СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АФФИННЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ НА ОСНОВЕ ХИМИЧЕСКИ ПРОШИТОГО БЕЛКА А Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/02 G01N33/531 C12Q1/02 C12R1/44 

Изобретение относится к области охраны окружающей среды, медицинской и микробиологической промышленности. Сущность изобретения состоит в приготовлении аффинных поверхностей, предназначенных для специфической иммобилизации биологических объектов, путем нанесения на гидрофобную поверхность слоя стафилококкового белка А, химической внутренней прошивки этого слоя, и нанесения на его поверхность антител, специфичных в отношении определенного лиганда. Свойства комплекса белок А - антитело таковы, что в условиях использования аффинной поверхности (в жидкости, содержащей лиганд) антитела на поверхности слоя белка А ориентированы активными участками в жидкость, что обеспечивает эффективный захват лиганда.

Аффинные поверхности широко используются для высокочувствительного детектирования наличия высокомолекулярных соединений и биологических объектов субмикронных размеров в окружающей среде, при высокоспецифичном выделении различных субстанций из смеси, концентрировании (аффинная хроматография, плазмоферез). В аналитических и медицинских целях используются также частицы с аффинной поверхностью. Несмотря на многообразие методов использования аффинных поверхностей, число молекулярных механизмов, обеспечивающих специфичность, и соответствующих способов организации аффинных поверхностей невелико. Из вариантов молекулярных взаимодействий, обеспечивающих специфичность, наиболее часто используются взаимодействия антиген - антитело. В последнее время широкое распространение получило также использование специфической гибридизации фрагментов ДНК или РНК, но этот молекулярный механизм применим только для обнаружения ДНК или РНК. В то же время взаимодействия антиген - антитело более универсальны. В настоящее время отработаны и широко используются методы препаративного получения специфических антител в отношении широчайшего спектра антигенов.

Число способов получения аффинных поверхностей на основе антител, т.е. закрепления антител или их активных фрагментов на поверхности, также невелико. Наибольшую прочность обеспечивает ковалентное закрепление, но при этом может существенно ограничиваться подвижность активных участков антител, что приводит к существенному падению эффективности захвата лиганда. Данный недостаток в значительной мере преодолевается путем использования гибких молекул-посредников между антителом и подложкой. Кроме того, ковалентное закрепление предполагает проведение химической реакции, которая может негативно сказываться на способности активных участков молекул к специфическому связыванию.

Некоторые дополнительные удобства обеспечивает применение для закрепления антител авидин-биотинового комплекса, один из компонентов которого (обычно - авидин) ковалентно закрепляется на подложке, а другой (биотин) - на антителах. В растворе авидин и биотин самопроизвольно образуют комплекс; в результате «биотинилированное» антитело оказывается закрепленным на покрытой авидином поверхности. При использовании данной схемы появляется возможность не хранить длительное время готовую аффинную поверхность (что сопряжено с риском ее деструкции при хранении), а готовить ее непосредственно перед использованием, так как для формирования авидин-биотинового комплекса не требуются сложные специальные условия и длительное время. К недостатку способа может быть отнесена необходимость биотинилирования антител, которая увеличивает их стоимость и требует проведения специальной процедуры.

Одним из наиболее удобных способов закрепления антител на подложке является закрепление на слое белка А. Природа структуры белка А такова, что он способен связывать Fc - фрагмент любого IgG антитела, что дает возможность готовить аффинные поверхности на основе IgG антител без их специальной обработки.

Характерным примером использования в аналитических целях закрепленного на твердом инертном носителе (стеклянных волокнах) агента, способного к специфическому связыванию (а именно - ковалентно закрепленных антител), является патент [1]. В биохимических тестах также широко распространено использование в качестве носителей антител полимеров, таких как агароза [2, 3]. Примером использования аффинных поверхностей на основе полинуклеотидов может служить патент [4]. В ряде случаев для детектирования антигенов удобно использовать не неподвижные поверхности или носители, являющиеся наполнителями биохимических колонок, а частицы с аффинной поверхностью [5, 6].

Примером использования аффинных поверхностей в медицине, в колонках для очистки крови, может служить патент [7], где такая система используется для борьбы с атеросклерозом, лейкозом, аутоиммунными заболеваниями. Для удаления антител из крови, необходимого для борьбы с некоторыми аутоиммунными заболеваниями, может использоваться белок А, ковалентно закрепленный на кремниевой матрице, помещенной в биохимическую колонку [8, 9]. В процессе использования этих колонок было установлено, что аналогичным терапевтическим эффектом обладают и частицы, смывающиеся с них и попадающие в плазму крови. Впоследствии был разработан способ специального приготовления обладающих терапевтическим эффектом частиц из химически прошитого белка А [10]. Известен также способ иммобилизации белка А, в одном из вариантов адсорбированного на частицах активированного угля, помещенных в коллодиевую мембрану, а в другом - ковалентно закрепленного на частицах нейлона, полистирола, метакрилата [11]. Данная система также используется для очистки плазмы крови.

Сущность изобретения состоит в разработке простого и эффективного метода приготовления устойчивых аффинных поверхностей - подложек на основе белка А, на которые затем адсорбируются антитела. Для достижения поставленной цели на первом этапе на поверхности гидрофобной подложки формировался слой белка А. Белок А является мембранным белком Staphilococcus aureus. Молекула белка А имеет гидрофобные участки, которые в обычных условиях существования микроорганизма погружены в его мембрану, и гидрофильные участки, ориентированные в окружающую среду, способные к связыванию Fc-фрагмента антител, что составляет основу природной биологической защиты Staphilococcus aureus.

В искусственных условиях из раствора выделенного белка А на гидрофобной поверхности при определенных условиях формируется слой, в котором гидрофобные участки прилегают к подложке, а гидрофильные, как и в случае с микроорганизмом, обращены в раствор и способны эффективно связывать помещенные в раствор антитела. При этом активные группы антител также оказываются ориентированными в раствор, т.е. оптимальным для захвата антигенов образом. Этим объясняется тот факт, что на поверхностях с высокой гидрофобностью, например таких, как уголь [11], удается формировать эффективный аффинный слой из белка А и антител. Ковалентное закрепление слоя белка А на подложке не всегда позволяет добиться правильной ориентации молекул в слое, что отрицательно сказывается на эффективности последующего связывания антител.

Недостатком адсорбированного слоя белка А является его низкая прочность. Для преодоления этого недостатка без потери правильной ориентации молекул белка в слое нами предлагается после адсорбции слоя на подложке произвести его внутреннюю химическую прошивку при помощи сшивающего агента, без химической пришивки к подложке. Затем на подготовленный таким образом слой адсорбируются антитела; полученная аффинная поверхность используется для проведения иммунологических анализов и может использоваться и в других перечисленных выше областях.

От методов, использующих адсорбированный на подложке белок А, предлагаемый способ отличается наличием процедуры химической прошивки слоя белка. От способов, использующих ковалентное связывание белка с носителем, в том числе используемого в патенте [11] - тем, что белок сшивается не с носителем, а используется внутренняя прошивка белка А. В способе, изложенном в [10], внутренняя химическая прошивка белка А применяется, но белок при этом используется в виде суспензии изолированных частиц, а не закреплен на плоской поверхности - носителе. В предлагаемом нами способе гидрофобный носитель не только составляет основу аффинной поверхности, но и обеспечивает правильную ориентацию молекул белка А, наиболее эффективную для иммобилизации антител.

Несмотря на отсутствие ковалентных связей с подложкой, пленка прошитого белка А весьма прочно держится на ней, так как при попытке отрыва силы межмолекулярного сцепления Ван-дер-Ваальса действуют кооперативно. При необходимости пленка все-таки может быть отделена от подложки. При этом она сохраняет в отличие от случая с ковалентным закреплением на подложке свою целостность и может быть подвергнута дополнительным исследованиям (например, при помощи метода просвечивающей электронной микроскопии).

Способ разрабатывался в первую очередь для использования в исследованиях биологических объектов, закрепленных на аффинной поверхности, при помощи метода атомно-силовой микроскопии (АСМ). На фиг.1 показано полученное при помощи этого метода изображение слоя стафилококкового белка А, прошитого глутаровым альдегидом, на атомарно-гладкой поверхности графита. Размеры даны в микронах. Поверхность слоя ровная и однородная, что гарантирует низкий уровень помех при проведении исследований. На фиг.2 показано полученное при помощи сканирующего электронного микроскопа изображение пленки белка А, отделенной от подложки. Обращает на себя внимание то, что отделенная пленка сохраняет свою целостность и при необходимости может быть исследована и другими методами. На фиг.3 показаны бактерии E.coli, закрепленные на приготовленной при помощи предлагаемого способа аффинной поверхности, несущей специфичные в отношении данных бактерий антитела.

Техническим результатом разработки данного способа является создание аффинных поверхностей, используемых для детектирования событий специфической сорбции при помощи современных методов микроскопии, а также позволяющих применять с этой целью и другие физические методы детектирования, в основе которых лежат поверхностные эффекты. Универсализация приготовления поверхностей позволяет исследовать один и тот же объект различными методами детектирования.

Пример 1

1. Белок А (лиофилизированный, полученный из Staphylococcus aureus) растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл.

2. Раствор наносят на свежеобновленную поверхность пластинки графита в количестве 3 мкл. Затем образец подсушивают на воздухе (под тягой) при комнатной температуре до полного высыхания в течение 2-4 часов.

3. На пятно белка наносят 1% раствора глутарового альдегида в дистиллированной воде, объемом 3 мкл; образец выдерживают во влажной атмосфере (в чашке Петри вместе с листком фильтровальной бумаги, смоченным водой) в течение 2 часов.

4. Пластинку промывают путем помещения на поверхность воды активным слоем вниз на 5 минут.

5. После удаления остатков воды, но без дополнительного подсушивания, на поверхность пятна наносят 0,3 М буферный раствор Трис-HCl, рН=8,8 на 1 час.

6. После промывки аналогично п.4 на пятно наносят 3 мкл раствора антител (поликлональные антитела кроличьей сыворотки против Esherichia coli шт. К-12) на 30 минут, затем опять проводят промывку.

7. На пятно наносят 3 мкл основного иммобилизуемого объекта (препарат Esherichia coli шт. К-12, концентрация 10⁸ кл/мл) на 30 минут. После промывки образец высушивают под тягой в течение 2 часов и передают для исследований. Изображение, полученное при помощи атомно-силового микроскопа (Digital Instruments, 3А) представлено на фиг.3. Наблюдается связывание бактерий Esherichia coli шт. К-12 с поверхностью графита, покрытого слоем белка А и антителами, специфичными в отношении этих бактерий.

Пример 2

1. Белок А (лиофилизированный, полученный из Staphylococcus aureus) растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл.

2. Раствор наносят на свежеобновленную поверхность пластинки графита в количестве 3 мкл. Затем образец подсушивают на воздухе (под тягой) при комнатной температуре до полного высыхания в течение 2-4 часов.

3. На пятно белка наносят 1% раствора глутарового альдегида в дистиллированной воде, объемом 3 мкл; образец выдерживают во влажной атмосфере (в чашке Петри вместе с листком фильтровальной бумаги, смоченным водой) в течение 2 часов.

4. Пластинку промывают путем помещения на поверхность воды активным слоем вниз на 5 минут.

5. После удаления остатков воды, но без дополнительного подсушивания на поверхность пятна наносят 0,5 М раствор глицина, рН=8,5 на 1 час.

6. После промывки на пятно наносят 3 мкл раствора антител (моноклональные антитела, специфичные в отношении спор вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ, концентрация 0,1 мг/мл) на 30 минут, затем опять проводят промывку.

7. На пятно наносят 3 мкл основного иммобилизуемого объекта (препарат спор СТИ, концентрация 10⁹ спор/мл) на 30 минут; после промывки образец высушивается под тягой в течение 2 часов и передается для исследований. Наблюдается связывание спор СТИ с аффинной поверхностью в количестве более 100 шт. на площади 10×10 мкм.

Пример 3

1. Белок А (лиофилизированный, полученный из Staphylococcus aureus) растворяют в дистиллированной воде до концентрации 1 мг/мл.

2. Раствор наносят на свежеобновленную поверхность пластинки графита в количестве 3 мкл. Затем образец подсушивают на воздухе (под тягой) при комнатной температуре до полного высыхания в течение 2-4 часов.

3. На пятно белка наносят 0,1% раствор диметилсуберимидата, рН=8,0 объемом 3 мкл. Образец выдерживают во влажной атмосфере в течение 2 часов.

4. Пластинку промывают путем помещения на поверхность воды активным слоем вниз на 5 минут.

5. После удаления остатков воды, но без дополнительного подсушивания на поверхность пятна наносят 0,05% раствор моноэтаноламина, рН=8,1 на 1 час.

6. После промывки на пятно наносят 3 мкл раствора антител (моноклональные антитела против бактерий Legionella macdedi, концентрация 0,2 мг/мл) на 30 минут, затем опять промывают.

7. Наносят 3 мкл основного иммобилизуемого объекта (препарат бактерий Legionella macdedi, концентрация 5·10⁷ кл/мл) на 30 минут; после промывки образец высушивается под тягой в течение 2 часов и передают для исследований. Наблюдается связывание бактерий Legionella macdedi с поверхностью, несущей антитела, специфичные в отношении данных бактерий, в количестве более 30 бактерий на площади 25×25 мкм.

Список используемой литературы

1. Патент США 5861319.

2. Патент США 6379908.

3. Патент США 6376204.

4. Патент США 6221581.

5. Патент США 5898005.

6. Патент США 6121056.

7. Патент США 5753227.

8. Патент США 4614513.

9. Патент США 4681870.

10. Патент США 6447777.

11. Патент США 5091091.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для иммунологических исследований биологических объектов. Предложенное изобретение характеризует способ получения аффинных поверхностей на основе химически прошитого стафилококкового белка А. Способ предусматривает нанесение слоя стафилококкового белка А на гидрофобную поверхность с последующей химической прошивкой белка А. Кроме того, способ предусматривает дополнительное нанесение специфических антител на подготовленную аффинную поверхность слоя химически прошитого стафилококкового белка А. Данный способ позволяет получить аффинную поверхность, обладающую повышенной прочностью, которая однако при необходимости может быть отделена от подложки с сохранением своей целостности. Кроме того, ровная и однородная поверхность слоя прошитого стафилококкового белка А обеспечивает низкий уровень помех при проведении исследований различными методами микроскопии. Изобретение может найти применение в исследовании биологических объектов различными методами, в том числе при помощи метода атомно-силовой микроскопии (АСМ). 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения аффинных поверхностей, предусматривающий нанесение слоя белка А на гидрофобную поверхность и последующую химическую прошивку белка А.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно наносят антитела на прошитый белок А.