ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS N.V.EP 317/402 "НАРИНЭ" ААА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПРЕПАРАТОВ, ДИЕТИЧЕСКИХ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИСБАКТЕРИОЗА И ЕГО ПОСЛЕДСТВИЙ Российский патент 2000 года по МПК A23C9/12 A61K35/74 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма лактобацилл, обладающего способностью продуцировать интерферон в одноклеточных клетках человека, влиять на физиологические и иммунологические процессы в организме. Штамм может быть использован для приготовления препаратов и диетических продуктов питания, в том числе кисломолочных, предназначенных для профилактики и лечения дисбактериоза и его последствий.

Причины, вызывающие дисбактериоз известны: это - различные инфекционные заболевания, прием антибиотиков, химио-, гормоно- и лучевая терапия, психоэмоциональные стрессы и неблагоприятная экологическая обстановка, социальные факторы, алкоголизм и другие.

Они прямо или опосредованно способствуют дисбалансу микробиоценоза организма, и, в первую очередь, кишечной микрофлоры.

Для лечения дисбактериоза необходимо по возможности устранить его причины и восстановить микрофлору.

Таким образом, актуальной задачей является выявление новых штаммов лактобактерий и разработка препаратов и продуктов питания на их основе для профилактики и восстановления нормальной функции кишечной микрофлоры, устранения дисбактериоза и его последствий.

Известны перспективные штаммы лактобацилл данного вида, используемые в создании препаратов и молочнокислых продуктов, способствующие регуляции микробиоценоза кишечника и неспецифической иммуностимуляции при дисбактериозах кишечника различной этиологии (В.М. Коршунов "Проблема регуляции микрофлоры кишечника". Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. M. 1995, N 3, с. 48-52).

Известен штамм Lactobacillus acidophilus ВКМ В-2020 Д-антибиотикорезистентный антагонист возбудителей кишечных инфекций. Штамм рекомендован в качестве основы при разработке антагонистических биологических средств профилактики и лечения кишечных заболеваний, вызванных патогенной и условно-патогенной микрофлорой. Может быть использован для создания бактериальных препаратов для коррекции микрофункциональных нарушений желудочно-кишечного тракта (RU 12063436 C1, С 12 N 1/20, 08.02.94).

Известен штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus-13 (Агарац), положительно влияющий на регенеративные процессы в кишечнике при лечении желудочно-кишечных заболеваний, используемый для коррекции дисбактериоза разного вида и характера у новорожденных и взрослых.

Штамм используют в производстве лечебно-диетического продукта питания, способствующего подавлению роста патогенных форм микроорганизмов и нормализации микрофлоры кишечника, благодаря высокой предельной кислотности штамма порядка 400^oТ (RU 2103354, кл. С 12 N 1/20, 27.01.98).

Известен штамм бактерий Lactobacillus acidophilus-92 n.v. (Ани), используемый для коррекции дисбактериоза при желудочно-кишечных заболеваниях и у больных раком толстой кишки (RU 2103353, кл. С 12 N 1/20, 27.01.98).

Известный штамм Lactobacillus acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ИНМИ-9602, обладает медленной кислотообразующей способностью. Максимальное образование - 360^oТ. Штамм продуцирует значительное количество безвредных для детей и взрослых антибиотических веществ, подавляющих рост и развитие как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий возбудителей острых форм желудочно-кишечных заболеваний (SU 163357, кл. С 12 N 1/20, 1964).

Многолетние наблюдения показали отсутствие фаголизиса у штамма L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ". Цельномолочный продукт готовят заквашиванием цельного молока при 28-40^oC. 1 мас.% штамма. Свертывание наступает через 5-8 ч, кислотность продукта 60-90^oТ. Указанный продукт пригоден в качестве закваски, а также лечебно-профилактического средства при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Используют продукт в медицинской и ветеринарной практике.

Продукт, получаемый с использованием штамма L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" кислотностью не выше 90^oТ не обеспечивает получение человеком всего комплекса аминокислот, витаминов необходимых для коррекции дисбактериозов и различных желудочно-кишечных заболеваний.

Целью изобретения является выявление нового штамма L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ААА, отвечающего современным требованиям, предъявляемым к препаратам и лечебно-профилактическим продуктам, резистентного к ряду антимикробных препаратов, проявляющего высокую кислотообразующую активность и выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, обладающего высокой витаминообразующей способностью, повышенной производительностью α и γ-интерферона в одноклеточных клетках человека как факторов, играющих определяющую роль в противовирусной и противораковой защите, влияющего на физиологические процессы в организме.

Штамм L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ААА получен путем многолетней селекции исходной культуры L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" и направленного отбора по показателям: антибиотическая активность к возбудителям желудочно-кишечных заболеваний, антибиотикорезистентности, динамики размножения бактериальной популяции в питательной среде, витаминообразующей способности и количеству жизнеспособных бактерий в 1 мл штамма, составляющее порядка 220-250 млн. клеток лактобактерий.

Сравнительные данные по антагонистической активности предлагаемого и известного штаммов приведены в таблице (см. в конце описания).

Заявляемый штамм обладает повышенным антагонизмом по отношению к указанным выше представителям энтеропатогенной кишечной микрофлоры.

Установлено, что штамм L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" AAA нечувствителен к - сульфаметоксину, этазолу, сульфадену, сульфитону, сульфадимезину, бисептолу, норсульфазолу, таривиду, налиду, ампиоксу, неграму, грамурину.

Кроме этого у штамма обнаружено повышенное содержание ароматических веществ - до 6,9 мг%, аминокислот - до 23 мг%, аскорбиновой кислоты -до 1,20 мг%, рибофлавина - до 1680 мг%.

Штамм проявляет целлюлолитическую активность. Обладает более высокой скоростью роста, чем исходный штамм, что является позитивным моментом для производства.

Штамм L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ААА депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ВКПМ В-7747 и Коллекции культур микроорганизмов ГНЦ "Вектор" под номером В-741 как предназначенный для приготовления сухого и таблетированного препарата "Наринэ".

Культурально-морфологические и биохимические признаки штамма.

Гомоферментативные неподвижные грамположительные микроаэрофильные палочки величиной от 2 до 200 мк, обладают высокой фенолорезистентностью до 0,4-0,5%, фталозолы до 1%, синтомицино-устойчивостью до 0,003%, способны продуцировать значительное количество безвредных антибиотических веществ, подавляющих рост и развитие как грамположительных так и грамотрицательных (Е. coli, все бактерии возбудители дизентерии и др.) бактерии.

Штамм нитраты не редуцирует, индол не образует, желатин не разжижает, гемолитической способностью не обладает. Сбраживает без образования газа лактозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, маннозу, левулозу, галактозу, мальтозу, рафинозу, крахмал, декстрин, сорбит, дульцит, при сбраживании которых в основном образуется молочная кислота и незначительное количество летучих кислот, не превышающих 5-6% общего количества титруемых кислот. Сбраживает молоко в течение 4-5 ч при температуре 37^oC. Не продуцирует каталазу. Штамм гомоферментативный, способный к образованию флавпротеиновых протеаз. Синтезирует витамины групп В и С, фолиевую кислоту, тиамин, рибофлавин, витамин E, PP, никотиновую кислоту.

Штамм обладает медленной кислотообразующей способностью - минимальная активность 90^oТ, оптимальная активность до 120-160^oТ, максимальная активность до 380^oТ. Количество жизнеспособных лактобактерий в 1 мл штамма 150-250 млн. живых клеток лактобактерий.

Устойчивость к антибиотикам.

Слабочувствителен к: гентамицину, олететрину, тетрациклину, кефзолу, рифампицину, неомицину, канамицину, амикацину, олеандомицину, нитроксолону, фурадонину, цетазолу, метрацидозолу, фузидину, клафорану;
Нечувствителен к: сульфаметоксину, этазолу, сульфадену, сульфитону, сульфадимезину, норсульфазолу, бисептолу, таривиду, налину, ампиоксу, неграму, грамурину.

Устойчивость штамма к антибиотикам позволяет использовать его в бактерио- и антибиотикотерапии с повышением санирующего и профилактического эффекта.

Пример 1.

Для получения закваски стерилизованное или пастеризованное молоко заквашивают при температуре 37-39^oC культурой L. acidophilus n. v. 317/402 "Наринэ" ААА из расчета 2% от общего количества молока. Смесь инкубируют в течение 28 ч. Сквашенную закваску охлаждают до 6^oC, выдерживают при этой же температуре 8 ч. Кислотность образовавшегося сгустка 160^oТ. Количество живых клеток в 1 мл жидкой закваски до 250 млн клеток.

Полученная закваска может быть использована в качестве бактериального препарата с высокими селекционными свойствами для получения диетических и лечебных продуктов питания или для непосредственного употребления в пищу. Продукт в виде сухой закваски используют как лекарственное средство для лечения и профилактики различных заболеваний, в т.ч. вторичных иммунодефицитов.

Пример 2.

Для приготовления кисломолочного продукта "Наринэ" в охлажденное до температуры 38-39^oC цельное молоко вносят 2% закваски штамма L. acidophilus n. v. 317/402 "Наринэ" ААА. Смесь перемешивают и выдерживают при 37^oC в течение 5 ч или при комнатной температуре в течение 6 ч до образования сгустка кислотностью 80-90^oT, затем помещают в холодильник на 2-3 ч. Качество приготовленного напитка сохраняется в течение одной недели при температуре плюс 4-6^oC.

Питательная ценность продукта "Наринэ" соответствует 820-870 кал. Кислотность готового продукта - 130^oT., азот,% - 0,610, аминный азот, мг% - 24,7.

Продукт, полученный на основе штамма L. acidophilus n. v. 317/402 "Наринэ" прошел клинические испытания в Институте практологии Минздрава Республики Армении, Институте эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Клинические испытания показали пригодность штамма активно заселяться в слизистой пищеварительного тракта и толстой кишки, поддерживать нормальный биоценоз кишечника, корректировать дисбактериоз различного вида желудочно-кишечных заболеваний.

Испытание препарата "Наринэ" в опытах на добровольцах и больных подтвердило высокую иммуномодулирующую активность.

Изучалась динамика функционального состояния организма в течение 1 ч после приема сухого лиофилизированного препарата штамма L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ААА. Препарат принимали утром за 30 мин до еды по 1 пакету в течение 30 дней.

Реакцию организма регистрировали излучением пальцев конечностей до приема препарата, далее - в течение 1 ч, проводя фотографирование через каждые 10 мин. Анализ биоэлектрограмм показал, что у испытуемых с нормальным биоэнергетическим статусом прием препарата через 10 мин вызывал улучшение картины свечения, которая сохранялась в течение всего срока наблюдения.

Оценка функционального состояния органов и систем в ходе часового мониторинга выявила динамику состояния в секторах проекций тонкого и толстого кишечника, периферического и мозгового кровообращения, эндокринной системы и почек.

У всех испытуемых лучшие показатели отмечались через 40 мин после приема "Наринэ", далее (через 1 ч.) они несколько снижались, оставаясь выше исходных на 0,5-1,0 балла.

Полученные результаты объективно свидетельствуют о том, что корригирующее влияние препарата "Наринэ" проявляется уже через 10 мин после приема, когда еще отсутствует ассимиляция.

Этот факт можно объяснить энерго- информационным воздействием полевых компонент живых лактобактерий на энерго-информационную систему организма человека, корригирующее воздействие лактобактерий препарата "Наринэ", в частности при восстановлении микробиоценоза организма человека.

Отмечаемая положительная динамика биоэнергетического, психоэмоционального статуса, функционального состояния основных органов и систем к концу курса приема препарта позволяет рекомендовать "Наринэ" для фоновой терапии при многих заболеваниях.

Курс коррекции дисбактериоза кисломолочным диетическим напитком "Наринэ" у пациентов не только снизил признаки заболевания желудочно-кишечного тракта, но и выявил существенное улучшение в деятельности сердечно-сосудистой системы, включая звенья и центральной, гуморальной и вегетативной регуляции. Последние связаны с уменьшением интоксикации организма продуктами жизнедеятельности патогенной бактериальной микрофлоры.

Показано также, что применение "Наринэ", выработанного с использованием штамма L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ААА, для коррекции дисбактериоза, вызванного гепатитом, привело к нормализации микрофлоры кишечника, уменьшению токсического прессинга, но не изменило хода патологического процесса в печени.

Изучено состояние лимфатической системы при применении эубиотика "Наринэ" для выяснения лимфатрофных свойств на белых крысах Vistar. Полученные результаты свидетельствуют, что "Наринэ" нормализует желудочно-кишечную экосистему, проявляя при этом лимфотрофные свойства в отношении лимфатической системы.

Применение продукта "Наринэ" при эндотоксикозе стабилизирует структурный ответ лимфатических узлов и не усиливает токсический прессинг, т.к. происходит восстановление микробиоценоза.

Особо заслуживает внимания факт установления у штамма L. acidophilus n. v. 317/402 "Наринэ" ААА достаточно высокой целлюлазной активности. Периодическое применение "Наринэ", выработанного на основе заявленного штамма в качестве пищевой добавки, предотвращает нежелательные последствия, связанные с отсутствием в кишечнике естественных микробов - целлюлазников.

Использование "Наринэ", содержание лактобактерий в котором составляет не менее 5•10⁸ КОЕ/г в количестве 500-700 мл в сутки, обуславливает создание оптимальных условий для восстановления роста собственной индигенной флоры.

Применение в комплексной терапии "Наринэ" больными дизентерией - 428 человек в возрасте от 15 до 55 лет показало сокращение длительности диарейного синдрома, интоксикации, уменьшало сроки рековаленсценции и снижало частоту развития дисбактериоза на 58% по сравнению с контрольной группой.

Эти данные нашли подтверждение в опытах на in vivo, проведенных на гнотобионтах человеческой природы. Изучение кинетики адгезии E.coli к эпителию кишечника гнотобионта показало, что при совместном использовании культур кишечной палочки и лактобактерий штамма L. acidophilus n.v. 317/402 "Наринэ" ААА адгезивная способность E.coli значительно возрастает.

Этот эффект наиболее выражен при высокой концентрации лактобактерий, что в клинической практике обуславливает необходимость применения эубиотиков с высоким содержанием микробных клеток в 1 мл или грамме сухого вещества.

Полученные данные дают основания широко рекомендовать препарат "Наринэ", полученный с использованием заявленного штамма в качестве эубиотика для лечения острых кишечных инфекций.

Профилактика дисбактериоза у детей, страдающих кишечными инфекциями, препаратом "Наринэ" по отношению к 174 детям детского санатория "Белокуриха" Минздрава России в период с 12.10.98-12.03.99 со следующими заболеваниями: хронический гастродоуонит - 62 ребенка, дисбактериоз кишечника - 48 детей, часто болеющие дети - 32 ребенка, хронический тонзиллит - 11 детей, нейродермит, псориаз - 16 детей, ревматоидный полиартрит - 5 детей.

На одного ребенка в среднем пришлось 28 процедур. Применение продукта проводилось курсами от 10 до 20 дней. При этом 10-дневный курс проведен 27 детям, 14-дневный - 67 детям, 20-дневный - 80 детям.

Контрольная группа составила 30 детей, в которой проводилось комплексное санаторно-курортное лечение (бальнеотерапия, физиотерапия, массаж, лечебная физкультура) без использования "Наринэ".

При определении эффективности лечения в контрольной группе детей с нейродермитами, дисбактериозом, хроническим гастродуинитом отмечалось улучшение в 98,9% случае. В группе с применением продукта "Наринэ" в 90% случаев отмечалось значительное улучшение, а в 8,7% - улучшение. Эффективность лечения не зависит от длительности приема продукта "Наринэ".

Учитывая актуальность проблемы дисбактериоза при ожоговой травме у детей на базе Новосибирского межтерриториального ожогового центра проведено исследование с целью изучения частоты развития дисбактериоза у детей с ожогами, получающих антибактериальную терапию и эффекта воздействия продукта "Наринэ", выработанного с использованием заявленного штамма, на восстановление микробиоценоза кишечника.

Группа включала 16 пациентов (в т.ч. 8 девочек) в возрасте от 1 до 7 лет (среднее - 3,9 лет) с площадью ожога от 4 до 52%, в том числе глубокого ожога от 4 до 29%. Контрольная группа состояла из 12 пациентов (в том числе 7 девочек) в возрасте от 1 до 6 лет с площадью ожога от 5 до 40%, в т.ч. глубокого ожога от 2 до 30%. В обеих группах применялась стандартная методика консервативного и оперативного лечения, но контрольная группа не получала биопрепарата.

"Наринэ" назначался в виде водного раствора 2 раза в сутки за 30 мин до еды по 1 флакону. В среднем курс составил 30 дней.

Проведен мониторинг показателей количества лейкоцитов, индекса лейкоцитарной интоксикации и бактериологического посева кала на микрофлору в начале лечения и после заживления ран.

Исследование показало, что применение "Наринэ" как пищевой добавки, способствовало нормализации количества лейкоцитов в крови и снижению индекса лейкоцитарной интоксикации, что свидетельствует о повышении резистентности организма и наличии детоксикационного эффекта. Повышение концентрации бифидобактерий в кале, являющееся следствием применения препарата, свидетельствует о положительном клиническом результате при частичной коррекции явления дисбактериозов.

Кроме того, в опытной группе до лечения у 2 пациентов отмечена дисфункция желудочно-кишечного тракта (рвота, понос), после лечения подобные явления отмечены у 2 других детей. В контрольной группе таких явлений не отмечено.

Выявленные свойства "Наринэ" позволяют также рассматривать его в качестве лимфотрофного средства. Прием "Наринэ" сказывается на состоянии структурно-функциональных зон лимфатических узлов, определяющих активность гуморального и клеточного иммунитета.

Кисломолочный "Наринэ" прошел испытание в ветеринарии на эффективность восстановления микробиоценоза кишечника телят и рекомендован для оздоровления телят в животноводстве.

Штамм L. acidophilus n.v. "Наринэ" ААА может быть использован для лечения дисбактериозов и заболеваний, связанных с нарушением нормальной микрофлоры кишечника, как у человека, так и у ценных экземпляров животных.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в молочной промышленности, медицине и ветеринарии. Штамм Lactobacillus acidophilus n.v. ЕР 317/402 "Наринэ" ААА получен в результате отбора из исходной культуры Lactobacillus acidophilus n.v. ЕР 317/402 "Наринэ" селекцией по антагонистической активности по отношению к кишечной микрофлоре, устойчивости к антибиотикам широкого спектра действия, динамики размножения бактериальной популяции в питательной среде. Признаки штамма являются стабильными. Штамм Lactobacillus acidophilus n.v. ЕР 317/402 "Наринэ" ААА депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-7747 и коллекции культур микроорганизмов ГНЦ "Вектор" под номером В-741. Повышенная устойчивость штамма к ряду антибиотиков позволяет использовать его в бактерио- и антибиотикотерапии с увеличением санирующего и профилактического эффекта. Продукт в виде сухой закваски "Наринэ" используют как лекарственное средство для лечения и профилактики дисбактериоза и его последствий, в том числе вторичных иммунодефицитов. 1 табл.

Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus n.v. EP 317/402 "Наринэ" ААА ВКПМ В-7747, используемый при приготовлении препаратов, диетических и лечебно-профилактических продуктов для лечения дисбактериоза и его последствий.