СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАЧИНАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ У ЛЮДЕЙ И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/86 G01N33/49 

Изобретение относится к биологии, медицине и ветеринарии в области гематологии, и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях у людей и животных.

Наиболее близким к предложенному является способ определения агрегации тромбоцитов на предметном стекле с использованием одного индуктора (Шитикова А.С. Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян, СПб., 1999. - С.49-52. Однако описанный метод не позволяет моделировать реальные условия агрегации тромбоцитов в организме человека и животного и при его проведении непредусмотрено применение индукторов агрегации в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях.

Известен способ исследования агрегации тромбоцитов на агрегометре "Пайтон" (США) с комбинацией индукторов (Акопов С.Э., Мартиросян Г.Р. Об использовании комбинаций индукторов агрегации в оценке изменений тромбоцитарных функций у больных с нарушениями мозгового кровообращения. // Кровообращение. 1988. - Т.21, №4. - С.47-49). Метод позволяет оценивать агрегацию тромбоцитов с комбинацией индукторов на агрегометре. Вместе с тем, он может применяться далеко не в каждой лаборатории по причине дороговизны агрегометров, а также проведение исследования требует затрат плазмы, значительно превышающих расход ее при оценке агрегации на стекле. Кроме того, авторами метода не предусматривалось применение индукторов агрегации в минимальных взаимопотенциирующих дозах.

Цель изобретения: с помощью технически простых, экономически доступных и быстро выполнимых приемов диагностировать гипо- и гиперагрегацию тромбоцитов в малом объеме плазмы с комбинацией индукторов, наиболее вероятно присутствующей в зоне повреждения сосуда, взятых в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях при различных состояниях у человека и животных.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что после взятия крови, ее стабилизации цитратом натрия 3,8%, разделения крови на плазму и эритроциты путем центрифугирования с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП) на предметном стекле проводится тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов моделировать реальные условия кровотока у людей или животных при использовании минимальных взаимопотенциирующих концентраций индукторов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. После взятия крови в цитрат натрия 3,8% в соотношении 9:1 ее центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин для получения БТП. Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л).

Из получившегося объема стандартизированной плазмы отбирают из расчета по 0,02 мл плазмы на каждую исследуемую комбинацию индукторов. Оставшийся объем плазмы можно использовать для других гематологических и биохимических исследований.

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками растворы нескольких индукторов (фиг.1 и 2) общим объемом, равным объему плазмы. Объемы агонистов определяются по формуле:

где n - число используемых одновременно индукторов агрегации (фиг.1 и 2).

В качестве агонистов возможно использование аденозиндифосфата (АДФ), коллагена, тромбина (производство НПО "РЕНАМ"), адреналина (производства Гедеон Рихтер) и других индукторов, агрегация с сочетаниями которых развивается раньше, чем при изолированном их использовании (табл.1 и 2). Минимальные взаимопотенциирующие дозы индукторов ниже стандартных (табл.3 и 4) и способны вызывать агрегацию тромбоцитов только при сочетанном применении индукторов. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см (фиг.3). Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Исследование повторяют 2-3 раза с каждой комбинацией индукторов, находя среднее значение из полученных результатов. Например, при троекратной регистрации времени развития агрегации тромбоцитов с АДФ и адреналином у одного пациента получено три значения - 30 с, 32 с и 34 с, тогда принимаемая во внимание цифра составит среднее арифметическое из них - 32 с.

В табл.1 приводится время развития агрегации тромбоцитов в случае изолированного воздействия индуктора в стандартных концентрациях, в табл.2 - их сочетанного влияния в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях. Из представленного материала следует, что по сравнению со стимуляцией одним индуктором при применении одновременно двух индукторов средняя скорость агрегации возрастает, а временной разброс ее наступления сокращается, что вероятно связано с задействованием нескольких механизмов активации. В случае одномоментного использования трех индукторов эта закономерность выражена еще в большей степени. Необходимо отметить, что исследование агрегационной способности кровяных пластинок с несколькими индукторами моделирует события, происходящие в кровотоке в области повреждения сосуда и инициации процесса гемостаза, т.к. реально в этих условиях тромбоциты активируются несколькими агонистами. Например, у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом найденные закономерности выражены еще больше, чем у здоровых людей из-за активации у них в большинстве случаев тромбоцитарных функций с ускорением развития агрегации кровяных пластинок.

Таблица 3Стандартные дозы индукторов, вызывающие агрегацию тромбоцитов при их изолированном применении.ИндукторыАДФ, МАдреналин, МКоллаген, разведение основной суспензииТромбин, ед/мл.Дозы0,5·10^-45·10^-61:20,125

Таблица 4Минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации у людей и новорожденных телят при двойном и тройном их сочетании. Сочетания индукторов агрегации тромбоцитовКатегория обследованныхАДФ, МАдреналин, МКоллаген, разведение основной суспензииТромбин, ед/мл.с одним агонистомс двумя агонистамис одним агонистомс двумя агонистамис одним агонистомс двумя агонистамис одним агонистомс двумя агонистамиЛюди, n=2110^-65·10^-72,5·10^-710^-71:41:50,1000,090Новорожденные телята, n=205,0·10^-67,5·10^-75,0·10^-72,0·10^-71:31:40,1100,100

Из таблиц 3 и 4 следует, что минимальные вызывающие агрегацию дозы индукторов при сочетанном их использовании значительно ниже, чем в стандартных условиях при использовании воздействия на тромбоциты одного агониста. При одновременном присутствии в БТП трех индукторов минимальная взаимопотенциирующая концентрация индукторов еще ниже, чем в случае двух индукторов. Одномоментное применение нескольких индукторов приближает наши представления о реальных условиях при инициации гемостаза в сосудах человека и животных и позволяет вести тонкую и раннюю диагностику у них гипо- и гиперагрегации тромбоцитов.

Суть диагностики заключается в выявлении отклонений времени агрегации тромбоцитов с сочетаниями индукторов во взаимопотенциирующих концентрациях (табл.4) в большую или меньшую сторону от найденных авторами границ нормы (табл.2) для людей и новорожденных телят. Более раннее или более позднее развитие агрегации тромбоцитов, чем обозначенные границы нормы у людей и животных, свидетельствуют о развитии гипер- или гипоагрегации тромбоцитов, позволяя в ранние сроки назначать соответствующее лечение.

Диагностировать гипоагрегацию у людей возможно при превышении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин длиннее 42 с, АДФ + коллаген длиннее 30 с, адреналин + коллаген длиннее 35 с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 26 с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 24 с при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 10^-6 М, двумя - 5·10^-7 М, адреналин - с одним агонистом - 2,5·10^-7 М, с двумя - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии с одним индуктором - 1:4, с двумя индукторами - разведение 1:5, тромбин - с одним агонистом 0,100 ед/мл, с двумя 0,090 ед/мл.

Диагностировать гиперагрегацию у людей возможно при сокращении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин короче 30 с, АДФ + коллаген короче 22 с, адреналин + коллаген короче 24 с, АДФ + коллаген + адреналин короче 21 с, АДФ + коллаген + тромбин короче 21 с, при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 10^-6 М, двумя - 5·10^-7 М, адреналин - с одним агонистом - 2,5·10^-7 М, с двумя - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии с одним - 1:4, с двумя индукторами - разведение 1:5, тромбин - с одним агонистом 0,100 ед/мл, с двумя - 0,090 ед/мл.

Диагностировать гипоагрегацию у новорожденных телят возможно при сокращении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин длиннее 47 с, АДФ + коллаген длиннее 32 с, адреналин + коллаген длиннее 39 с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 33 с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 27 с при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 5,0·10^-6 М, двумя - 7,5·10^-7 М, адреналин - с одним агонистом - 5,0·10^-7 М, с двумя - 2,0·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии с одним индуктором - 1:3, с двумя индукторами - разведение 1:4, тромбин - с одним агонистом - 0,110 ед/мл, с двумя - 0,100 ед/мл.

Диагностировать гиперагрегацию у новорожденных телят возможно при превышении времени агрегации для сочетания АДФ + адреналин короче 33 с, АДФ + коллаген короче 25 с, адреналин + коллаген короче 27 с, АДФ + коллаген + адреналин короче 25 с, АДФ + коллаген + тромбин короче 23 с при применении индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях: АДФ - с одним агонистом 5,0·10^-6 М, двумя - 5·10^-7 M, адреналин - с одним агонистом - 5,0·10^-7 М, с двумя - 2,0·10^-7 М, коллаген - разведение основой суспензии с одним индуктором - 1:3, с двумя индукторами - разведение 1:4, тромбин - с одним агонистом - 0,110 ед/мл, с двумя - 0,100 ед/мл.

Пример 1. Гражданка Н. 31 года поступила для санаторно-курортного лечения в санаторий им. И.Д.Черняховского г. Курска. При осмотре и объективном обследовании патологических изменений не было выявлено. Утром натощак было произведено взятие крови для биохимического и гематологического исследования, не выявившего отклонений от общепринятой нормы. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов для АДФ - 10^-6 М, коллагена - 1:4 разведение основной суспензии, адреналина - 2,5·10^-7 М, для тромбина - 0,100 ед/мл зафиксировала ее развитие на 30 с, 25 с и 31 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов для АДФ - 5,0·10^-7 М, коллагена 1:5 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-7 М, тромбина - 0,090 ед/мл агрегация развивалась через 24 с и 22 с соответственно.

Таким образом, патологических изменений агрегации тромбоцитов выявлено не было. Обследованной было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Больная Б., 53 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г. Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе выявлены жалобы на эпизодические головные боли в затылочной области, мелькание "мушек" перед глазами, связанные с подъемами артериального давления. Больная также предъявляла жалобы на избыточную массу тела с локализацией жира преимущественно на животе.

При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,5 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагностировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование выявило у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,8 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих дозах характеризовалась ее ускорением под влиянием АДФ + адреналин - 17 с, АДФ + коллаген - 14 с, адреналин + коллаген - 11 с, АДФ + коллаген + адреналин - 10 с, АДФ + коллаген + тромбин - 9 с.

У больной было выявлено начало развития гиперагрегации тромбоцитов, что требовало назначения коррекции. С этой целью больной было назначено сочетание индивидуально подобранной гипокалорийной диеты и физических тренировок. Через 1 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация агрегации тромбоцитов. Проведена оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов. Было зафиксировано ее развитие на 32 с, 26 с и 30 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов агрегация развивалась через 23 с и 22 с соответственно. Больной было рекомендовано соблюдать в дальнейшем данные рекомендации для профилактики возникновения гиперагрегации.

Пример 3. Больная С. 60 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г. Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе жалоб не выявлено. При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу IIа ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,0 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагностировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование позволило найти у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию IIб типа с легкой гиперхолестеринемией (5,6 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях характеризовалась ее ускорением под влиянием АДФ + адреналин - 19 с, АДФ + коллаген - 17 с, адреналин + коллаген - 13 с, АДФ + коллаген + адреналин - 9 с, АДФ + коллаген + тромбин - 11 с.

У больной было выявлено начало развития гиперагрегации тромбоцитов, что требовало проведения коррекции. С этой целью больной была назначена индивидуально подобранная гипокалорийная диета. Через 1 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация агрегации тромбоцитов. Проведена оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов составили для АДФ - 10^-6 М, коллагена - 1:4 разведение основной суспензии, адреналина - 2,5·10^-7 М, для тромбина - 0,100 ед/мл. Зафиксировано развитие агрегации на 34 с, 28 с и 33 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов для АДФ - 5,0·10^-7 M, коллагена 1:5 разведения основной суспензии, адреналина - 10^-7 М, тромбина - 0,090 ед/мл агрегация развивалась через 21 с и 24 с соответственно. Больной было рекомендовано в дальнейшем следить за артериальным давлением и массой тела, соблюдать гипокалорийную диету, что позволит избежать рецедива развития гиперагрегации.

Пример 4. Больной Т. 50 лет, проходивший лечение в санатории им. И.Д.Черняховского г. Курска, страдал хроническим тонзиллитом.

При опросе жалоб не выявлено. Объективный осмотр не обнаружил отклонений. Стандартные лабораторные и инструментальные обследования не выявили патологии. Осмотр ЛОР-врача позволило определить у пациента наличие хронического тонзиллита в стадии нестойкой ремиссии.

Агрегация тромбоцитов с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях характеризовалась ее замедлением под влиянием АДФ + адреналин - 47 с, АДФ + коллаген - 34 с, адреналин + коллаген - 39 с, АДФ + коллаген + адреналин - 28 с, АДФ + коллаген + тромбин - 27 с.

У больного было выявлено начало развития гипоагрегации тромбоцитов с риском развития кровоточивости, что требовало назначения коррекции. С этой целью больному был назначен дицинон 0,25 мг 1 таб. 3 раза и рибоксин 0,2 мг 2 таб. 3 раза в день. Через 1 мес лечения была достигнута нормализация агрегации тромбоцитов. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов зафиксировала ее развитие на 39 с, 28 с и 34 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов агрегация развивалась через 26 с и 24 с соответственно. Больному было рекомендовано регулярно наблюдаться у ЛОР-врача и решить вопрос о тонзилэктомии.

Пример 5. Новорожденный теленок №12 в возрасте 5 суток, содержавшийся в стандартных условиях коровника опытного хозяйства Курского НИИ Агропроизводства, рожденный от здоровой коровы второго отела с нормально протекавшей беременностью. Теленок не имел врожденных аномалий, травм и инфекций. На фоне кажущегося благополучия у теленка в начале 6-х суток возникла диарея с быстро возникшими признаками обезвоживания. Через 4 часа после начала заболевания осуществлено взятие крови. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях АДФ + адреналин, АДФ + коллаген, адреналин + коллаген зафиксировала ее развитие на 30 с, 23 с и 25 с соответственно. Для комбинации АДФ + коллаген + адреналин и АДФ + коллаген + тромбин агрегация развивалась через 22 с и 20 с соответственно, что указывало на высокий риск развития внутрисосудистого тромбоза. Теленку на фоне вольного питьевого режима срочно была назначена адекватная инфузионная терапия и антибиотики. Состояние животного было стабилизировано на 8-е сутки жизни. Исследование агрегации тромбоцитов показало ее нормализацию, что указывало на нивелирование риска тромбозов.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии в области гематологии. Для диагностики начинающихся нарушений агрегации тромбоцитов у обследуемых оценивают время возникновения агрегации тромбоцитов на предметном стекле при добавлении одновременно нескольких индукторов агрегации, выбранных из АДФ, адреналина, коллагена, тромбина, используя минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации. Выявление уменьшения или превышения времени агрегации тромбоцитов относительно границ нормы свидетельствует о развитии гипер- или гипоагрегации тромбоцитов. Способ позволяет выявить нарушения агрегации тромбоцитов на начальных стадиях и своевременно назначить соответствующее лечение. 4 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.

1. Способ диагностики начинающихся нарушений агрегации тромбоцитов, включающий взятие крови, ее стабилизацию, выделение богатой тромбоцитами плазмы и нанесение ее на предметное стекло, добавление индуктора агрегации, отличающийся тем, что у обследуемых оценивают время возникновения агрегации тромбоцитов одновременно с несколькими индукторами, выбранными из АДФ, адреналина, коллагена, тромбина, используя минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации, которые составляют при двойном сочетании индукторов у людей: АДФ - 10^-6 М, адреналин - 2,5·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:4, тромбин - 0,100 ед/мл.; у новорожденных телят АДФ 5,0·10^-6 М, адреналин 5,0·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:3, тромбин 0,110 ед/мл; при тройном сочетании индукторов у людей: АДФ - 5,0·10^-7 М, адреналин - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:5, тромбин - 0,090 ед/мл, у новорожденных телят: АДФ 7,5·10^-7 М, адреналин 2,0·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:4, тромбин 0,100 ед/мл, выявляют отклонения времени агрегации тромбоцитов от границ нормы, которые составляют для здоровых людей при использовании сочетания индукторов АДФ + адреналин 30-42 с, АДФ + коллаген 22-30 с, адреналин + коллаген 24-35 с, АДФ + коллаген + адреналин 21-26 с, АДФ + коллаген + тромбин 21-24 с, для новорожденных телят АДФ + адреналин 33- 47 с, АДФ + коллаген 25-32 с, адреналин + коллаген 27-39 с, АДФ + коллаген + адреналин 25-33 с, АДФ + коллаген + тромбин 23-27 с.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при превышении времени агрегации у людей для сочетания АДФ + адреналин длиннее 42с, АДФ + коллаген длиннее 30с, адреналин + коллаген длиннее 35с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 26с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 24с диагностируют гипоагрегацию тромбоцитов.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении времени агрегации у людей для сочетания АДФ + адреналин короче 30с, АДФ + коллаген короче 22с, адреналин + коллаген короче 24с, АДФ + коллаген + адреналин короче 21с, АДФ + коллаген + тромбин короче 21с диагностируют гиперагрегацию тромбоцитов.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при превышении времени агрегации у новорожденных телят для сочетания АДФ + адреналин длиннее 47с, АДФ + коллаген длиннее 32с, адреналин + коллаген длиннее 39с, АДФ + коллаген + адреналин длиннее 33с, АДФ + коллаген + тромбин длиннее 27с диагностируют гипоагрегацию тромбоцитов.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении времени агрегации у новорожденных телят для сочетания АДФ + адреналин короче 33с, АДФ + коллаген короче 25с, адреналин + коллаген короче 27с, АДФ + коллаген + адреналин короче 25с, АДФ + коллаген + тромбин короче 23с диагностируют гиперагрегацию тромбоцитов.