СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НАРУШЕНИЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине в области гематологии, и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях.

Наиболее близкими к предложенному является (Медведев И.Н. и соавт. Способ исследования агрегации тромбоцитов у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом. Патент №2250461).

Отличие заявленного изобретения от известного заключается в том, что у обследуемых оценивают время возникновения агрегации тромбоцитов с коллагеном в стандартной дозе и одновременно с сочетаниями индукторов, причем минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации составляют при двойном сочетании индукторов: АДФ 10^-6 М, адреналин 2,5·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:4, тромбин 0,100 ед./мл; при тройном сочетании индукторов: АДФ 5,0·10^-7 М, адреналин - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:5, тромбин 0,090 едю/мл; при четверном сочетании: АДФ 10^-7 М, адреналин 5,0·10^-8 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:6, тромбин 0,070 ед./мл, и вычисляют среднее значение индукции агрегации коллагеном (СЗИАК), и при значении СЗИАК в пределах 21,71-28,43 с агрегация тромбоцитов считается нормальной, при 21,70-17,01 с существует риск развития гиперагрегации, при значении СЗИАК 17,00 с и ниже отмечается явная гиперагрегация с риском тромбоза, при значении СЗИАК 28,44-35,99 с есть риск возникновения гипоагрегации, при значении СЗИАК 36,00 с и выше развивается гипоагрегация с развитием кровоточивости.

Цель изобретения: с помощью технически простых, экономически доступных и быстро выполнимых приемов диагностировать гипо- и гиперагрегацию тромбоцитов в малом объеме плазмы с коллагеном в стандартной концентрации и его сочетаниями с другими индукторами, взятыми в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях при различных состояниях.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что после взятия крови, ее стабилизации цитратом натрия 3,8%, разделения крови на плазму и эритроциты путем центрифугирования с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП) на предметном стекле проводится тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов моделировать реальные условия кровотока при использовании минимальных взаимопотенциирующих концентраций индукторов с обязательным включением в комбинации коллагена и вычислением СЗИАК, по величине которого судят о тонких нарушениях агрегационной способности тромбоцитов.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. После взятия крови в цитрат натрия 3,8% в соотношении 9:1 ее центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин, для получения БТП. Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л).

Из получившегося объема стандартизированной плазмы отбирают из расчета по 0,02 мл плазмы на каждую исследуемую комбинацию индукторов. Оставшийся объем плазмы можно использовать для других гематологических и биохимических исследований.

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками растворы нескольких индукторов (фиг.1-3) общим объемом, равным объему плазмы. Объемы агонистов определяются по формуле

,

где n - число используемых одновременно индукторов агрегации (фиг.1-3).

В качестве агонистов, идущих в сочетании с коллагеном, возможно использование аденозиндифосфата (АДФ), тромбина и адреналина, что ведет к развитию агрегации раньше, чем при изолированном использовании коллагена (табл.1 и 2). Минимальные взаимопотенциирующие дозы индукторов ниже стандартных (табл.3 и 4) и способны вызывать агрегацию тромбоцитов только при сочетанном применении индукторов. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см (фиг.4). Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Исследование повторяют 2-3 раза с каждой комбинацией индукторов, находя среднее значение из полученных результатов. Например, при троекратной регистрации времени развития агрегации тромбоцитов с коллагеном и АДФ у одного пациента получено три значения 23 с, 24 с и 25 с, тогда принимаемая во внимание цифра составит среднее арифметическое из них 24 с.

Таблица 1 Время развития агрегации тромбоцитов у здоровых людей при изолированном применении коллагена в стандартной концентрации Категория обследованных Время развития агрегации тромбоцитов под влиянием коллагена Коллаген, с Здоровые люди, 27-37 n=21 33,0±0,13

В табл.1 приводится время развития агрегации тромбоцитов в случае изолированного воздействия коллагена в стандартных концентрациях, в табл.2 - его сочетанного влияния в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях. Из представленного материала следует, что по сравнению со стимуляцией только коллагеном при применении его сочетания с другими индукторами средняя скорость агрегации возрастает, а временной разброс ее наступления сокращается, что, вероятно, связано с потенцированием механизма активации тромбоцитов коллагеном за счет стимуляции других механизмов активации. В случае одномоментного использования четырех индукторов эта закономерность выражена еще в большей степени. Необходимо отметить, что исследование агрегационной способности кровяных пластинок с несколькими индукторами моделирует события, происходящие в кровотоке в области повреждения сосуда и инициации процесса гемостаза, т.к. реально в этих условиях тромбоциты активируются несколькими агонистами в обязательном присутствии коллагена. Например, у больных артериальной гипертонией с метаболическим синдромом найденные закономерности выражены еще больше, чем у здоровых людей, из-за активации у них в большинстве случаев тромбоцитарных функций с ускорением развития агрегации кровяных пластинок.

Таблица 3 Стандартные дозы индукторов, вызывающие агрегацию тромбоцитов при их изолированном применении Индукторы АДФ, М Адреналин, М Коллаген, разведение основной суспензии Тромбин, ед/мл Дозы 0,5·10^-4 5·10^-6 1:2 0,125

Из табл.3 и 4 следует, что минимальные вызывающие агрегацию дозы индукторов при сочетанном их использовании значительно ниже, чем в стандартных условиях при использовании воздействия на тромбоциты одного агониста. При одновременном присутствии в БТП четырех индукторов минимальная взаимопотенциирующая концентрация индукторов еще ниже, чем в случае двух или трех индукторов. Одномоментное применение нескольких индукторов приближает наши представления о реальных условиях при инициации гемостаза в сосудах и позволяет рассчитать СЗИАК и провести тонкую и раннюю диагностику у них гипо- и гиперагрегации тромбоцитов.

Суть диагностики заключается в выявлении отклонений величины СЗИАК от нормативных значений при исследовании агрегации тромбоцитов с коллагеном в стандартной концентрации и сочетаниями индукторов с обязательным присутствием коллагена во взаимопотенциирующих концентрациях, вычисляемого по формуле

При значении СЗИАК в пределах 21,71-28,43 с агрегация тромбоцитов считается нормальной, при 21,70-17,01 с существует риск развития гиперагрегации, при значении СЗИАК 17,00 с и ниже отмечается явная гиперагрегация с развитием тромбоза в ближайшее время; при значении СЗИАК 28,44-35,99 с есть риск гипоагрегации, а при значении СЗИАК 36,00 с и выше развивается гипоагрегация с явлениями кровоточивости.

Пример 1. Гражданка А. 26 лет, поступила в санаторий. При осмотре и объективном обследовании патологических изменений не было выявлено. Утром натощак было произведено взятие крови для биохимического и гематологического исследований, не выявивших отклонений от общепринятой нормы. Оценка агрегации кровяных пластинок в стандартизированной по количеству тромбоцитов плазмы (200·10⁹ тр/л) с коллагеном (29 с) в стандартной дозе и комбинацией индукторов коллаген + АДФ, коллаген + тромбин, коллаген + адреналин, коллаген + адреналин + АДФ, коллаген + АДФ + тромбин, коллаген + АДФ + адреналин + тромбин с минимальными взаимопотенциирующими концентрациями индукторов зафиксировала ее развитие на 24 с, 22 с, 27 с, 25 с, 22 с, 18 с соответственно. При этом СЗИАК составлял 23,86 с., что указывало на нормальную активность тромбоцитов у обследованной.

Обследованной было рекомендовано и далее вести здоровый образ жизни.

Пример 2. Больная С., 53 года, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г.Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе выявлены жалобы на эпизодические головные боли в затылочной области, мелькание „мушек" перед глазами, связанные с подъемами артериального давления. Больная также предъявляла жалобы на избыточную массу тела с локализацией жира преимущественно на животе.

При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу II а ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,5 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагностировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование выявило у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию II б типа с легкой гиперхолестеринемией (5,8 ммоль/л.).

Агрегация тромбоцитов с коллагеном в стандартной дозе составила 26 с с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих дозах коллаген + АДФ 21 с, коллаген + тромбин 19 с, коллаген + адреналин 20 с, коллаген + адреналин + АДФ 16 с, коллаген + АДФ + тромбин 17 с, коллаген + АДФ + адреналин + тромбин 15 с с понижением СЗИАК до 19,14 с, что указывало на риск развития гиперагрегации.

Больной было назначено сочетание индивидуально подобранной гипокалорийной диеты и физических тренировок. Через 1 мес их применения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация СЗИАК, составившего 23,60 с. Больной было рекомендовано соблюдать в дальнейшем данные рекомендации для профилактики возникновения риска гиперагрегации.

Пример 3. Больная Н. 57 лет, находящаяся на диспансерном учете по артериальной гипертонии в поликлинике МУЗ ГБ СМП г.Курска и имеющая в качестве сопутствующей патологии метаболический синдром, обследована в плановом порядке.

При опросе жалоб не выявлено. При объективном осмотре выявлено ожирение по андроидному типу II а ст. и смещение левой границы сердца влево на 1,0 см. Электрокардиографически выявлено наличие у пациентки гипертрофии левого желудочка. Окулист диагностировал у больной гипертоническую ангиопатию сетчатки. Лабораторное обследование позволило найти у нее нарушение толерантности к глюкозе, гиперлипидемию II б типа с легкой гиперхолестеринемией (5,6 ммоль/л).

Агрегация тромбоцитов с коллагеном в стандартной концентрации составила 27 с с комбинациями индукторов с обязательным присутствием коллагена в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях характеризовалась ее ускорением под влиянием коллаген + тромбин 25 с, АДФ + коллаген 14 с, адреналин + коллаген 13 с, АДФ + коллаген + адреналин 13 с, АДФ + коллаген + тромбин 12 с, коллаген + АДФ + тромбин + адреналин 11 с с понижением СЗИАК до 16,42 с, что указывало на риск наступления в ближайшее время тромбоза.

Больной были назначены индивидуально подобранная гипокалорийная диета, дозированные физические нагрузки и амлодипин 10 мг 1 раз в сутки. Через 2 мес лечения на фоне снижения массы тела и улучшения биохимических показателей крови была достигнута нормализация СЗИАК (23,90 с).

Больной было рекомендовано в дальнейшем следить за артериальным давлением и массой тела, соблюдать данные ей рекомендации, что позволило бы ей избежать рецедива развития гиперагрегации в последующем.

Пример 4. Больной Ф. 33 года, проходивший лечение в одном из санаториев г.Курска, страдал хроническим тонзиллитом.

При опросе жалоб не выявлено. Объективный осмотр не обнаружил отклонений. Стандартные лабораторные и инструментальные обследования не выявили патологии. Осмотр ЛОР-врача позволил определить у пациента наличие хронического тонзиллита в стадии нестойкой ремиссии.

Агрегация тромбоцитов с коллагеном в стандартной дозе составила 42 с с комбинацией индукторов в минимальных взаимопотенциирующих концентрациях достигла коллаген + тромбин 30 с, АДФ + коллаген 34 с, адреналин + коллаген 38 с, АДФ + коллаген + адреналин 29 с, АДФ + коллаген + тромбин 28 с, коллаген + АДФ + тромбин + адреналин 26 с. СЗИАК составил 32,43 с, что указывало на риск гипоагрегации и возникновения кровоточивости. Больной не прислушался к данным ему рекомендациям, что вызвало дополнительный рост СЗИАК (36,90 с) и развитие кровоточивости десен через 2 недели. После этого пациент стал соблюдать данные рекомендации: дицинон 0,25 мг 1 таб. 3 раза и рибоксин 0,2 мг 2 таб. 3 раза в день. Через 1 мес лечения была достигнута нормализация СЗИАК (28,00 с) с исчезновением кровоточивости. Больному было рекомендовано регулярно наблюдаться у ЛОР-врача и решить вопрос о тонзилэктомии.

Изобретение относится к медицине в области гематологии и может быть использовано для оценки агрегации тромбоцитов с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях. Для осуществления способа берут кровь, стабилизируют ее, выделяют богатую тромбоцитами плазму (БТП) и наносят на предметное стекло, где проводят тест на агрегацию тромбоцитов с несколькими индукторами. Визуальная оценка агрегации тромбоцитов в этих условиях позволяет с небольшим объемом (0,02 мл) плазмы и малым объемом индукторов моделировать реальные условия кровотока при использовании минимальных взаимопотенциирующих концентраций индукторов с обязательным включением в комбинации коллагена и вычислением СЗИАК, по величине которого судят о тонких нарушениях агрегационной способности тромбоцитов. 4 ил., 4 табл.

Способ выявления нарушений агрегации тромбоцитов, включающий взятие крови, ее стабилизацию, выделение богатой тромбоцитами плазмы и нанесение ее на предметное стекло, добавление одновременно нескольких индукторов агрегации, в которые входят коллаген, АДФ, адреналин, тромбин, при этом используют минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации, отличающийся тем, что у обследуемых оценивают время возникновения агрегации тромбоцитов с коллагеном в стандартной дозе и одновременно с сочетаниями индукторов, причем минимальные взаимопотенциирующие концентрации индукторов агрегации составляют при двойном сочетании индукторов: АДФ - 10^-6 М, адреналин - 2,5·10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:4, тромбин - 0,100 ед./мл; при тройном сочетании индукторов: АДФ - 5,0·10^-7 М, адреналин - 10^-7 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:5, тромбин - 0,090 ед./мл; при четверном сочетании: АДФ 10^-7 М, адреналин 5,0·10^-8 М, коллаген - разведение основной суспензии 1:6, тромбин 0,070 ед./мл, и вычисляют среднее значение индукции агрегации коллагеном (СЗИАК) по формуле

при значении СЗИАК в пределах 21,71-28,43 с агрегация тромбоцитов считается нормальной, при 21,70-17,01 с существует риск развития гиперагрегации, при значении СЗИАК 17,00 с и ниже отмечается явная гиперагрегация с риском тромбоза, при значении СЗИАК 28,44-35,99 с есть риск возникновения гипоагрегации, при значении СЗИАК 36,00 с и выше развивается гипоагрегация с развитием кровоточности.