ШТАММ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS K/A-08-АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫЙ И СОЛЕУСТОЙЧИВЫЙ АНТАГОНИСТ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 C12N1/20 C12R1/23 

Изобретение относится к биологически чистой культуре штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophillus К/А^R - 08, которая по ряду полезных качеств может быть использована в качестве продуцента препаратов-эубиотиков и кисломолочных лечебно-профилактических продуктов питания.

Молочнокислые бактерии и лактобациллы, в частности, являются ключевыми представителями облигатного микробиоценоза здорового человека и распространены практически по всему организму, начиная с кожных поверхностей, от ротовой и заканчивая анальной полостями включительно. Именно в верхних отделах кишечного тракта паразитирует основная масса патогенной и условно-патогенной микрофлоры (УПМ). Антагонизм лактобацилл, ведущими звеньями которого является интенсивность кислотообразования, способность к продукции антибиотических веществ, обуславливает их использование в качестве биологических препаратов естественного происхождения при лечении и профилактике острых кишечных инфекций различного происхождения. Лактобациллы продуцируют нуклеазы, лизоцим, витамины, усиливают активность макрофагов в организме, стимулируют секрецию антител, цитокинов, что в значительной степени способствует повышению общей иммунологической реактивности организма и установлению симбиотических отношений с бифидо- и колибактериями (Шкарпета М.М. и др. Изучение иммуномодулирующего действия нормальной микрофлоры кишечника // Иммунология, 1989. - С. 26-30).

Увеличение арсенала эффективных и доступных бактериальных препаратов и совершенствование существующих связано с необходимостью получения новых высокоактивных штаммов лактобацилл. В первую очередь обращает внимание их антибиотикорезистентность, спектр антагонистической активности к УПМ, интенсивность кислотообразования. Немаловажное значение, кроме того, имеют такие фенотипические характеристики штамма, как его способность развиваться при повышенной осмотической активности среды, ростовые свойства и морфометрические параметры клеток. Последние имеют значение в технологии промышленного получения бакпрепаратов, поскольку удельный выход биомассы с крупными клетками заведомо ниже, чем с мелкими.

Предлагаемый штамм Lactobacillus acidophillus K/A^R-08 "Наринэ-Вита" новый, в научно-медицинской и патентной литературе не описан. Штамм был получен в результате направленного отбора изолятов, выделенных из фекалий подростка, принимавшего в процессе и после курса антибиотикотерапии молоко, сквашенное культурой Lactobacillus acidophillus ИНМИА-9602 (Ер 317/402 "Наринэ") с селекцией по устойчивости к ряду антибиотиков.

Исходный штамм - прототип Lactobacillus acidophillus ИНМИА-9602 (Ер 317/402 "Наринэ") - известен как продуцент лечебного продукта "Наринэ", с успехом применяемый в медицинской практике для коррекции микробиоценоза и функции кишечника у детей и взрослых (Щербакова Э.Г. и др. Изучение лактобактерий производственного штамма лечебного продукта "Наринэ" и его сочетания с лизоцимом // Тез. докл. 5 Российского национ. конгр. "Человек и лекарство". - М, 1998. С. 421; SU, 958497, C 12 N 1/2, 1982; RU 2035871, C1, 1995; Маркосян Л.С. и др. Цитологические и биохимические особенности штамма молочнокислых бактерий продукта "Наринэ" // Биолог, журн. Армении, 1998. - N 3. - С. 171-176).

Проведенные нами исследования показали, что производственный штамм-прототип, обладая умеренной антагонистической активностью в отношении УПМ и довольно широким спектром устойчивости к антибактериальным препаратам, имеет все же невысокий ростовой потенциал - за 24 ч культивирования в среде на основе гидролизата молока вырастает 7-8 lg клеток в 1 мл, а также весьма высокую скорость инактивации в процессе хранения сухой биомассы.

Цель изобретения - получение нового штамма Lactobacillus acidophillus, отличающегося от прототипа более высокими показателями по антибиотикорезистентности, антагонизму к УПМ кишечной микрофлоры и адаптированному к производственным условиям получения биомассы.

Идентификацию штамма проводили по основным морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим свойствам согласно определителю Bergey (1986, 8-е изд.). Выделенный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Грам-положительные, неподвижные палочки размером (0,3-0,5 х 1,5-3,0 мкм), спор и капсул не образуют.

Культуральные признаки. На поверхности агара с гидролизованным молоком и MRS-агаре 48-часовая культура образует гладкие белые колонии с ровными краями диаметром 2-3 мм. На МПА посевы штамма за аналогичное время культивирования образуют гладкие белые колонии с ровными краями и 3-4 мм в диаметре. В полужидких средах (MRS, Блаурокка) штамм вырастает в виде белых "комочков" диаметром 1-2 мм.

Оптимальная температура роста - 36-38^oC, максимальная - 45^oC, минимальная - 20^oC. Оптимальная кислотность среды для развития штамма - (6,0±0,5) ед. pH.

Физиолого-биохимические признаки. Сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, галактозу, целлобиозу, фруктозу, раффинозу. Основной продукт сбраживания углеводов - DL молочная кислота. Время свертывания молока при температуре инкубации 37^oC составляет 8 ч, а предельная его кислотность через 3 суток при указанной температуре достигает 140^oТ.

Штамм каталазоотрицательный, не образует аммиак из аргинина, не разжижает желатин, не образует газ из глюкозы, не гидролизует крахмал, а также не ассимилирует арабинозу, дульцит, ксилозу, маннит, мелецитозу, мелибиозу, рамнозу, рибозу, сорбит, цитруллин.

Штамм может развиваться в среде с 0,5% фенола и в присутствии следующих антибиотиков: олеандомицина, полимиксина, ристомицина, стрептомицина, эритромицина, канамицина, неомицина, фузидина.

Штамм антагонистически активен в отношении патогенных и УПМ: Sh.sonnei, Sh. flexneri, E. coli 157, St.aureus, Pr.vulgaris, Pr.mirabilis, Ps.aeruginosa.

Штамм растет в присутствии 6% NaCl.

Поддержание штамма: лиофилизация культуры с применением сахарозо-молочно-желатиновой защитной среды с последующим хранением при 4 - 8^oC.

Проверка штамма на белых мышах показала его безвредность.

Эффективность штамма в качестве продуцента лечебно-профилактического кисломолочного продукта проверялась на 5 добровольцах, часто страдающими расстройствами пищеварения (диспепсия, диарея). Для этого 1 л цельного молока, прокипяченного и остуженного до 40^oC, заквашивали культурой Lactobacillus acidophillus K/A^R - 08, термостатировали при 36-37^oC в течение 4 - 5 ч и хранили до использования при 4 - 8^oC. Полученный продукт имел умеренную кислотность (70-90^oТ) и приятный кисломолочный вкус без посторонних привкусов. Его принимали внутрь по 200 мл (1 стакан) 1 раз в день в течение 2 недель. Наблюдение за добровольцами показало стойкое улучшение стула и общего их самочувствия.

Была проведена сравнительная оценка предлагаемого штамма и известного прототипа в идентичных условиях (табл. 1-5).

Из приведенных данных видно, что по сравнению с прототипом предлагаемый штамм имеет, во-первых, более выраженную антагонистическую активность по отношению к патогенным и УПМ (табл.2), во-вторых, несколько шире спектр антибиотикоустойчивости - устойчив к олеандомицину, ристомицину, стрептомицину и эритромицину (табл. 3), в-третьих, более высокую молокосвертывающую активность (табл. 1), в-четвертых, лучшую солетолерантность и, в-пятых, морфологически более однородные клетки (табл. 1), что положительно отразилось на его технологических качествах (табл. 5).

Полученный штамм Lactobacillus acidophillus K/A^R-08 "Наринэ-Вита" депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером ВКМ В-2211 Д и может использоваться
в качестве основы при разработке антагонистических средств профилактики и лечения кишечных заболеваний, вызванных патогенными и УПМ;
при разработке и совершенствовании номенклатуры и товарных форм бактериальных препаратов-эубиотиков как перорального, так и ректально-вагинального применения;
в производстве кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии, может быть использовано в медицине, биотехнологии, при получении пробиотических бакпрепаратов медицинского назначения и кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания. Штамм выделен из фекалий подростка, принимавшего молоко, сквашенное культурой Lactobacillus acidophilus ИНМИА-9602 (EP 317/402 "Наринэ"), в процессе и после курса антибиотикотерапии путем отбора антибиотикорезистентных изолятов. Штамм активно размножается в питательных средах, принятых в производстве препаратов-эубиотиков. К 12-14 ч культивирования увеличивает биомассу до 8-9 lg микробных клеток в 1 мл. Может развиваться при концентрации хлористого натрия до 6%, устойчив к высушиванию и хранению. Штамм антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и выживает в присутствии ряда антибиотиков. Предельная кислотность сквашивания молока при 37°С в течение 3 суток достигает 140°Т. Штамм обладает более выраженной антагонистической активностью и солетолерантностью, имеет более однородные клетки. 5 табл.

Штамм Lactobacillus acidophilus K/A^R - 08 - ВКМ В-2211D - антибиотикорезистентный и солеустойчивый антагонист возбудителей кишечных инфекций в качестве продуцента пробиотических бакпрепаратов и кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания.