СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ИНФЕКЦИИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/42 G01N33/543 G01N33/569 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям биомедицины, биоскрининга и разработки способов диагностики на основе искусственных репортерных биомолекул, касается нового способа высокочувствительной детекции каталитически активного белка летального фактора сибирской язвы LF; способа амплификации сигнала, образуемого при расщеплении субстрата низкоэффективным протеолитическим ферментом.

Основной областью применения технологии высокочувствительного способа определения активного белка LF являются биологические исследования, биомедицина и разработка лекарств. Определение активности LF в окружающей среде и биологических жидкостях может иметь важное значение как для борьбы с локальными вспышками заболевания, так и для быстрой нейтрализации последствий возможных биотеррористических актов с использованием бактерий или спор бактерий сибирской язвы. Возможность специфической детекции микроколичеств LF критически важна для ранней диагностики сибиреязвенной инфекции и для ранней детекции присутствия вирулентных бактерий в окружающей среде. Метод детекции сибирской язвы, основанный на определении активности LF, позволит избежать ложноположительных сигналов от различных высокотехнологичных муляжей патогена, таких как убитые бактерии или препараты ДНК сибиреязвенных бацилл.

Сибирская язва - инфекционное заболевание, вызываемое токсигенными штаммами граммположительной бактерии Bacillus anthracis. Вирулентность бактерии определяется капсулой, состоящей из поли-D-глютаминовой кислоты, и экзотоксином, включающим в себя три компонента - летальный фактор (LF), протективный антиген (РА) и фактор отечности (EF). По отдельности эти белки не обладают токсическим эффектом, но комбинации LF+PA (летальный токсин) и EF+PA (токсин отечности) приводят к различным патологическим последствиям как у млекопитающих и человека, так и в культуре клеток. Функционально LF сибирской язвы представляет собой Zn²⁺-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства митоген-активируемых протеинкиназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов. Проводились исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры. Было продемонстрировано, что летальный фактор сибирской язвы (LF), наряду с протективным антигеном (РА), представляет собой важнейший компонент летального токсина сибирской язвы и является основным фактором, определяющим летальный исход при сибиреязвенной инфекции (Young JA, Collier RJ (2007) Annu Rev Biochem, 76, 243-265).

Известны способы определения сибиреязвенной инфекции, основанные на детекции LF или других компонентов сибиреязвенного токсина с использованием стандартных методов иммуноферментного анализа (ИФА) (www.anaspec.com, Anthrax Detection Set, каталожный номер 54312; Бондарев В.П. с соавт.(2007) Разработка иммуноферментной моноклональной тест-системы для обнаружения протективного антигена Bacillus anthracis. Пробл. особо-опасных инфекций, 93, с.66-69). Известен способ определения наличия LF методом ИФА на основе лантанидной детекции (Tang S, Moayeri M, Chen Z, Harma H, Zhao J, Hu H, Purcell RH, Leppla SH, Hewlett IK. (2009) Clin Vaccine Immunol, 16, 408-413). Иммуноферментные способы детекции сибиреязвенных антигенов могут рассматриваться как важный компонент комплексной диагностики, но принципы ИФА не позволяют определить наличие протеолитической активности LF - главной патогенной детерминанты сибирской язвы или изолированного сибиреязвенного токсина. ИФА не дает возможность дифференцировать возбудитель сибирской язвы от молекулярных муляжей патогена (например, рекомбинантных фрагментов LF или убитых бацилл сибирской язвы), которые могут быть применены в биотеррористических актах. Кроме того, для методов ИФА характерен высокий фоновый сигнал, нивелировать который в случае анализа полевых образцов, содержащих значительное количество разнородных примесей, не представляется возможным.

Известны способы детекции активности LF, основанные на стандартных методах определения протеолитической активности с применением хромогенных и флюорогенных пептидных субстратов (Merck, каталожные номера 176902, 176904, 176903). Чувствительность флюоресцентных субстратов LF выше, чем колориметрических (детектируют до 5-10 пМ LF), но она не достаточна для обнаружения инфекции на достаточно ранних стадиях заражения сибирской язвой, что ограничивает возможности проведения своевременной терапии.

Известны способы определения активности LF методом белкового или пептидного FRET (резонансного переноса энергии Форстера), но эти методы имеют достаточно низкую чувствительность, что объясняется длиной пептидного субстрата LF, превышающей эффективную область радиуса Форстера для большинства красителей и ограничивающей тем самым эффективность FRET. Невысокая каталитическая эффективность расщепления известных субстратов LF в еще большей степени снижает общую чувствительность прямого определения активности LF методом FRET (Cummings RT, Salowe SP, Cunningham BR, Wiltsie J, Park YW, Sonatore LM, Wisniewski D, Douglas CM, Hermes JD, Scolnick EM. (2002) Proc Natl Acad Sci USA, 99, 6603-6603).

Известен наиболее близкий к заявленному способ детекции активного LF, базирующийся на амплификации сигнала, предложенный компанией Quickzyme (http://www.tno.co.jp/Pharma/Protease_111a.pdf). Этот метод использует сопряженно-амплифицирующую систему детекции на основе активации урокиназы и обеспечивает в 1000 раз большую чувствительность, чем детекция летального фактора при помощи FRET с применением флюорогенных пептидных субстратов. Недостатком этого метода является необходимость дорогостоящей продукции белковых компонентов системы в эукариотических клетках, а также относительно невысокая скорость работы этой протеазы, снижающая общую чувствительность метода. При применении этой системы не исключены и ложноположительные сигналы, поскольку урокиназа не полностью ингибирована в нерасщепленном состоянии и может активироваться неспецифически или при хранении. Длина и аминокислотный состав пептида, встраиваемого в N-концевую область урокиназы, весьма ограничены; пептиды с увеличенной длиной или повышенной гидрофобностью, а также со значительным положительным зарядом (что характерно для высокоэффективных субстратов LF), могут нарушить фолдинг и активацию урокиназы и ее зимогена.

Изобретение решает задачу разработки высокочувствительного способа определения присутствия каталитически активного летального фактора сибирской язвы в биологических жидкостях, полученных от инфицированных людей или животных, а также из окружающей среды, содержащей вегетативные формы возбудителя сибирской язвы.

Поскольку каталитическая активность LF по отношению к пептидным субстратам, выделенным из его природных мишеней, весьма невысока, для достижения высокой чувствительности метода в изобретении используется новый подход амплификации сигнала, свидетельствующего об акте протеолиза.

Поставленная задача решается за счет способа детекции активности летального фактора с помощью слитого белка-субстрата летального фактора сибирской язвы, содержащего в своем составе щелочную фосфатазу в Escherichia coli, обработку очищенного продукта белка-субстрата биотин-лигазой в присутствии свободного биотина и АТФ, иммобилизацию биотинилированнного по лизину-19 слитого белка щелочной фосфатазы, обработку данного иммобилизованного белка препаратом, содержащим LF, отбор перешедшего в раствор слитого белка щелочной фосфатазы и детекцию активности щелочной фосфатазы с использованием флюоресцентного или хемилюминесцентного метода.

В качестве субстрата для детекции протеолитической активности летального фактора может быть использован биотинилированный рекомбинантный слитый белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы Escherichia coli, имеющего в своем составе пептид RRKKVYPYPME, являющийся чувствительным субстратом летального фактора сибирской язвы.

Также задача решается применением нового принципа амплификации сигнала, происходящего от акта разрезания субстрата протеазой, за счет каталитической активности репортерного фермента щелочной фосфатазы.

Кроме того, задача решается за счет моноклональных антител, специфичных к N-концевому домену летального фактора, ответственному за связывание с протективным антигеном и не препятствующему каталитической активности LF.

Также задача решается за счет применения твердофазного формата анализа, который позволяет быстро и эффективно проводить тестирование большого количества образцов.

А также задача решается за счет эффективного определения ферментативной активности белка щелочной фосфатазы, находящегося в составе субстрата LF, с использованием высокочувствительных флюоресцентных или хемилюминесцентных субстратов.

Техническим результатом изобретения является создание эффективного и высокочувствительного способа определения сибиреязвенной инфекции на основе детекции каталитической активности летального фактора сибирской язвы, применимого для нужд клинической диагностики и широкоформатного скрининга химических библиотек. С использованием разработанного метода можно детектировать летальный фактор сибирской язвы в концентрации до 1 пМ.

В предлагаемом техническом решении в качестве субстрата LF применяют биотинилированный рекомбинантный слитый белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы Escherichia coli, объединяющий в составе одной полипептидной цепи лидерный пептид щелочной фосфатазы Escherichia coli, 6 первых аминокислотных остатков зрелой щелочной фосфатазы, пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED, содержащий сайт для специфического биотинилирования остатка лизина-13 в составе этого пептида ферментом биотин-лигаза из Escherichia coli, спейсерный пептид, высокоэффективный субстратный пептид для LF RRKKVYPYPME и домен, содержащий активный центр фосфатазы, модифицированный внесением мутаций D153G и D330N, повышающих каталитическую эффективность фосфатазы более чем в 30 раз (Muller BH, Lamoure С, Le Du MH, Cattolico L, Lajeunesse E, Lemaître F, Pearson A, Ducancel F, Ménez A, Boulain J-C. (2001) ChemBioChem, 2, 517-523).

Щелочная фосфатаза E.coli (АР), примененная в данной системе детекции в качестве репортерного фермента, является белком с молекулярной массой 94 кДа, секретируемым в периплазматическое пространство бактерии и содержащим дисульфидные связи. Показано, что N-концевая область АР в районе 20-30-го аминокислотного остатка не является существенной для каталитической активности и может быть разделена на различные домены путем внесения в эту область пептидного или белкового линкера длиной от 1 до 300-400 аминокислотных остатков (Clin Chem, (1994) 40, 688-704), таким образом, оказывается возможным внесение в эту зону различных функционально-активных элементов. Помимо высокой каталитической эффективности щелочная фосфатаза обладает сравнительной температурной и рН-стабильностью, а также устойчивостью к неспецифическому протеолизу, что обусловливает перспективность его использования в качестве репортерного фермента для повышения чувствительности метода. Принципиальным преимуществом использования щелочной фосфатазы в качестве репортера является также наличие коммерчески доступных высокочувствительных специфических колориметрических или флюоресцентных субстратов для щелочной фосфатазы, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP), флюоресцеин-дифосфат, 9Н-(1,3дихлоро-9,9-диметилакридин-2-один-7-ил) фосфат (DDAO фосфата), 6,8-дифлюоро-4-метил умбеллиферилфосфат (DiFMUP), 4-метилумбеллиферил фосфата (MUP) и их производных (http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp02999.pdf).

Важным условием успешного технического решения поставленной задачи определения минимальных количеств летального фактора в биологических образцах является использование антител, специфичных к N-концевому домену летального фактора, ответственному за связывание с протективным антигеном и не препятствующему каталитической активности LF (Белова Е.В., Колесников А.В., Захарова М.Ю., Дубилей С.А., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. (2007) Биоорг. химия, (2008) 34, 639-644). Применение этих антител позволяет сконцентрировать LF преципитацией из культуральных или биологических жидкостей без потери каталитической активности.

Существенным достоинством предлагаемого метода является твердофазный формат проведения тестов, который допускает проведение автоматизации этого способа детекции активности LF. Связывание субстрата происходит за счет взаимодействия биотина субстрата LF и белков авидинового ряда, иммобилизованных на твердой фазе. В стандартном случае в качестве матрицы используют иммунологические планшеты, покрытые авидином или его производными. Кроме микропланшет и микрострипов, предпочтительными матрицами для иммобилизации LF являются нагруженные нейтравидином, или стрептавидином, или авидином, или иными биотин-связывающими субстанциями 1) парамагнитные микросферы или микрочастицы; 2) немагнитные пористые и непористые полимерные микросферы и микрочастицы; микрочастицы, образуемые коллоидным золотом; 3) квантовые точки; 4) пористые и непористые полимерные поверхности; 5) рабочие поверхности биосенсоров. В силу возможности автоматизации, разработанный метод оказывается применимым для нужд широкоформатного скрининга библиотек потенциальных химических ингибиторов активности летального фактора сибирской язвы, что имеет важное значение для разработки новых терапевтических агентов против сибиреязвенной инфекции.

К преимуществам заявленного способа определения сибиреязвенной инфекции относятся: 1) высокая чувствительность метода и его гомологичность в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу, применяемому в клинической практике; 2) устойчивость к ложноположительным сигналам и к возможным молекулярным муляжам патогена, что позволяет сэкономить огромные средства в случае необходимости принятия/непринятия решения о возможной атаке бактериологическим оружием или эпидемии и связанным с этим запуском комплекса дорогостоящих мер; 3) возможность широкого использования существующих и разработанных в будущем субстратов LF без существенных ограничений по длине пептидной цепи и аминокислотному составу; 4) дешевизна используемых рекомбинантных белков, которые продуцируются на основе стандартных экспрессионных систем Escherichia coli, а не дорогостоящих эукариотических систем; 5) высокая специфичность детекции LF и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению с методами высокочувствительной ИФА.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Биотинилированный рекомбинантный слитный белок на основе модифицированной щелочной фосфатазы иммобилизуют на микропланшетах или микрострипах для ИФА, покрытых авидином или его производными.

Летальный фактор выделяют из диагностируемых образцов иммунопреципитацией с моноклональным антителом к LF (Ig) с последующей сорбцией комплексов LF-Ig стафилококковым белком G, либо стрептококковым белком А, иммобилизованными на магнитных частицах или на сорбенте либо находящимися в виде комплексов с клеточными стенками стафилококков (Pansorbin^ТМ). Комплекс LF-Ig-иммобилизованный белок (А или G) отмывают от примесей, а затем разрушают добавлением мягкого хаотропного агента, не влияющего на каталитическую активность LF.

К иммобилизованному на микропланшетах или микрострипах слитному белку, содержащему субстрат LF и щелочную фосфатазу, добавляют выделенный из образца LF и инкубируют 2 часа при 37°С. По окончании инкубации жидкую и твердую фазы разделяют. К полученной жидкой фазе добавляют колориметрический, флюорогенный или хемилюминесцентный субстрат для щелочной фосфатазы. Присутствие и концентрацию каталитически активного LF определяют по наличию сигнала от щелочной фосфатазы, элюированной в раствор после отрезания биотинилированного компонента LF в сравнении с калибровочной кривой, построенной для различных концентраций LF с использованием этого метода. Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на чертеже.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Чертеж-схема определения присутствия летального фактора сибирской язвы в растворе на основе амплификационной детекции протеолитической активности летального фактора.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1

Подготовка образцов крови мышей, инфицированных Bacillus anthracis, и иммунопреципитация летального фактора из плазмы крови мышей

У мышей линии BALB/c, инфицированных микробными клетками Bacillus anthracis вакцинного штамма сибирской язвы СТИ-1, начиная с 4 часов от момента внесения инфекции до момента гибели с интервалом в 3 часа, забирают кровь по 100 мкл из хвостовой вены. Образцы крови при заборе смешивают с 10 мкл 20 мМ гепарин сульфата для предотвращения свертывания крови. Клетки крови отделяют центрифугированием при 2000 об/мин, плазму крови разводят в 4 раза буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ NaCl и 1 мМ PMSF. Образцы плазмы смешивают с иммобилизованными на сефарозе моноклональными антителами, специфичными к специфичных к N-концевому домену летального фактора, ответственному за связывание с протективным антигеном и не препятствующему каталитической активности LF. Сорбент с антителами добавляют из расчета 100 мкл на 0.2 мл плазмы крови, емкость сорбента составляет 500 мкг LF на 1 мл смолы. Сорбент троекратно промывают буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ NaCl. Элюцию летального фактора проводят с буфером Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Pierce). Элюат с сорбента, содержащий LF, сразу используют для определения активности летального фактора либо замораживают для хранения при -70°С.

Пример 2

Иммобилизация на планшетах слитого репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы

Нейтравидин иммобилизуют на 96-луночных планшетах для иммуноферментного анализа (NUNC). Для этого на планшеты наносят раствор 0.1 М карбоната натрия рН 9, содержащий 50 мкг/мл нейтравидина (Pierce) из расчета 5 мкг нейтравидина на лунку планшета. Инкубируют планшет при 37°С 2 часа со встряхиванием. Удаляют из лунок раствор нейтравидина. Блокируют свободные валентности поверхности планшета раствором 1% бычьего сывороточного альбумина в 50 мМ трис-HCl рН 7.5, 50 мМ NaCl при 37°С при встряхивании в течение 1 часа. По окончании инкубации планшет трижды промывают раствором 50 мМ трис-HCl рН 7.5, 50 мМ NaCl и добавляют раствор биотинилированного репортерного субстрата LF на основе щелочной фосфатазы из расчета 5 мкг субстратного белка на лунку планшета и инкубируют при 37°С в течение 30 минут для связывания субстрата с нейтравидином. По окончании инкубации лунки планшета трижды промывают по 5 минут со встряхиванием буфером для LF для удаления несвязавшегося субстрата.

Пример 3

Определение летального фактора в растворе

На планшет с иммобилизованным на нейтравидине слитным репортерным субстратом LF на основе щелочной фосфатазы наносят различные разведения (1:2, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000) преципитированного при помощи моноклональных антител из плазмы крови мышей, инфицированных Bacillus anthracis, белка LF в 100 мкл буфера для LF, содержащего 50 мМ HEPES рН 7, 20 микромоль ZnCl₂ и EDTA-free ингибитор протеаз (Roche), и инкубируют планшет в течение 2 часов при температуре 37°С. В контрольные лунки LF не добавляют. Для построения калибровочной кривой в отдельные лунки наносят активный белок LF (получение активного фермента летального фактора -патент РФ №2355769), раститрованный в известных концентрациях от 1 до 1500 пМ. По окончании инкубации из лунок переносят супернатант в новый планшет и добавляют флюоресцентный субстрат щелочной фосфатазы флюоресцеин дифосфат. Измерения проводят на флюорометре (Тесаn, Genios) при соотношении длин волн экстинкции/эмиссии 470/540. Минимальное значение флюоресценции, заведомо превышающее контрольное, соответствует минимальной детектируемой с применением данного метода концентрации фермента летального фактора и наблюдается при концентрации 1 пМ. Содержание LF в плазме крови инфицированных мышей рассчитывается на основе построенной калибровочной кривой. Концентрация LF в плазме крови инфицированных мышей нарастает по мере развития инфекции от 4 часов (начала забора образцов крови) до 48 часов (момента гибели животного), составляя в момент первого забора крови 1 пМ, а в момент гибели животного 3 нМ.

Способ детекции сибиреязвенного патогена в окружающей среде и биологических жидкостях основан на функциональной детекции активности одного из компонентов сибиреязвенного токсина, слабой протеазы летального фактора сибирской язвы (LF). Примененный принцип высокочувствительной детекции протеолитической активности LF базируется на системе амплификации сигнала, происходящего от акта разрезания субстрата, при помощи находящегося в составе субстрата вспомогательного фермента щелочной фосфатазы Escherichia coli (АР). В составе рекомбинантного субстрата LF помимо щелочной фосфатазы и специфической для LF субстратной последовательности RRKKVYPYPME находятся пептид, биотинилирующийся in vivo и in vitro при помощи биотин-лигазы E.coli и обеспечивающий иммобилизацию субстрата на твердой фазе (поверхности плашек) за счет взаимодействия с авидином и его производными, и последовательности шести гистидинов для очистки рекомбинантного субстрата из периплазмы E.coli при помощи металл-хелатной смолы. Способ по изобретению обладает высокой чувствительностью, с использованием флюоресцеин дифосфата позволяет детектировать до 1 пМ летального фактора, быстротой в исполнении, высокой специфичностью, низким риском ложноположительных сигналов. 1 ил.

Способ определения присутствия в среде и биологических жидкостях сибиреязвенного патогена, включающий иммобилизацию на микропланшетах или микрострипах для иммуноферментного анализа, покрытых авидином или его производными, биотинилированного рекомбинантного слитого белка на основе модифицированной щелочной фосфатазы Escherichia coli, имеющего в своем составе биотинилирующийся пептид NPGGLNDIFEAQKIEWHED, а также пептид RRKKVYPYPME, являющийся чувствительным субстратом летального фактора сибирской язвы и расположенный между биотинилирующимся пептидом и каталитическим доменом щелочной фосфатазы, выделение летального фактора из диагностируемых образцов иммунопреципитацией с моноклональным антителом к летальному фактору, сорбцию комплексов летальный фактор-антитело стафилококковым белком G либо стрептококковым белком А, иммобилизованным на магнитных частицах или на сорбенте, либо находящимся в виде комплексов с клеточными стенками стафилококков, добавление выделенного летального фактора к иммобилизованному слитому белку, инкубирование в течение 2 ч при 37°С, разделение жидкой и твердой фазы, добавление к жидкой фазе колориметрического, флюорогенного или хемилюминесцентного субстрата для щелочной фосфатазы и определение каталитически активного летального фактора по наличию сигнала от щелочной фосфатазы, элюированной в раствор после отрезания биотинилированного компонента летального фактора, в сравнении с калибровочной кривой, построенной для различных концентраций летального фактора сибирской язвы.