СПОСОБ МЕЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ IN VITRO КОМПЛЕКСНЫМ СОЕДИНЕНИЕМ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/532 A61K35/17 A61K51/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкоиммунологии и радионуклидной диагностике, и может найти применение для мониторинга распределения клеток при проведении клеточной иммунотерапии онкологическим больным. Способ мечения может являться универсальным для различных видов активированных аутологичных и аллогенных клеток (цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров (NK) и дендритных клеток).

За последние десятилетия существенный прогресс достигнут в области иммунотерапии, разработаны многочисленные иммунотерапевтические стратегии, продемонстрировавшие свою безопасность и эффективность в ряде клинических испытаний. Иммунотерапия в настоящее время включает такие направления: создание ингибиторов контрольных точек, естественные антитела и конъюгированные с химиопрепаратами или радиоактивными частицами, противоопухолевые вакцины, а также адоптивную клеточную терапию. Наиболее перспективным направлением является метод использования клеток-эффекторов врожденного иммунитета, в частности NK и Т-лимфоцитов, противоопухолевый потенциал которых усиливают с помощью культивирования in vitro в присутствии цитокинов. Данный метод разработан [1] и успешно внедрен в клиническую практику [2], он показал относительно высокую терапевтическую эффективность в комплексном подходе. Однако на сегодняшний момент нет единого мнения о ключевых составляющих такой терапии, и по-прежнему возникают вопросы: куда, каким образом, и какое количество клеток необходимо вводить пациенту для того, чтобы такая терапия увенчалась объективным успехом. Также не изучались пути миграции активированных лимфоцитов человека при внутрикожном введении.

Известны способы топической диагностики воспалительных заболеваний сердца (RU 2136218 C1, RU 2244515 С1), в основе которых лежит один и тот же принцип внутривенного введения аутолеикоцитов, меченных ^99mTс-гексаметиленпропиленаминоксимом.

Однако в известных способах отсутствует контроль качества эффективности мечения клеток аутологичных лиейкоцитов.

Известен способ выявления очагов воспаления с помощью полиорганной сцинтиграфии (RU 2648877 С1), в основе которого лежит применение аутолейкоцитов, меченых ^99mТс-теоксимом или ^99mТс-церетеком для внутривенного введения пациенту.

Недостатком способа является использование пакетов типа Гемакон, что затрудняет или даже делает невозможным полное отделение клеточной массы от надосадка, содержащего свободный РФП, что может повлиять на достоверность результатов в ходе проведения ОФЭКТ-исследования.

Известен способ оценки функционального состояния селезенки (RU 2152168 С1). Проводят динамическую гамма-сцинтиграфию с меченными ⁹⁹ТС эритроцитами, поврежденными нагреванием. Определяют время наступления максимальной активности γ-излучения в области селезенки (Т_mах), селезеночно-печеночный индекс (СПИ). Секвестрационную функцию селезенки оценивают по кривой активность - время. Количество функционирующей красной пульпы селезенки устанавливают по СПИ. При Т_mах, равном 90±30 мин, и СПИ, равном 94%, секвестрационную функцию красной пульпы оценивают нормальной.

Известен также способ диагностики очаговых поражений селезенки (RU 2190959 С2). Проводят радионуклидное исследование с использованием меченных ^99mТс и поврежденных нагреванием эритроцитов. Используют радиофармпрепарат радиоактивностью 20 mCi. Через 2,5 ч после его введения проводят однофотонную эмиссионную компьютерную томографию и при регистрации дефектов накопления или очагов гиперфиксации радиофармпрепарата на SPECT-срезах определяют очаговые поражения селезенки.

Однако в известных способах является некорректный прием мечения клеток: внутривенное введение транспортного вещества без радионуклида, с последующим забором крови и инкубацией с радионуклидом последней, что может отразиться на достоверности результатов ОФЭКТ-исследования.

Прототипом предлагаемого технического решения является способ метки мононуклеарных клеток красного костного мозга с помощью ^99mТС-эксаметазима (RU 2343933 С1). Клеточную суспензию инкубируют с 4 мл ^99mТс-эксаметазима в течение 10 минут при комнатной температуре, с последующей отмывкой, центрифугированием в течение 5 минут при 150g, после чего собирают надосадок, ресуспензируют его, для получения меченных ^99mТс-эксаметазимом мононуклеарных клеток красного костного мозга, при этом инкубирование проводят с 1500-2000 мБк ^99mТс-эксаметазима, отмывку проводят 10 мл изотонического раствора натрия хлорида, а ресуспензирование в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Недостатком данного способа является использование РФП с большой удельной активностью, что экономически нецелесообразно, поскольку клетки имеют конечную насыщаемость препаратом и увеличение активности никак не влияет на это свойство; также все действия по отмывке и ресуспендированию клеточной массы проводились с использованием физиологического раствора, что негативно сказывается на функциональной активности клеток.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение меченой РФП культуры активированных лимфоцитов с высокими показателями жизнеспособности и эффективности мечения клеток.

Технический результат достигается тем, что также как и в известном способе проводят мечение активированных клеток in vitro.

Особенностью заявляемого способа является то, что инкубирование клеток проводят ^99mТс-теоксимом в объеме 1,5-2 мл, активностью 350-500 МБк, с периодическим встряхиванием клеточной суспензии в течение 20 минут, затем к меченой клеточной субстанции добавляют фосфатно-солевой буфер в объеме 7-10 мл и центрифугируют в течение 6 минут при 2000 оборотов/минуту на центрифуге с бакетным ротором, отбирают надосадок, содержащий свободный ^99mТс-теоксим, полученный клеточный конгломерат ресуспендируют в 1 мл фосфатно-солевого буфера, далее определяют с помощью раствора трипанового синего жизнеспособность меченых лимфоцитов в камере Горяева, оценивают качество мечения путем измерения активности полученной клеточной массы с помощью радиометра и получением сцинтиграммы пробирки с меченой клеточной массой. Причем мечению подвергают аутологичные или аллогенные лимфоциты и дендритные клетки.

Изобретение поясняется подробным описанием, клиническим примером и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - Пробирка с мечеными лимфоцитами: А - осажденные меченые лимфоциты; Б - сцинтиграмма меченой клеточной массы;

Фиг. 2 - Сцинтиграфия тела пациента К.: В - места введения меченого клеточного препарата, Г - лимфоциты из места введения мигрировали в правый подмышечный лимфоузел, Д - аллергическая проба с применением чистого РФП ^99mТс-теоксимом;

Фиг. 3 - ОФЭКТ/КТ исследование путей миграции активированных меченых ^99mТс-теоксимом лимфоцитов пациента К.: Г - меченые активированные лимфоциты мигрировали в правый подмышечный лимфоузел.

Способ осуществляют следующим образом.

В стерильных условиях ламинарного бокса пипеткой собирают из культуральных флаконов необходимое для введения пациенту количество активированных лимфоцитов (5-30*10⁶ клеток/мл), помещают в стерильную пробирку с коническим дном. Активированные лимфоциты осаждают центрифугированием, после чего пипеткой удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в объеме 1 мл.

1. Элюат в объеме 2 мл активностью 350-500 МБк, полученный из генератора технеция ^99mТс, в асептических условиях вносят с помощью шприца во флакон с ТЕОКСИМом, содержимое флакона перемешивают встряхиванием до полного растворения препарата.

2. К клеточной суспензии стерильным шприцем вносят ^99mТс-ТЕОКСИМ. Затем инкубируют лимфоциты (с периодическим встряхиванием) в течение 20 минут.

3. После инкубирования, в пробирку с клеточной массой вносят фосфатно-солевой буфер, доводят общий объем до 10 мл. Затем устанавливают пробирку в центрифугу с бакетным ротором и центрифугируют в течение 5-6 минут при 1500-2000 об/мин., после чего полностью удаляют надосадочную жидкость.

4. Меченый ^99mТс-теоксимом клеточный конгломерат респуспендируют в 1 мл фосфатно-солевого буфера.

5. Определяют с помощью раствора трипанового синего жизнеспособность меченых лимфоцитов в камере Горяева или на автоматическом счетчике клеток.

6. Измеряют активность полученной клеточной массы в радиометре.

7. Получают сцинтиграфическое изображение пробирки с меченой клеточной массой (Фиг. 1).

Клинический пример.

Пациентка К., 1965 пр., диагноз: рак левой молочной железы (T3N0M1), полученное ранее лечение: хирургическое, ПХТ. Поступила в отделение клинической иммунологии МРНЦ. им. А.Ф. Цыба для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии.

Для выделения популяции мононуклеарных клеток использовали периферическую кровь, полученную в результате пункции локтевой вены. Выделенные лимфоциты культивировали в течение 3 дней в среде с добавлением ИЛ-2, ИЛ-15. После завершения процесса культивирования получили активированные лимфоциты в количестве 10 млн. клеток. Затем к полученной клеточной массе добавляли ^99mТс-ТЕОКСИМ объемом 2 мл и активностью 350 МБк, инкубировали в течение 20 мин. После инкубирования, в пробирку с клеточной массой вносили фосфатно-солевой буфер, доводя общий объем до 10 мл, центрифугировали в течение 6 минут при 2000 об/мин в центрифуге с бакетным ротором. Далее полностью удаляли надосадочную жидкость со свободным РФП. Клетки ресуспендировали в 1 мл. фосфатно-солевого буфера. С помощью красителя трипанового синего в камере Горяева определяли жизнеспособность клеток, которая составила 96,4%. Измеряли активность клеточной массы при помощи радиометра РИС-А1 «Дозкалибратора» - 29,0 МБк. Активированные лимфоциты, меченые ^99mТс-теоксимом, вводили пациентке внутрикожно паравертебрально на уровне лопаток, используя инсулиновый шприц.

За 5 дней до введения меченых активированных лимфоцитов пациентке в те же места внутрикожно вводили свободный ^99mТс-ТЕОКСИМ, на сцинтиграммах наблюдали гипернакопление препарата лишь в местах его введения, а также физиологическое накопление (почки, мочевой пузырь, желудок).

Визуализацию путей миграции меченых активированных лимфоцитов проводили сразу после введения и через 4 часа после введения клеток на совмещенной системе ОФЭКТ/КТ Discovery NM/CT 670. Анализ изображений показал, что меченые ^99mТс-теоксимом активированные лимфоциты из места введения мигрировали в правый подмышечный лимфоузел (Фиг. 2 и Фиг. 3).

Использование предложенного способа в клинике позволяет получать меченые ^99mТс-теоксимом активированные лимфоциты и затем изучать их миграцию in vivo посредством ОФЭКТ/КТ при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии. Показатель жизнеспособности меченой культуры при таком способе мечения составляет не менее 95%, а методы инструментальной верификации эффективности мечения (измерение активности собственно меченной клеточной массы и ее сцинтиграфия) указывают на то, что именно клетки захватили ^99mТс-теоксим, и в свободной форме РФП в полученном клеточном препарате на содержится, что важно для исключения ложноположительных результатов ОФЭКТ-исследования. Способ апробирован на пяти пациентах с различными нозологическими формами онкологической патологии. При анализе была отмечена общая для всех клинических случаев закономерность - меченые активированные лимфоциты из мест введения направленно мигрировали в лимфоузлы, часть из которых расположена рядом с областью основной онкологической патологии. Этот факт означает, что достигнута основная цель адоптивной клеточной биотерапии - активация специфического противоопухолевого ответа иммунной системы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу мечения активированных лимфоцитов in vitro комплексным соединением. Способ включает инкубирование активированных лимфоцитов с РФП ^99mTc-ТЕОКСИМ в объеме 2 мл активностью 350-500 МБк, с периодическим встряхиванием в течение в течение 20 минут, после инкубирования, в пробирку с клеточной массой вносят фосфатно-солевой буфер и доводят общий объем до 10 мл, затем пробирку центрифугируют в течение 5-6 минут при 1500-2000 об/мин, после этого надосадочную жидкость полностью удаляют, меченый ^99mTc-теоксимом клеточный конгломерат ресуспендируют в 1 мл фосфатно-солевого буфера. Показатель жизнеспособности меченых активированных лимфоцитов in vitro предложенным способом остается выше 95%. Готовый клеточный препарат можно вводить пациенту внутрикожно паравертебрально на уровне лопаток или в область поясницы и исследовать пути миграции меченых клеток in vivo посредством ОФЭКТ/КТ. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 пр.

1. Способ мечения активированных лимфоцитов in vitro комплексным соединением, включающий мечение активированных клеток in vitro, отличающийся тем, что из культуральных флаконов собирают необходимое для введения пациенту количество активированных лимфоцитов 5-30*10⁶ клеток/мл и помещают в стерильную пробирку, активированные лимфоциты осаждают центрифугированием, после чего надосадочную жидкость удаляют и ресуспендируют клетки в объеме 1 мл, далее элюат в объеме 2 мл активностью 350-500 МБк, полученный из генератора технеция ^99mTc, вносят с помощью шприца во флакон с ТЕОКСИМом и перемешивают встряхиванием до полного растворения препарата, далее к клеточной суспензии вносят ^99mTc-ТЕОКСИМ и затем лимфоциты инкубируют с периодическим встряхиванием в течение 20 минут, после инкубирования, в пробирку с клеточной массой вносят фосфатно-солевой буфер и доводят общий объем до 10 мл, затем пробирку центрифугируют в течение 5-6 минут при 1500-2000 об/мин, после чего надосадочную жидкость полностью удаляют, меченый ^99mTc-теоксимом клеточный конгломерат ресуспендируют в 1 мл фосфатно-солевого буфера и с помощью раствора трипанового синего определяют жизнеспособность меченых лимфоцитов в камере Горяева или на автоматическом счетчике клеток, измеряют активность полученной клеточной массы в радиометре и получают сцинтиграфическое изображение пробирки с меченой клеточной массой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят мечение аутологичных или аллогенных лимфоцитов и дендритных клеток.