СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/02 B82B1/00 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к определению патогенных микроорганизмов в различных средах.

Недостатками используемых в настоящее время методов являются: низкая надежность и специфичность (РНГА), низкая чувствительность и высокая стоимость используемых реагентов (ИФА), необходимость создания специальных условий и длительность проведения анализа (посев).

Известен способ определения патогенных микроорганизмов, при котором используют магнитные шарики, покрытые антителами к Salmonella Typhimurium (АСМШ) и антитела Salmonella Typhimurium, меченые щелочной фосфатазой (АСЩФ). В результате иммунореакции образуется конъюгат АСМШ-Salmonella-АСЩФ. Шарики с конъюгатом отделяют из раствора с помощью магнита, затем инкубируют на фенилфосфатном субстрате. В результате образуется фенол. Концентрацию Salmonella Typhimurium определяют, измеряя концентрацию фенола [1].

Недостатками известного способа являются низкая достоверность и точность определения вследствие применения в процессе анализа неустойчивого фермента - фосфатазы.

Известен способ определения патогенных микроорганизмов в мясных продуктах с использованием иммунокомплекса «Salmonella Typhimurium - специфические антитела с ковалентно связанными магнитными шариками» с последующей магнитной сепарацией. Детекцию на наличие адгезивного гена патогенности FimA проводят методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) [2].

Недостатками такого способа являются высокая трудоемкость и длительность анализа.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения патогенного микроорганизма E.coli, включающий использование наночастиц магнетика Fe₃O₄, модифицированных D-маннозой (галактозой) с последующим специфическим связыванием с белком конкавалин А. Бактерии E.coli связываются с углеводами и белком, которые расположены на поверхности наночастиц, после чего бактерии метят флуоресцентным красителем PicoGreen. Содержание бактерий E.coli в растворе определяют методом флуоресцентной микроскопии [3].

К недостаткам данного способа следует отнести: необходимость предварительных операций по покрытию поверхности наночастиц углеводами; использование специфических веществ, пригодных для определения только данного вида микроорганизмов; высокая трудоемкость и сложность анализа; низкая точность и достоверность определения.

Предлагаемое техническое решение направлено на упрощение метода анализа, повышение его чувствительности, достоверности, универсальности, расширение спектра определяемых объектов.

Указанный технический эффект достигается тем, что в качестве магнетика и одновременно диагностирующей метки используют наночастицы переходных металлов или их соединений, причем перед концентрированием меченых конъюгатов из анализируемой среды выводят не связанные с микроорганизмами наночастицы, а само концентрирование меченого конъюгата осуществляют путем формирования на твердом, химически инертном носителе иммунокомплекса: меченный магнитной меткой микроорганизм - антитело, с последующим изъятием иммунокомплекса из среды на носителе, при этом определение наличия и концентрации микроорганизмов осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, получаемыми путем химического разрушения иммунокомплексов, а также тем, что для вывода из среды не связанных с микроорганизмами наночастиц используют магнитную сепарацию, причем в качестве носителя иммунокомплекса используют графитовый электрод, на поверхности которого иммобилизованы антитела к определяемому микроорганизму, а химическое разрушение иммунокомплексов и образование ионов переходного металла осуществляют минеральными кислотами или их смесью и, кроме того, тем, что наличие и концентрацию микроорганизмов, содержащихся в исследуемой пробе, определяют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла путем оценки электрохимического отклика ионов переходного металла в растворе.

Указанные отличительные признаки существенны. Использование в качестве магнетика и одновременно диагностирующей метки наночастиц переходных металлов или их соединений обеспечивает за счет наноразмеров частиц и электромагнитных свойств переходных металлов их хорошую конъюгацию с патогенными микроорганизмами, а также высокую чувствительность при регистрации электрохимического отклика ионов в растворе. Достоверность, точность и универсальность определения достигается за счет диагностирования по наличию и концентрации ионов указанных металлов, выделенных из иммунокомплекса патогенный микроорганизм - антитело. При этом обеспечивается полное отделение конъюгатов от оставшихся свободными наночастиц за счет воздействия магнитного поля, что исключает влияние несвязанных наночастиц на точность и достоверность результатов анализа.

На фигуре 1 изображен общий вид разового толстопленочного графитового электрода, где 1 - подложка из стеклотекстолита, 2 - дорожка из графитовой пасты, 3 - слой изолятора или цементита, 4 - рабочая поверхность электрода.

На фигуре 2 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (а) и пробах, содержащих Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 3 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (а) и в пробах, содержащих Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 4 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток E-coli штамм O-12 (а) и в пробах, содержащих клетки E-coli штамм O-12 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 5 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток E-coli штамм O-12 (а) и в пробах, содержащих клетки Е-coli штамм O-12 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 -вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3- вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 6 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (а) и в пробах, содержащих Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 7 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (а) и в пробах, содержащих Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 8 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток E-coli штамм O-12 (а) и в пробах, содержащих клетки E-coli штамм O-12 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3- вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

На фигуре 9 изображены катодные вольтамперограммы комплекса пирокатехина с Fe³⁺, адсорбированного на поверхности электрода, в контрольных пробах - без клеток E-coli штамм O-12 (а) и в пробах, содержащих клетки E-coli штамм O-12 (б):

1 - вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Вытяжку анализируемой среды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°С. После инкубации свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают толстопленочный графитовый электрод (фиг.1), на поверхности которого иммобилизованы антитела против Salmonella typhimurium штамм SL 7207, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности сенсора используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизмы Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (фиг.2). В пробе, взятой у пациента, обнаружено 103 клеток/мл микроорганизма Salmonella typhimurium штамм SL 7207.

Пример 2

Вытяжку из пробы анализируемого объекта инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают толстопленочный графитовый электрод (фиг.1), содержащий антитела против Salmonella typhimurium штамм SL 7207, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,3 6М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизма Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (фиг.3). В пробе, взятой у пациента, обнаружено 107 клеток/мл микроорганизма Salmonella typhimurium штамм SL 7207.

Пример 3

Вытяжку пробы инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами MgFe₂O₄ при температуре 37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают графитовый электрод (фиг.1), содержащий антитела против E-coli штамм O-12, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности сенсора используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизма E-coli штамм O-12 (фиг.4). В пробе, взятой у пациента, обнаружено 1,75×103 клеток/мл микроорганизма E-coli штамм O-12.

Пример 4

Вытяжку пробы инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами MgFe₂O₄ при Т=37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом вытяжку помещают носитель в виде графитового электрода (фиг.1), содержащий антитела против E-coli штамм O-12, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизма Е-coli штамм O-12. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизма Е-coli штамм O-12 (фиг.5). В пробе, взятой у пациента, обнаружено 3,75×10⁶ клеток/мл микроорганизма Е-coli штамм O-12.

Пример 5

Пробу воды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом пробу помещают графитовый электрод (фиг.1), содержащий антитела против Е-coli штамм O-12, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизма E-coli штамм O-12. Для холостого опыта используют воду, не содержащую микроорганизм E-coli штамм O-12 (фиг.6). В пробе обнаружено 1,5×10³ клеток/мл микроорганизма E-coli штамм O-12.

Пример 6

Пробу воды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом пробу помещают графитовый электрод (фиг.1), содержащий антитела против E-coli штамм O-12, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий микроорганизма E-coli штамм O-12. Для холостого опыта используют воду, не содержащую микроорганизм E-coli штамм O-12 (фиг.7). В пробе обнаружено 4×10⁶ клеток/мл микроорганизма E-coli штамм 0-12.

Пример 7

Пробу воды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами MgFe₂O₄ при температуре 37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом пробу помещают графитовый электрод (фиг.1), содержащий антитела против Salmonella typhimurium штамм SL 7207, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют воду, не содержащую Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (фиг.8). В пробе обнаружено 10³ клеток/мл микроорганизма Salmonella typhimurium штамм SL 7207.

Пример 8

Пробу воды инкубируют в течение 30 минут с магнитными наночастицами Fe₃O₄ при температуре 37°С. Свободные наночастицы отделяют с использованием магнитного поля. В подготовленную таким образом пробу помещают графитовый электрод (фиг.1), содержащий антитела против Salmonella typhimurium штамм SL 7207, выдерживают там в течение 20 минут при температуре 37°С. Для ускорения доставки меченых микроорганизмов к поверхности электрода используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М H₂SO₄ и 0,28М HNO₃) для разрушения иммунокомплексов и растворения наночастиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание искомых микроорганизмов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении иммунокомплекса. Для холостого опыта используют воду, не содержащую Salmonella typhimurium штамм SL 7207 (фиг.9). В пробе обнаружено 10⁷ клеток/мл микроорганизма Salmonella typhimurium штамм SL 7207.

Источники информации

1. Y.H.Che et al., Rapid detection of Salmonella typhimurium in chicken carcass wash water using an immunoelectrochemical method. Journal of Food Protection; August, 2000; v.63, no.8, p.1043-1048.

2. Angela N. Moreira et al. Detection of Salmonella Typhimurium in Raw Meats using In-House Prepared Monoclonal Antibody Coated Magnetic Beads and PCR Assay of the fimA Gene, 29: 58-69, 2008.

3. Kheireddine El-Boubbou, Cyndee Gruden, and Xuefei Huang, Magnetic Glyco-nanoparticles: A Unique Tool for Rapid Pathogen Detection,

Decontamination, and Strain Differentiation. J. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 13392-13393.

Изобретение относится к биотехнологии. Конъюгируют микроорганизм с наночастицами магнетика в анализируемой среде с последующим концентрированием конъюгатов и определением наличия и концентрации микроорганизмов с помощью диагностирующей метки. При этом в качестве магнетика и одновременно диагностирующей метки используют наночастицы переходных металлов или их соединений. Перед концентрированием меченых конъюгатов из анализируемой среды выводят не связанные с микроорганизмами наночастицы. Концентрирование меченого конъюгата осуществляют путем формирования на твердом, химически инертном носителе иммунокомплекса: меченный магнитной меткой микроорганизм - антитело с последующим изъятием иммунокомплекса из среды на носителе. Определение наличия и концентрации микроорганизмов осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, получаемыми путем химического разрушения иммунокомплексов. Способ направлен на повышение чувствительности и достоверности анализа, расширение спектра определяемых объектов. 5 з.п. ф-лы, 9 ил.

1. Способ определения патогенных микроорганизмов, включающий конъюгацию микроорганизма с наночастицами магнетика в анализируемой среде с последующим концентрированием конъюгатов и определением наличия и концентрации микроорганизмов с помощью диагностирующей метки, отличающийся тем, что в качестве магнетика и одновременно диагностирующей метки используют наночастицы переходных металлов или их соединений, причем перед концентрированием меченых конъюгатов из анализируемой среды выводят не связанные с микроорганизмами наночастицы, а само концентрирование меченого конъюгата осуществляют путем формирования на твердом, химически инертном носителе иммунокомлекса: меченный магнитной меткой микроорганизм - антитело, с последующим изъятием иммунокомплекса из среды на носителе, при этом определение наличия и концентрации микроорганизмов осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, получаемых путем химического разрушения иммунокомплексов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для вывода из среды не связанных с микроорганизмами наночастиц используют магнитную сепарацию.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве носителя иммунокомплекса используют графитовый электрод, на поверхности которого иммобилизованы антитела к определяемому микроорганизму.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что химическое разрушение иммунокомплексов и образование ионов переходного металла осуществляют минеральными кислотами или их смесью.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что наличие и концентрацию микроорганизмов, содержащихся в исследуемой пробе, определяют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что наличие и концентрацию микроорганизмов определяют путем оценки электрохимического отклика ионов переходного металла в растворе.