ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/02 C12Q1/04 G01N33/53 B82B1/00 

Изобретение относится к электрохимическим методам анализа, а именно к иммуноанализу, в частности к определению содержания микроорганизмов в различных объектах и средах. Изобретение может быть использовано в микробиологии, медицине, экологии для мониторинга содержания микроорганизмов в природных объектах и дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний.

Недостатками используемых в настоящее время методов являются:

низкая чувствительность (реакции агглютинации), высокая стоимость используемых реагентов и оборудования (иммуноферментный анализ), необходимость создания специальных условий (метод анализа, основанный на полимеразной цепной реакции) и длительность проведения анализа (бактериальный посев).

Известен способ определения патогенных микроорганизмов, где в качестве электроактивной сигналообразующей метки использовали наночастицы золота, к которым посредством меркаптоундекановой кислоты присоединяли антитела. В данном способе на поверхности электрода реализована сэндвич-система «антитело - антиген - антитело, меченное нанозолотом». Отклик от нанометки детектировали методом молекулярной абсорбции в фосфатном буфере (Gold nanoparticles as colorimetric sensor: A case study on E. Coli 0157:H7 as a model for Gram-negative bacteria/Haichao Su, Qiang Ma, Kun Shang and oth.// Sensors and Actuators B: Chemical. - 2012. - № 161. - P.298-303).

Недостатком предложенного способа является низкая чувствительность.

Известен способ определения микроорганизмов E.coli 0157:H7 с использованием магнитных шариков, покрытых антителами, посредством авидин-биотинного взаимодействия. Несвязавшиеся компоненты и конъюгаты разделяли с помощью магнитной сепарации. Способ регистрации отклика - флуоресцентный (Detection of E.Coli 0157:H7 by immunomagnetic separation coupled with fluorescence immunoassay/Penxuan Zhu, Daniel R. Shelton, Shuhong Li and oth.// Biosensors and Bioelectronics. - 2011. - № 30. - P.337-341).

К недостаткам предложенного способа можно отнести высокую погрешность в определении, поскольку микроорганизмы также обладают флуоресцентными свойствами, а следовательно, обеспечивают высокий фоновый сигнал; а также дороговизну применяемого оборудования.

Описан способ определения микроорганизмов, основанный на принципах электрохимической импедансной спектроскопии. В качестве рабочего использовали золотой электрод, модифицированный антителами, меченными наночастицами золота. Регистрируемый параметр -сопротивление рабочего электрода, которое зависит от количества микроорганизмов на его поверхности. В качестве редокс-медиатора использовали систему K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] (Self-assembled monolayers-based immunosensor for detection of Escherichia coli using electrochemical impedance spectroscopy/ Ping Geng, Xinai Zhang, Weiwei Meng and oth// Electrochimica Acts. - 2008. - № 53. - P.4663-4668).

Недостатками способа являются низкая чувствительность и высокая погрешность определения, вызванные невозможностью точно воспроизвести поверхность электрода от эксперимента к эксперименту, а также необходимость строгого соблюдения условий эксперимента.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения патогенных микроорганизмов, включающий конъюгацию микроорганизма с магнитными наночастицами в анализируемой среде с последующим концентрированием конъюгатов и определением наличия и концентрации микроорганизмов с помощью электроактивной сигналообразующей метки. В качестве магнитных наночастиц и, одновременно, электроактивной сигналообразующей метки авторы использовали наночастицы переходного металла. Перед концентрированием меченых конъюгатов наночастицы, не связанные с микроорганизмами, выводили из анализируемой среды. Концентрирование меченого конъюгата осуществляли путем формирования на электроде иммунокомлекса «меченный магнитной меткой микроорганизм - антитело» с последующим изъятием иммунокомплекса из среды на электроде. Далее проводили кислотную обработку электрода, содержащего меченный иммунокомплекс. Определение наличия и концентрации микроорганизмов осуществляли по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, получаемых путем кислотного разрушения иммунокомплекса (Патент РФ № 2397243 от 20.08.2010).

К недостаткам данного способа следует отнести многостадийность процесса анализа, низкий предел обнаружения, высокую трудоемкость процесса, большие временные затраты, а также высокие требования к квалификации операторов.

Предлагаемое техническое решение направлено на упрощение анализа, увеличение чувствительности, экспрессности, воспроизводимости, а также на расширение круга электрохимически активных меток.

Предлагаемый способ электрохимического иммуноанализа включает в себя конъюгацию микроорганизмов с магнитными наночастицами, магнитную сепарацию с последующим концентрированием конъюгатов и определением наличия и концентрации микроорганизмов с помощью сигналобразующей метки, локализованной путем образования иммунокомплекса на поверхности электрода, в качестве которой выступают магнитные наночастицы переходных металлов и их оксидов, модифицированные биосовместимыми полимерами. Концентрацию микроорганизмов определяют путем получения прямого электрохимического отклика от наночастиц переходных металлов и их оксидов, регистрируемого в результате электрохимического превращения магнитных наночастиц.

Получение электрохимического отклика от метки в результате разряда непосредственно магнитных наночастиц позволит увеличить экспрессность и чувствительность способа определения патогенных микроорганизмов.

Строение биосовместимых полимеров, выступающих в качестве модификаторов поверхности наночастиц, сходно со строением мембраны микробной клетки, поэтому данное покрытие облегчает поглощение наночастиц клетками микроорганизмов, что позволит значительно увеличить чувствительность. Кроме того, модификация поверхности магнитных наночастиц биополимером приводит к уменьшению поверхностной энергии наночастиц и позволит предотвратить их агрегацию, в результате чего размер частиц не изменяется в течение эксперимента. Таким образом, применение модификатора позволит добиться высокой воспроизводимости анализа.

Использование органических растворителей (в том числе апротонных) позволит существенно расширить рабочий диапазон потенциалов, а следовательно, и круг потенциальных электрохимически активных меток.

А также предложенный способ иммуноанализа позволит существенно снизить материало- и трудозатраты на проведение анализа, увеличить производительность и уменьшить себестоимость определения.

Таким образом, из патентной и научно-технической литературы не известен способ определения патогенных микроорганизмов заявляемой совокупности признаков.

На фиг. 1 изображен общий вид рабочего электрода, где 1 -подложка из стеклотекстолита, 2 - дорожка из токопроводящего материала (графит, золото, платина), 3 - слой изолятора или цементита.

На фиг. 2 представлены анодные вольтамперограммы, зарегистрированные в модельных растворах, содержащих (а, 4-5) микроорганизмы E.Coli и не содержащих (б, 4-5) микроорганизмы E.Coli.

4 - вольтамперограмма фонового электролита, 5 - вольтамперограмма пробы.

На фиг. 3 представлены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 6-7) и не содержащих (б, 6-7) микроорганизмы E.Coli.

6 - вольтамперограмма фонового электролита, 7 - вольтамперограмма пробы.

На фиг. 4 представлены анодные вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 8-9) и не содержащих (б, 8-9) микроорганизмы Salmonella typhimnriiim.

8 - вольтамперограмма фонового электролита, 9 - вольтамперограмма пробы.

На фиг. 5 представлены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 10-11) и не содержащих (б, 10-11) микроорганизмы Salmonella typhimurium.

10 - вольтамперограмма фонового электролита, 11 - вольтамперограмма пробы.

На фиг. 6 представлены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 12-13) и не содержащих (б, 12-13) микроорганизмы E.Coli.

12 - вольтамперограмма фонового электролита, 13 -вольтамперограмма пробы.

На фиг. 7 представлены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 14-15) и не содержащих (б, 14-15) микроорганизмы E.Coli.

14 - вольтамперограмма фонового электролита, 15 -вольтамперограмма пробы.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Вытяжку анализируемой среды (модельного раствора) инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°C. После инкубации несвязавшиеся наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают платиновый электрод (фиг.1), модифицированный антителами против E.Coli (штамм O-12), и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности сенсора используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в электрохимическую ячейку. В качестве фонового электролита используют раствор LiClO₄ в ацетонитриле. В качестве аналитического сигнала используют электрохимический отклик окисления предварительно восстановленного магнетита, локализованного в иммунокомплексе на поверхности платинового электрода. Для проведения холостого опыта используют раствор, не содержащий микроорганизмы E.Coli (штамм O-12) (фиг.2). В модельном растворе обнаружили 10³ клеток/мл микроорганизма E.Coli (штамм O-12).

Пример 2

Вытяжку анализируемой среды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°C. После инкубации несвязавшиеся наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают платиновый электрод (фиг.1), модифицированный антителами против E.Coli (штамм O-12), и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности сенсора используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20.

Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в электрохимическую ячейку. В качестве фонового электролита используют раствор LiClO₄ в ацетонитриле. В качестве аналитического сигнала используют электрохимический отклик окисления предварительно восстановленного магнетита, локализованного в иммунокомплексе на поверхности платинового электрода. Для проведения холостого опыта используют раствор, не содержащий микроорганизмы E.Coli (штамм O-12) (фиг.3). В пробе, взятой у пациента, обнаружили 2,05×10² клеток/мл микроорганизма E.Coli (штамм O-12).

Пример 3

Вытяжку из пробы анализируемого объекта инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°C. Несвязавшиеся наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают толстопленочный графитовый электрод (фиг.1), модифицированный антителами против Salmonella typhimurium (штамм SL 7207), и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в электрохимическую ячейку. В качестве фонового электролита используют раствор LiClO₄ в диметилсульфоксиде (ДМСО). В качестве аналитического сигнала, используют электрохимический отклик окисления предварительно восстановленного магнетита, локализованного в иммунокомплексе на поверхности рабочего электрода. Для проведения холостого опыта используют раствор, не содержащий микроорганизмы Salmonella typhimurium (штамм SL 7207) (фиг.4). В пробе, взятой у пациента, обнаружили 4×10² клеток/мл микроорганизма Salmonella typhimurium штамм SL 7207.

Пример 4

Вытяжку пробы инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами MgFe₂O₄ при температуре 37°C. Несвязавшиеся наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают золотой электрод (фиг.1), модифицированный антителами против Salmonella typhimurium (штамм SL 7207) и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности сенсора используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в электрохимическую ячейку. В качестве фонового электролита используют раствор соляной кислоты. В качестве аналитического сигнала, используют электрохимический отклик окисления наночастиц, локализованных в иммунокомплексе на поверхности рабочего электрода. Для проведения холостого опыта используют раствор, не содержащий микроорганизмы Salmonella typhimurium (штамм SL 7207) (фиг.5). В пробе, взятой у пациента, обнаружили 1,75×10² клеток/мл микроорганизма Salmonella typhimurium (штамм SL 7207).

Пример 5

Вытяжку пробы инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe⁰ при T=37°C. Несвязавшиеся наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают платиновый электрод (фиг.1), модифицированный антителами против E.coli (штамм O-12), и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в электрохимическую ячейку. В качестве фонового электролита используют раствор LiClO₄ в диметилформамиде (ДМФА). В качестве аналитического сигнала, используют электрохимический отклик окисления наночастиц, локализованных в иммунокомплексе на поверхности рабочего электрода. Для проведения холостого опыта используют раствор, не содержащий микроорганизмы E.coli (штамм O-12) (фиг.6). В пробе, взятой у пациента, обнаружено 3,75×10 клеток/мл микроорганизма E.coli (штамм O-12).

Пример 6

Пробу воды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при Т=37°C. Несвязавшиеся наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают платиновый электрод (фиг.1), модифицированный антителами против E.coli (штамм O-12), и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в электрохимическую ячейку. В качестве фонового электролита используют раствор LiClO₄ в ацетонитриле. В качестве аналитического сигнала используют электрохимический отклик окисления предварительно восстановленных наночастиц, локализованных в иммунокомплексе на поверхности рабочего электрода. Для проведения холостого опыта используют раствор, не содержащий микроорганизмы E.coli (штамм O-12) (фиг.7). В пробе, взятой у пациента, обнаружено 3,75×10⁷ клеток/мл микроорганизма E.coli (штамм O-12).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к определению содержания микроорганизмов в различных объектах и средах. Способ предусматривает конъюгацию бактерий с электрохимической меткой, в качестве которой используют Fe⁰, MgFe₂O₄ или Fe₃O₄, осуществляемую в водной среде при заданных параметрах. Осуществляют отделение несвязавшихся наночастиц с использованием магнитного поля и помещение рабочего электрода, изготовленного из золота, платины или графитсодержащих материалов, поверхность которого предварительно модифицирована антителами, специфичными к определяемому штамму бактерий, в исследуемый раствор. Электрод выдерживают при заданных параметрах с образованием иммунокомплекса на его поверхности и промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и Твин-20. Электрод извлекают из раствора и помещают в электрохимическую ячейку, содержащую LiClO₄, растворенный в ацетонитриле, диметилформамиде или диметилсульфоксиде, определяют содержание бактерий по величине аналитического окисления наночастиц, локализованных в иммунокомплексе на поверхности рабочего электрода. Изобретение позволяет увеличить чувствительность анализа, повысить производительность и упростить анализ. 7 ил., 6 пр.

Способ определения содержания грамотрицательных патогенных бактерий в анализируемой среде, характеризующийся конъюгированием бактерий с электрохимической меткой, в качестве которой используют магнитные наночастицы Fe⁰, MgFe₂O₄ или Fe₃O₄, осуществляемым в водной среде в течение 30 минут при температуре 37⁰С, отделением несвязавшихся наночастиц с использованием магнитного поля, помещением в среду рабочего электрода, изготовленного из золота, платины или графитсодержащих материалов, поверхность которого предварительно модифицируют антителами, специфичными к определяемому штамму бактерий, образованием иммунокомплекса на поверхности электрода в течение 20 мин при температуре 37^°С с использованием магнитного поля, промыванием электрода буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20, помещением извлеченного из анализируемой среды рабочего электрода в электрохимическую ячейку, содержащую фоновый электролит LiClO_4, растворенный в ацетонитриле, диметилформамиде или диметилсульфоксиде, и определением содержания бактерий по величине аналитического сигнала, в качестве которого используют электрохимический отклик окисления наночастиц, локализованных в иммунокомплексе на поверхности рабочего электрода.