СПОСОБ ОЦЕНКИ АГРЕГАЦИОННОГО СТАТУСА ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине в области гематологии и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях у людей.

Наиболее близким к заявленному является способ оценки агрегации тромбоцитов с сочетаниями индукторов (Медведев И.Н. и соавт. Способ агрегации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом. Патент №2250461). Описанный метод не позволяет моделировать в такой степени реальные условия агрегации тромбоцитов в организме, т.к. при его проведении необязательно включение в комбинации используемых индукторов первично действующего на тромбоциты при любом повреждении индуктора коллагена. Данное обстоятельство позволяет изучать агрегацию тромбоцитов в заявленном способе в условиях максимально приближенных к реальным. Кроме того, в нем используется четверное сочетание индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях. При этом ранее полученные значения агрегации тромбоцитов не подвергались ранее данного вида математической обработке с вычислением среднего значения агрегации в зоне повреждения (СЗАЗП).

Цель изобретения: с помощью технически простых, экономически доступных и быстро выполнимых приемов диагностировать гипо- и гиперагрегацию тромбоцитов в малом объеме плазмы с комбинацией индукторов, включающей обязательно присутствующий в зоне повреждения сосуда коллаген, взятых в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях при различных состояниях у человека.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что после взятия крови, ее стабилизации цитратом натрия 3,8%, разделения крови на плазму и эритроциты путем центрифугирования с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП) на предметном стекле проводится тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов моделировать реальные условия кровотока при использовании комбинаций индукторов, обязательно включающих коллаген, в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях с расчетом СЗАЗП, по величине которого судят о тонких нарушениях агрегационного статуса тромбоцитов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. После взятия крови в цитрат натрия 3,8% в соотношении 9:1 ее центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об./мин, для получения БТП. Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об./мин, в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л).

Из получившегося объема стандартизированной плазмы отбирают из расчета по 0,02 мл плазмы на каждую исследуемую комбинацию индукторов. Оставшийся объем плазмы можно использовать для других гематологических и биохимических исследований.

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками растворы нескольких индукторов (фиг.1-2) общим объемом, равным объему плазмы. Объемы агонистов определяются по формуле:

где n - число используемых одновременно индукторов агрегации (фиг.1-2).

В качестве агонистов возможно использование сочетаний аденозиндифосфата (АДФ), коллагена, тромбина, адреналина, обязательно присутствующих в зоне повреждения (табл.1). Минимальные взаимопотенциирующие дозы индукторов ниже стандартных (табл.2 и 3) и способны вызывать агрегацию тромбоцитов только при сочетанном применении индукторов. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см (фиг.3). Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Исследование повторяют 2-3 раза с каждой комбинацией индукторов, находя среднее значение из полученных результатов. Например, при троекратной регистрации времени развития агрегации тромбоцитов с коллагеном, АДФ и адреналином у одного пациента получено три значения - 21 с, 23 с и 22 с, тогда принимаемая во внимание цифра составит среднее арифметическое из них - 22 с.

В табл.1 приводится время развития агрегации тромбоцитов в случае сочетанного воздействия индуктора в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях. Из представленного материала следует, что по сравнению со стимуляцией одним индуктором при применении одновременно двух и трех индукторов средняя скорость агрегации возрастает, а временной разброс ее наступления сокращается, что, вероятно, связано с задействованием нескольких механизмов активации. В случае одномоментного использования четырех индукторов эта закономерность выражена еще в большей степени. Необходимо отметить, что исследование агрегационной способности кровяных пластинок с несколькими индукторами в значительной мере моделирует события, происходящие в кровотоке в области повреждения сосуда и инициации процесса гемостаза, т.к. реально в этих условиях тромбоциты активируются несколькими агонистами.

Таблица 2 Стандартные дозы индукторов, вызывающие агрегацию тромбоцитов при их изолированном применении Индукторы АДФ, М Адреналин, М Коллаген, разведение основной суспензии Тромбин, ед./мл Дозы 0,5·10^-4 5·10^-6 1:2 0,125

Из табл.2 и 3 следует, что минимальные вызывающие агрегацию дозы индукторов при сочетанном их использовании значительно ниже, чем в стандартных условиях при использовании воздействия на тромбоциты одного агониста. При одновременном присутствии в БТП четырех индукторов, минимальная взаимопотенциирующая концентрация индукторов еще ниже, чем в случае двух или трех индукторов. Одномоментное применение нескольких индукторов приближает наши представления о реальных условиях при инициации гемостаза в сосудах и позволяет рассчитать СЗАЗП и провести тонкую и раннюю диагностику у обследуемых наличия гипо- и гиперагрегации тромбоцитов.

Суть диагностики заключается в выявлении отклонений величины СЗАЗП от нормативных значений при исследовании агрегации с обязательно присутствующих в зоне повреждения у людей индукторов, рассчитывающегося по следующей формуле:

При значении СЗАЗП в пределах 20,0-23,75 с агрегационный статус тромбоцитов может считаться нормальным, при его значениях в пределах 12,1-19,9 с имеет место риск развития гиперагрегации, при значении СЗАЗП 12,0 с отмечается возрастание агрегационного статуса тромбоцитов с возможностью в ближайшее время возникновения тромбозов. В случае нахождения СЗАЗП в пределах 23,76-29,9 с существует риск гипоагрегации, а при его повышении до 30,0 с и выше отмечается гипоагрегация с развитием кровоточивости в ближайшее время.

Пример 1. Гражданка В. 29 лет поступила на санаторно-курортное лечение. При осмотре и объективном обследовании патологических изменений не было выявлено. Утром натощак было произведено взятие крови для биохимического и гематологического исследования, не выявившего отклонений от общепринятой нормы. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с коллагеном (29 с) в стандартной дозе и комбинацией индукторов коллаген+АДФ+адреналин+тромбин, АДФ+коллаген+адреналин, АДФ+тромбин+адреналин, АДФ+коллаген+тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов зафиксировала ее развитие на 18 с, 25 с, 22 с, 23 с соответственно. При этом СЗАЗП составлял 22,0 с, что указывало на нормальную активность тромбоцитов у обследованной.

Обследованной было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Больная Т. 53 года, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г.Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе выявлены жалобы на эпизодические головные боли в затылочной области, мелькание „мушек" перед глазами, связанные с подъемами артериального давления. Больная также предъявляла жалобы на избыточную массу тела с локализацией жира преимущественно на животе.

При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,5 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагносцировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование выявило у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,8 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих дозах коллаген+АДФ+адреналин+тромбин 15 с, АДФ+коллаген+адреналин 16 с, АДФ+тромбин+адреналин 16 с, АДФ+коллаген+тромбин 17 с, с понижением СЗАЗП до 16,0 с, что указывало на риск развития гиперагрегации.

Больной было назначено сочетание индивидуально подобранной гипокалорийной диеты и физических тренировок. Через 1 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация СЗАЗП, составившего 20,9 с. Больной было рекомендовано соблюдать в дальнейшем данные рекомендации для профилактики возникновения гиперагрегации тромбоцитов.

Пример 3. Больная Я. 58 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г.Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе жалоб не выявлено. При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,0 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагносцировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование позволило найти у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,6 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинациями индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях характеризовалась ее ускорением под влиянием коллаген+АДФ+тромбин+адреналин 7 с, АДФ+коллаген+адреналин 9 с, АДФ+тромбин+адреналин 8 с, АДФ+коллаген+тромбин 10 с, с понижением СЗАЗП до 8,5, что указывало на риск наступления тромбоза.

С этой целью больной были назначены индивидуально подобранная гипокалорийная диета, дозированные физические нагрузки и амлодипин 10 мг 1 раз в сутки. Через 2 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация СЗАЗП (20,5 с).

Больной было рекомендовано в дальнейшем следить за артериальным давлением и массой тела, соблюдать данные ей рекомендации, что позволит избежать рецедива развития гиперагрегации.

Пример 4. Больной Ш. 52 года, проходивший лечение в одном из санаториев г.Курска, страдал хроническим тонзиллитом.

При опросе жалоб не выявлено. Объективный осмотр не обнаружил отклонений. Стандартные лабораторные и инструментальные обследования не выявили патологии. Осмотр ЛОР-врача позволило определить у пациента наличие хронического тонзиллита в стадии нестойкой ремиссии.

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях составляла: коллаген+АДФ+тромбин+адреналин 26 с, АДФ+коллаген+адреналин 25 с, АДФ+тромбин+адреналин 23 с, АДФ+коллаген+тромбин 24 с, СЗАЗП составил 24,50 с, что указывало на риск развития гипоагрегации. Больной не прислушался к данным ему рекомендациям: дицинон 0,25 мг 1 табл. 3 раза и рибоксин 0,2 мг 2 табл. 3 раза в день, что вызвало через 1 месяц дополнительный рост СЗАЗП (31,0 с) и развитие кровоточивости десен. После этого пациент стал соблюдать данные ему рекомендации (дицинон 0,25 мг 1 таб. 3 раза и рибоксин 0,2 мг 2 таб. 3 раза в день). Через 1 мес лечения была достигнута нормализация СЗАЗП (20,00 с) с исчезновением кровоточивости. Больному было рекомендовано регулярно наблюдаться у ЛОР-врача и решить вопрос о тонзилэктомии.

Изобретение относится к медицине в области гематологии и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях у людей. Сущность способа заключается в том, что после взятия крови, ее стабилизации цитратом натрия 3,8%, разделения крови на плазму и эритроциты путем центрифугирования, проводят тест на агрегацию тромбоцитов с добавлением одновременно, по меньшей мере, трех индукторов агрегации, выбранных из группы АДФ, адреналин, коллаген, тромбин. Регистрируют время возникновения агрегатов при добавлении индукторов агрегации и вычисляют среднее значение агрегации в зоне повреждения (СЗАЗП). При значении СЗАЗП 20,0-23,75 с агрегационный статус тромбоцитов считают нормальным; при 12,1-19,9 с отмечают риск развития гиперагрегации; при значения 12,0 с и менее отмечают нарастание агрегационного статуса тромбоцитов с возможностью в ближайшее время возникновения тромбозов; при 23,76-29,9 с существует риск гипоагрегации; при значениях 30,0 с и выше отмечается гипоагрегация с развитием кровоточивости в ближайшее время. Использование способа позволяет диагностировать гипо- и гиперагрегацию тромбоцитов в малом объеме плазмы. 3 табл., 3 ил.

Способ оценки агрегационного статуса тромбоцитов, включающий взятие крови, ее стабилизацию, выделение богатой тромбоцитами плазмы и нанесение ее на предметное стекло, добавление одновременно по меньшей мере трех индукторов агрегации, выбранных из группы АДФ, адреналин, коллаген, тромбин, отличающийся тем, что концентрации при добавлении трех индукторов составляют: АДФ-5,0·10^-7 М, адреналин - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:5, тромбин - 0,090 ед./мл; при добавлении четырех индукторов: АДФ-10^-7 М, адреналин - 5,0·10^-8 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:6, тромбин - 0,070 ед./мл, регистрируют время возникновения агрегатов при добавлении индукторов агрегации и вычисляют среднее значение агрегации в зоне повреждения (СЗАЗП) по формуле:
и при значении СЗАЗП 20,0-23,75 с агрегационный статус тромбоцитов считается нормальным; при 12,1-19,9 с отмечается риск развития гиперагрегации; при значениях 12,0 с и менее нарастает агрегационный статус тромбоцитов с возможностью в ближайшее время возникновения тромбозов; при 23,76-29,9 с существует риск гипоагрегации; при значениях 30,0 с и выше отмечается гипоагрегация с развитием кровоточивости в ближайшее время.