СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 G01N33/86 

Изобретение относится к биологии и медицине в области гематологии и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью выявления активации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом.

Наиболее близким к предложенному является способ определения агрегации тромбоцитов на предметном стекле с использованием одного индуктора (Шитикова А.С. Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян, СПб.: 1999. - С.49-52. Описанный метод не позволяет моделировать реальные условия агрегации тромбоцитов в организме человека и при его проведении не предусмотрено использование минимальной взаимопотенциирующей концентрации индукторов агрегации.

Известен способ исследования агрегации тромбоцитов на агрегометре "Пайтон" (США) с комбинацией индукторов (Акопов С.Э., Мартиросян Г.Р. Об использовании комбинаций индукторов агрегации в оценке изменений тромбоцитарных функций у больных с нарушениями мозгового кровообращения. // Кровообращение. 1988. - Т.21, № 4. - С.47-49). Метод позволяет оценивать агрегацию тромбоцитов с комбинацией индукторов на агрегометре. Вместе с тем, он может применяться далеко не в каждой лаборатории по причине дороговизны агрегометров, а также проведение исследования требует затрат плазмы, значительно превышающих расход ее при оценке агрегации на стекле. Кроме того, авторами метода не предусматривалось использование минимальных взаимопотенциирующих доз индукторов агрегации.

Цель изобретения: с помощью технически простых, экономически доступных и быстро выполнимых приемов оценивать изменения функционального состояния тромбоцитов в малом объеме плазмы с комбинацией индукторов, наиболее вероятно присутствующей в зоне повреждения сосуда.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что после взятия крови, ее стабилизации цитратом натрия 3,8%, разделения крови на плазму и эритроциты путем центрифугирования с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП) и проводится на предметном стекле тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов (общий объем 0,02 мл) моделировать реальные условия кровотока у людей и оценить изменения функционального состояния тромбоцитов на минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. После взятия крови в цитрат натрия 3,8% в соотношении 9:1, ее центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин, для получения БТП. Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л).

Из получившегося объема стандартизированной плазмы отбирают из расчета по 0,02 мл плазмы на каждую исследуемую комбинацию индукторов. Оставшийся объем плазмы можно использовать для других гематологических и биохимических исследований.

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками растворы нескольких индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях (фиг.1 и 2) общим объемом, равным объему плазмы. Объемы агонистов определяются по формуле:

где n - число используемых одновременно индукторов агрегации (фиг.1 и 2).

В качестве агонистов возможно использование аденозин дифосфата (АДФ), коллагена, тромбина, адреналина и других индукторов. Минимальные взаимопотенциирующие дозы индукторов всегда ниже стандартных (табл.1 и 2). Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см (фиг.3). Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов фиксируют агрегацию тромбоцитов.

Необходимо отметить, что исследование агрегационной способности кровяных пластинок с несколькими индукторами моделирует события, происходящие в кровотоке в области повреждения сосуда и инициации процесса гемостаза, т.к. реально в этих условиях тромбоциты активируются несколькими агонистами. Например, у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом часто найденные закономерности выражены еще больше, чем у здоровых людей из-за активации тромбоцитарных функций.

Таблица 1
Стандартные дозы индукторов, вызывающие агрегацию тромбоцитов при их изолированном примененииИндукторыАДФ, МАдреналин, МКоллаген, разведение основной суспензииТромбин, ед/мл.Дозы0,5·10^-45·10^-61:20,125

Таблица 2
Минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации у здоровых лиц и больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом при двойном и тройном их сочетанииКатегория обследованныхСочетания индукторов агрегации тромбоцитовАДФ, МАдреналин, МКоллаген, разведение основной суспензииТромбин, ед/мл.с одним агонистомс двумя агонистамис одним агонистомс двумя агонистамис одним агонистомс двумя агонистамис одним агонистомс двумя агонистамиЗдоровые люди, n=2110^-65·10^-72,5·10⁷10^-71:41:50,1000,090Больные люди, n=1255,0·10^-810^-93,0·10^-910^-91:81:90,0750,060

Из таблиц 1 и 2 следует, что минимальные вызывающие агрегацию дозы индукторов при сочетаном их использовании значительно ниже, чем в стандартных условиях при использовании воздействия на тромбоциты одного агониста. При одновременном присутствии в БТП трех индукторов, дозы, требующиеся для агрегации, еще ниже, чем в случае двух индукторов. Причем, у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом эти значения еще ниже, что говорит о выраженной у них активации тромбоцитов. Одномоментное применение нескольких индукторов приближает наши представления о необходимой минимальной концентрации индукторов в реальных условиях при инициации гемостаза в сосудах человека.

Пример 1. Гражданка Н., 31 год, поступила для санаторно-курортного лечения в санаторий им. И.Д.Черняховского г. Курска. При осмотре и объективном обследовании патологических изменений не было выявлено. Утром натощак было произведено взятие крови для биохимического и гематологического исследования, не выявившего отклонений от общепринятой нормы. Агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном, тромбином, ристомицином, H₂O₂ и адреналином оказалась в пределах нормы. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазме (200·100⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин

+ коллаген, АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин зафиксировала ее развитие. Минимальные взаимопотенциирующие концентрации при использовании двух индукторов составили для АДФ - 10^-6 М., коллагена - 1:4 разведение основной суспензии, адреналина - 2,5·10^-7 М., для тромбина - 0,100 ед/мл. При одновременном применении трех индукторов минимальная взаимопотенциирующая концентрация составила для АДФ - 5,0·10^-7 М., коллагена 1:5 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-7 М., тромбина - 0,090 ед/мл. Более низкие концентрации индукторов не вызывали у обследованной агрегации тромбоцитов. Таким образом, развитие агрегации тромбоцитов в ответ только на взаимопотенциирующие дозы индукторов, характерные для здоровых людей, свидетельствуют о нормальной функции тромбоцитов у обследованной.

Пример 2. Больная Б., 53 года, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г. Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе выявлены жалобы на эпизодические головные боли в затылочной области, мелькание "мушек" перед глазами, связанные с подъемами артериального давления. Больная также предъявляла жалобы на избыточную массу тела с локализацией жира преимущественно на животе.

При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу II а ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,5 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагносцировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование выявило у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,8 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов инициировалась у больной с комбинацией индукторов: АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген, АДФ + коллаген + адреналин, АДФ + коллаген + тромбин. Минимальная взаимопотенциирующая агрегацию концентрация в случае двух индукторов составила для АДФ - 5·10^-8 М., коллагена – 1:8 разведения основной суспензии коллагена, адреналина - 3,0·10^-9 М., тромбина - 0,075 ед/мл. В случае одновременного использования трех индукторов их минимальная концентрация была ниже. Для АДФ - 10^-9 М., для коллагена - 1:9 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-9 М., тромбина - 0,060 ед/мл.

Развитие агрегации тромбоцитов с такими минимальными взаимопотенциирующими дозами индукторов указывает на нарушение (активацию) агрегационной функции тромбоцитов.

Больной была назначена адекватная гипотензивная терапия диротоном 10 мг 1 раз в сутки, индивидуально подобранная гипокалорийная диета и дозированные физические тренировки. Это позволило через 3 мес лечения привести минимальные взаимопотенциирующие дозы индукторов до уровня здоровых людей, нормализовав тем самым агрегацию тромбоцитов.

Пример 3. Больная С., 60 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике № 7 г. Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При осмотре выявлено, что больная регулярно принимает подобранную гипотензивную терапию (амлодипином 5 мг 1 раз в сутки и диротоном 10 мг 1 раз в сутки), что обеспечивает стабильность артериального давления в пределах нормальных цифр. На момент осмотра жалоб у больной выявлено не было.

При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,0 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагносцировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование выявило у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,6 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов у пациентки не имела отклонений от нормы. Сочетание индукторов: АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген, АДФ + коллаген + адреналин, АДФ + коллаген + тромбин вызывали агрегацию тромбоцитов при минимальных взаимопотенциирующих агрегацию концентрациях в случае двух индукторов АДФ - 10^-6 М., коллагена - 1:4 разведения основной суспензии коллагена, адреналина - 2,5·10^-7 М., тромбина - 0,100 ед/мл., в случае трех индукторов: АДФ - 5·10^-7 М., для коллагена - 1:5 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-7 М., тромбина - 0,090 ед/мл. Более низкие концентрации индукторов не вызывали у обследованной агрегации тромбоцитов. Таким образом, развитие агрегации тромбоцитов в ответ только на взаимопотенциирующие дозы индукторов, характерные для здоровых людей, свидетельствуют о нормальной функции тромбоцитов у обследованной.

Больной было рекомендовано продолжать строго контролировать артериальное давление и снизить массу тела за счет соблюдения гипокалорийной диеты и физических тренировок.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Сущность способа исследования агрегации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом заключается в следующем: исследование агрегации тромбоцитов проводят на стекле одновременно с несколькими индукторами, используя минимальные взаимопотенцирующие концентрации индукторов агрегации, которые составляют при двойном сочетании индукторов: АДФ – 5,0·10^-8 М, адреналин 3,0·10^-9, коллаген – разведение основной суспензии 1:8, тромбин 0,075 ед/мл; при тройном сочетании индукторов: АДФ – 10^-9 М, адреналин 10^-9, коллаген – разведение основной суспензии 1:9, тромбин 0,060 ед/мл. Развитие агрегации говорит об активации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом. Способ позволяет оценивать изменения функционального состояния тромбоцитов с комбинацией индукторов, наиболее вероятно присутствующей в зоне повреждения сосуда, используя минимальные необходимые концентрации, что моделирует реальные условия при инициации гемостаза в сосудах человека. 2 табл., 3 ил.

Способ исследования агрегации тромбоцитов на стекле, включающий взятие крови, ее стабилизацию, выделение богатой тромбоцитами плазмы и нанесение ее на предметное стекло, добавление индуктора агрегации, отличающийся тем, что у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом исследуют агрегацию тромбоцитов одновременно с несколькими индукторами, используя минимальные взаимопотенцирующие концентрации индукторов агрегации, которые составляют при двойном сочетании индукторов АДФ – 5,0·10^-8 М, адреналин 3,0·10^-9, коллаген – разведение основной суспензии 1:8, тромбин 0,075 ед/мл; при тройном сочетании индукторов АДФ – 10^-9 М, адреналин 10^-9, коллаген – разведение основной суспензии 1:9, тромбин 0,060 ед/мл, развитие агрегации говорит об активации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом.