СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к методам анализа различных объектов на содержание в них белков и может быть использовано в ряде отраслей пищевой промышленности, в частности молочной, а также при анализе других биологических систем.

Известны различные способы определения содержания белков, например ультразвуковой, спектральный, рефрактометрический и др. [Бруславский Л.П., Фетисов Е.А., Шидловская В.П. Приборы контроля состава и качества молока. Молочная промышленность, №1, 1998, с.22-23].

Известен также потенциометрический способ определения белков с использованием ферментных электродов, основанном на том, что в результате реакции того или иного вещества с ферментом образуются продукты (ионы водорода, аммония, пероксид водорода и т.п.), к которым чувствителен тот или иной индикаторный электрод [Никольский Б.П, Матерова Е.А. Ионоселективньв электроды. - Л.: Химия, 1980. - 240 с., ил. (с.126-140). Морф В. Принципы работы ионоселективных электродов и мембранный транспорт: Пер. с англ. - М: Мир, 1985. - 280 с., ил (с.265-269)]. Измерив потенциал такого электрода в растворе с неизвестным содержанием белка, по предварительно построенному калибровочному графику находят содержание белка.

Общим недостатком потенциометрии с использованием ферментных электродов является сложность их изготовления, связанная, в частности, с необходимостью фиксирования фермента на поверхности ионоселективного электрода (иммобилизации), сложностью выделения и очистки фермента, большая нестабильность показаний во времени.

Цель изобретения - упрощение методики определений и повышение надежности измерений.

Реализация предложенного способа осуществляется следующим образом.

Создают аналитическую среду с электрохимически активными компонентами, вводят в нее анализируемый на белки образец, измеряют потенциал инцикаторного электрода относительно электрода сравнения и определяют по величине потенциала количество белков посредством калибровочного графика.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что в качестве аналитической среды используют щелочной раствор, содержащий ионы гидроксила и ионы меди(II) с массовым отношением 76-119, а измерение потенциала производят на медном индикаторном электроде при массовом отношении ионов меди(II) к белкам 0,156 - 6,97.

Предложенный способ выгодно отличается от прототипа простотой, поскольку не требуется специально готовить фермент, производить его очистку, фиксировать на поверхности ионоселеактивного электрода, периодически производить повторную калибровку электрода из-за естественного старения фермента. Последний факт особенно неприятен, поскольку существенно влияет на надежность измерений.

Результаты произведенных измерений демонстрируются следующими примерами на серии стандартных образцов молока, содержание белков в которых определялось формольным методом и составляло 2,50% при плотности молока 1,028 г/мл.

Пример 1. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 2,00 М водного раствора гидроксида натрия, 0,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. При этом отношение массы гидроксильных ионов к массе ионов Cu²⁺ составляет 119. В раствор погружают на глубину 30 мм медный электрод, выполненный в виде стержня диаметром 1,8 мм и длиной около 100 мм, рабочую часть которого предварительно кратковременно протравливают в 3 М растворе соляной кислоты, тщательно промывают водопроводной и дистиллированной водой, остатки которой удаляют фильтровальной бумагой. Закрепляют медный электрод в штативе и подключают его проводником к клемме измерительного электрода датчика ДЛ-01. В стакан с анализируемым раствором помещают электролитический ключ, который через промежуточный сосуд с насыщенным раствором хлорида калия соединяют электролитически с насыщенным хлорсеребряным электродом сравнения, вмонтированным в датчик. Кабель датчика подключают к потенциометру, в качестве которого выступает рН-метр рН-340. Производят измерение потенциала медного электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -295 мВ.

Затем электрод извлекают из раствора, промывают, протравливают в кислоте, снова промывают в водопроводной и дистиллированной воде и удаляют остатки ее фильтровальной бумагой. В стакан с раствором вносят пипеткой 0,50 мл молока, что соответствует 0,0128 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -337 мВ.

Пример 2. В другой стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 2,00 М водного раствора гидроксида натрия, 0,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 1,00 мл молока, что соответствует 0,0257 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примере 1, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -364 мВ.

Пример 3. В третий стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 2,00 М водного раствора гидроксида натрия, 0,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 1,50 мл молока, что соответствует 0,0385 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примере 1, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -395 мВ.

Пример 4. В четвертый стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 2,00 М водного раствора гидроксида натрия, 0,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 2,00 мл молока, что соответствует 0,0514 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примере 1, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -405 мВ.

По экспериментальным данным примеров 1-3 строят калибровочный график в координатах: масса белков - потенциал электрода, которые укладываются на прямую (экспериментальные значения примера 4 не укладываются на этой прямой). Затем в условиях опытов, описанных в примере 1, в медно-щелочной раствор вносят:

- 0,25 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -313 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0064 г, что в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце составляет 2,5% при отношение массы Cu²⁺ к массе белков в образце 0,87;

- 1,40 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -392 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0360 г, что в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце составляет 2,5% при отношение в образце 0,156.

Пример 5. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 4,00 М водного раствора гидроксида натрия, 1,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. При этом отношение массы гидроксильных ионов к массе ионов Cu²⁺ составляет 81. В раствор погружают на глубину 30 мм медный электрод, выполненный в виде стержня диаметром 1,8 мм и длиной около 100 мм, рабочую часть которого предварительно кратковременно протравливают в 3 М растворе соляной кислоты, тщательно промывают водопроводной и дистиллированной водой, остатки которой удаляют фильтровальной бумагой. Закрепляют медный электрод в штативе и подключают его проводником к клемме измерительного электрода датчика ДЛ-01. В стакан с анализируемым раствором помещают электролитический ключ, который через промежуточный сосуд с насыщенным раствором хлорида калия соединяют электролитически с насыщенным хлорсеребряным электродом сравнения, вмонтированным в датчик. Кабель датчика подключают к потенциометру, в качестве которого выступает рН-метр рН-340. Производят измерение потенциала медного электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -305 мВ.

Затем электрод извлекают из раствора, промывают, протравливают в кислоте, снова промывают в водопроводной и дистиллированной воде и удаляют остатки ее фильтровальной бумагой. В стакан с раствором вносят пипеткой 0,50 мл молока, что соответствует 0,0128 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -315 мВ.

Пример 6. В другой стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 4,00 М водного раствора гидроксида натрия, 1,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 1,00 мл молока, что соответствует 0,0257 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -347 мВ.

Пример 7. В третий стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 4,00 М водного раствора гидроксида натрия, 1,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 1,50 мл молока, что соответствует 0,0385 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -365 мВ.

Пример 8. В четвертый стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 4,00 М водного раствора гидроксида натрия, 1,50 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 2,00 мл молока, что соответствует 0,0514 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помешают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -393 мВ.

По экспериментальным данным примеров 5-8 строят калибровочный график в координатах: масса белков - потенциал электрода, которые укладываются на прямую. Затем в условиях опытов, описанных в примере 5, в медно-щелочной раствор вносят:

- 0,25 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -315 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0064 г, что в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце составляет 2,5% при отношение массы Cu²⁺ к массе белков в образце 2,62;

- 1,80 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -380 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0463 г, что в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце составляет 2,5% при отношении в образце 0,363.

Пример 9. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 22,5 мл 6,00 М водного раствора гидроксида калия, 2,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. При этом отношение массы гидроксильных ионов к массе ионов Cu²⁺ составляет 102. В раствор погружают на глубину 30 мм медный электрод, действуя далее согласно примерам 1, 5. Производят измерение потенциала медного электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -345 мВ.

Затем электрод извлекают из раствора, промывают, протравливают в кислоте, снова промывают в водопроводной и дистиллированной воде и удаляют остатки ее фильтровальной бумагой. В стакан с раствором вносят пипеткой 0,50 мл молока, что соответствует 0,0128 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помешают в раствор электролитический ключ, затем медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -362 мВ.

Пример 10. В другой стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 22,5 мл 6,00 М водного раствора гидроксида калия, 2,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 1,00 мл молока, что соответствует 0,0257 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -375 мВ.

Пример 11. В третий стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 22,5 мл 6,00 М водного раствора гидроксида калия, 2,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 1,50 мл молока, что соответствует 0,0385 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -395 мВ.

Пример 12. В четвертый стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 22,5 мл 6,00 М водного раствора гидроксида калия, 2,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 2,00 мл молока, что соответствует 0,0514 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -422 мВ.

По экспериментальным данным примеров 9-12 строят калибровочный график в координатах: масса белков - потенциал электрода, которые укладываются на прямую. Затем в условиях опытов, описанных в примере 9, в медно-щелочной раствор вносят:

- 0,25 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -352 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0064 г, что в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце составляет 2,5% при отношении массы Cu²⁺ к массе белков в образце 3,48;

- 1,80 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -380 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0463 г, что в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце составляет 2,5% при отношение в образце 0,482.

Пример 13. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 10,00 М водного раствора гидроксида натрия, 4,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. При этом отношение массы гидроксильных ионов к массе ионов Cu²⁺ составляет 76. В раствор погружают на глубину 30 мм медный электрод, действуя далее согласно примерам 1, 5. Производят измерение потенциала медного электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -365 мВ.

Затем электрод извлекают из раствора, промывают, протравливают в кислоте, снова промывают в водопроводной и дистиллированной воде и удаляют остатки ее фильтровальной бумагой. В стакан с раствором вносят пипеткой 1,00 мл молока, что соответствует 0,0257 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем медный электрод (как в примерах 1, 5) и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -383 мВ.

Пример 14. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 10,00 М водного раствора гидроксида натрия, 4,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 2,00 мл молока, что соответствует 0,0514 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -403 мВ.

Пример 15. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 10,00 М водного раствора гидроксида натрия, 4,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 3,00 мл молока, что соответствует 0,0771 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -421 мВ.

По экспериментальным данным примеров 13-15 строят калибровочный график в координатах масса белков - потенциал электрода, которые укладываются на прямую. Затем в условиях опытов, описанных в примере 13, в медно-щелочной раствор вносят:

- 0,25 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -372 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0068 г, что превышает действительную массу белков ва 6,2%, а в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце оно составляет 2,65% при отношении массы Cu²⁺ к массе белков в образце 6,97;

- 2,50 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -380 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,069 г, что превышает действительную массу белков на 7,8%, а в пересчете па процентное содержание белков в анализируемом образце оно составляет 2,68% при отношении в образце 0,697.

Пример 16. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 10,00 м водного раствора гидроксида натрия, 7,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. При этом отношение массы гидроксильных ионов к массе ионов Cu²⁺ составляет 43. В раствор погружают на глубину 30 мм медный электрод, действуя далее согласно примерам 1,5. Производят измерение потенциала медного электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -342 мВ.

Затем электрод извлекают из раствора, промывают, протравливают в кислоте, снова промывают в водопроводной и дистиллированной воде и удаляют остатки ее фильтровальной бумагой. В стакан с раствором вносят пипеткой 1,00 мл молока, что соответствует 0,0257 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем медный электрод (как в примерах 1, 5) и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -356 мВ.

Пример 17. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 10,00 М водного раствора гидроксида натрия, 7,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 2,00 мл молока, что соответствует 0,0514 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -365 мВ.

Пример 18. В стеклянный стакан на 50 мл вносят мерной пипеткой 20,0 мл 10,00 М водного раствора гидроксида натрия, 7,00 мл водного раствора медного купороса с концентрацией Cu²⁺ 0,176 моль/л, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния. Затем в указанный раствор вносят 3,00 мл молока, что соответствует 0,0771 г белков, смесь тщательно перемешивают до однородного состояния, помещают в раствор электролитический ключ, затем предварительно подготовленный, как в примерах 1, 5, медный электрод и производят измерение потенциала электрода после его стабилизации по истечении 3-5 минут при температуре раствора 25°С, который составляет -371 мВ.

По экспериментальным данным примеров 16-18 строят калибровочный график в координатах: масса белков - потенциал электрода, которые укладываются на прямую. Затем в условиях опытов, описанных в примере 16, в медно-щелочной раствор вносят:

- 0,25 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -338 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,0077 г, что превышает действительную массу белков на 20,3%, а в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце оно составляет 3,0% при отношение массы Cu²⁺ к массе белков в образце 12,2;

- 2,50 мл молока, смесь тщательно перемешивают, измеряют потенциал электрода при прочих равных условиях, который составляет -370 мВ, и по калибровочному графику определяют массу белков, которая составляет 0,077 г, что превышает действительную массу белков на 20,3%, а в пересчете на процентное содержание белков в анализируемом образце оно составляет 3,0% при отношении в образце 1,22.

Как следует из приведенных примеров, предложенный способ позволяет производить определение количественного содержания белков в анализируемых образцах потенциометрически в условиях, указанных в отличительной части описания. При этом он значительно проще прототипа, поскольку не требует дополнительных процедур по получению фермента, его закреплению на ионоселективном электроде, периодической калибровке электрода из-за старения фермента, что также повышает надежность результатов определений предлагаемым способом.

Изобретение относится к методам анализа различных объектов на содержание в них белков и может быть использовано в ряде отраслей пищевой промышленности, в частности молочной. Способ предусматривает создание аналитической среды с электрохимически активными компонентами, в которую вводят анализируемый на белки образец, измеряют потенциал индикаторного электрода и по калибровочному графику определяют содержание в нем белков. При этом в качестве аналитической среды используют щелочной раствор, содержащий ионы гидроксила и ионы меди(II) с массовым отношением 76-119, а измерение потенциала производят на медном индикаторном электроде при массовом отношении ионов меди(II) к белкам 0,156-6,97. Обеспечивается упрощение методики определения белков и повышение надежности измерений.

Способ определения содержания белков, включающий создание аналитической среды с электрохимически активными компонентами, введение в нее анализируемого на содержание белков образца, измерение потенциала индикаторного электрода относительно электрода сравнения и определение по величине потенциала количества белков посредством калибровочного графика, отличающийся тем, что в качестве аналитической среды используют щелочной раствор, содержащий ионы гидроксила и ионы меди (II) с массовым отношением 76÷119, а измерение потенциала производят на медном индикаторном электроде при массовом отношении ионов меди (II) к белкам 0,156÷6,97.