глазырина Юлия Александровна
  • Матерн Анатолий Иванович
RU2542487C2
СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БИОМОЛЕКУЛ, УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ И ЕГО ВАРИАНТ 2008
  • Кузнецова Алина Александровна
RU2386135C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ МЕТКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ 2015
  • Козицина Алиса Николаевна
  • Свалова Татьяна Сергеевна
  • Глазырина Юлия Александровна
  • Матерн Анатолий Иванович
RU2612143C2
Способ потенциометрической диагностики лейкоза крупного рогатого скота 2021
  • Якупов Талгат Равилович
  • Зиннатов Фарит Фатихович
  • Якупов Айрат Талгатович
  • Маслеников Никита Николаевич
RU2757078C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛЕДОВ ТЯЖЕЛЫХ И ТОКСИЧНЫХ МЕТАЛЛОВ 1997
  • Брайнина Х.З.
  • Иванова А.В.
  • Сараева С.Ю.
  • Стожко Н.Ю.
  • Малахова Н.А.
RU2124720C1
Рекомбинантные белки, содержащие антигенные эпитопы белков Core, Small Envelope, NS2A и preM вируса Зика, и комплексный антиген, содержащий указанные белки и используемый в качестве компонента иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и M к вирусу Зика 2017
  • Пьянков Степан Александрович
  • Агафонов Александр Петрович
  • Ружкова Алеся Александровна
  • Максимов Николай Львович
  • Потеева Елена Ильинична
  • Жерновая Лариса Дмитриевна
  • Максютов Ринат Амирович
RU2661085C1
СПОСОБ МНОГОАНАЛИТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОЧАСТИЦ 2008
  • Осин Николай Сергеевич
RU2379691C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 249 217 C2

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКОВ, МЕЧЕННЫХ МЕТАЛЛОМ

Изобретение относится к области электрохимических методов анализа. Способ заключается в инкубировании в сыворотке крови антигена, иммобилизованного на поверхности графитового электрода, дальнейшем инкубировании с раствором белка, меченного металлом, и помещением в трехэлектродную ячейку, где определяют антитела по реакции окисления металла. Способ позволяет упростить метод анализа, повысить достоверность результатов диагностирования. 5 ил.

Формула изобретения RU 2 249 217 C2

Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, отличающийся тем, что для образования иммунокомплекса инкубируют в сыворотке крови антиген, иммобилизованный на поверхности толстопленочного графитового электрода, промывают электрод буферным раствором и инкубируют с раствором белка не иммунного происхождения, меченного металлом, с последующей повторной промывкой буферным раствором и помещают в трехэлектродную ячейку, в которой определяют специфические антитела по реакции окисления металла.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2249217C2

WO 9101003, 24.01.1991
ЕР 0529645, 03.03.1993
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛЕДОВ ТЯЖЕЛЫХ И ТОКСИЧНЫХ МЕТАЛЛОВ 1997
  • Брайнина Х.З.
  • Иванова А.В.
  • Сараева С.Ю.
  • Стожко Н.Ю.
  • Малахова Н.А.
RU2124720C1

RU 2 249 217 C2

Авторы

Брайнина Х.З.

Козицина А.Н.

Шарафутдинова Е.Н.

Иванова А.В.

Рубцова М.Ю.

Сергеев Б.М.

Даты

2005-03-27Публикация

2002-06-18Подача