УСТРОЙСТВО, СОДЕРЖАЩЕЕ ШАРИКИ, ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ IN VITRO И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/538 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение находится в области иммунодиагностики. В частности, настоящее изобретение относится к устройству диагностики in vitro для выявления и/или идентификации антигена, и/или антитела из образца биологической жидкости, в частности, из образца крови или образца компонентов крови. Данное изобретение также относится к разным применениям данного устройства, таким как выявление и/или идентификация антигенов эритроцитов или антител к эритроцитам, антигенов тромбоцитов или антител к тромбоцитам, вирусных антигенов или антивирусных антител, бактериальных антигенов или антибактериальных антител, паразитарных антигенов или антипаразитарных антител. Способы in vitro с использованием устройства по изобретению также являются частью настоящего изобретения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунодиагностические анализы представляют собой способы, которые доступны в нескольких форматах анализа и пригодны для выявления антител, антигенов или комбинаций и тех, и других. Обычно данные анализы для выявления основываются на применении иммобилизованных антигенов, которые захватывают любое присутствующее специфичное антитело в анализируемом образце, тогда как анализы, используемые для выявления антигенов, состоят из иммобилизованных антител, которые обеспечивают захват специфического антигена, который присутствует в образце.

Данные анализы широко используются, например, в иммуногематологии для выявления инфекционных патогенов и т.д., особенно для обеспечения безопасности переливания крови.

Переливание крови состоит во внутривенной инъекции концентрированных препаратов эритроцитов (глобулярные концентраты), полученных из донорской крови. Существуют два главных риска при переливании крови.

Главным риском является возможность объединения в организме реципиента (человека, получающего переливание) антитела и его эритроцитарного антигена. Последствия такой иммунологической реакции могут варьировать от неэффективного переливания без клинических признаков до небольшой клинической реакции (тревожность, озноб), серьезной клинической реакции (шок, гемоглобинурия, почечная недостаточность) или драматической клинической реакции (шок, диссеменированный внутрисосудистый гемолиз), приводящей к смерти.

Переливание крови является возможным источником передачи заболевания. Огромное количество агентов может потенциально передаваться посредством переливаний крови, включая бактерии, вирусы и паразитов. Из них чаще всего передаются бактерии, и они включают виды рода Treponema, Yersinia, Proteus, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Acinetobacter и Serratia, тогда как среди грамположительных организмов были выделены пропионобактерия, стафилококк, бацилла, клостридий и энтерококк. Вирусные агенты, которые способны передаваться через переливание крови, включают вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы гепатита, вирус Западного Нила (WNV), цитомегаловирус (CMV), человеческие Т-клеточные лимфотрофные вирусы (HTLV) и парвовирус В19. Другим примером являются простейшие организмы, которые включают виды рода Plasmodium, которые вызывают малярию, и которые могут передаваться через переливание.

Для обеспечения безопасности переливания крови, с одной стороны, требуется, чтобы донорские эритроциты являлись совместимыми с кровью реципиента, если у реципиента нет циркулирующих антител, направленных против эритроцитарных антигенов донора, и, с другой стороны, чтобы донорские эритроциты не содержали передающихся через переливание инфекционных агентов.

Для обеспечения совместимости между донорскими эритроцитами и реципиентами в настоящее время используют анализы для определения групп крови и присутствия антител к эритроцитам в плазме/сыворотке.

Целью иммуногематологической диагностики является определение и/или идентификация иммунной реакции между антигеном эритроцитов и антителом, специфично направленным против такого антигена. Для этого необходимо иметь средства для определения антигенов, присутствующих на поверхности эритроцитов. Их присутствие или их отсутствие определяет группу крови. Также возможна идентификация того, содержит ли кровь реципиента одно или более чем одно антитело, направленное против известных антигенов эритроцитов донора, причем присутствие антитела означает возможность несовместимости.

Среди всех антигенных вариантов антигена эритроцитарной мембраны, составляющих группы крови, к настоящему времени у человека идентифицировали свыше тридцати антигенных систем эритроцитов: систему АВО с А (ABO1), В (ABO2), АВ (АВ03) и А1 (АВ04), систему Rh с антигенами D (RH1), E (RH3) или е (RH5) и С (RH2) или с (RH4), систему Kell (K или KEL1, к или KEL2, …), систему Duffy (Fya или FY1, Fyb или FY2, …), систему Kidd (Jka или JK1, Jkb или JK2, …), систему MNS (MNS1, MNS2, MNS3, MNS4 …) или другие системы, реже исследуемые на практике, которые также существуют, такие как Lutheran, Lewis и т.д. Индивиды с одинаковой комбинацией эритроцитарных антигенов принадлежат к той же самой эритроцитарной группе крови. Группы крови становятся даже более сложными и многочисленными при использовании нескольких антигенных систем.

Традиционные методики заключаются в поиске и идентификации присутствия или отсутствия эритроцитарных антигенов на поверхности данных клеток и/или поиске и идентификации присутствия или отсутствия антител к эритроцитам группы крови в плазме или в сыворотке.

Например, для системы АВО в анализе Beth-Vincent определяются антигены, которые несут эритроциты, и в дополнительном анализе Simonin-Michon или обратном распределении крови по группам определяются антитела, циркулирующие в сыворотке или в плазме.

В анализе Beth-Vincent эритроциты индивида объединяются с реактивами антител известной специфичности. В общем, данный анализ делается видимым посредством наблюдения агглютинации эритроцитов при распознавании реактивами антител соответствующих антигенов эритроцитов.

В анализе Simonin-Michon плазма или сыворотка индивида объединяется с пробами эритроцитов, каждый из которых принадлежит к точной антигенной группе системы АВО. Это анализ агглютинации эритроцитов от антител, присутствующих в плазме или сыворотке индивида. Данные антитела, которые представляют собой иммуноглобулины типа IgM, способны агглютинировать эритроциты in vitro. Они называются «обычными» антителами, так как они систематически присутствуют в сыворотке или плазме индивидов, которые не несут соответствующий антиген на поверхности их эритроцитов.

Также существует второй класс антител, именуемых «транзиторными» (или «иммунными») антителами. Их присутствие в сыворотке или плазме является опцией, и они направлены против антигенов систем, не являющихся системой АВО. Это обычно включает IgG (иногда IgM), появляющийся во время антигенной стимуляции чужеродными эритроцитами, например, после иммунизации против одного или более чем одного антигена после переливания крови, или во время беременности посредством материнской иммунной реакции, направленной против эритроцитарных антигенов плода, не принадлежащих к материнской группе крови, или после аллотрансплантации.

Скрининг данных транзиторных антител называется непрямым агглютининовым анализом (IAT) или непрямой пробой Кумбса. Данный анализ используется для выявления присутствия или отсутствия антител IgG, направленных против разных антигенов эритроцитов, в крови индивида с использованием человеческого антиглобулина для облегчения агглютинации, так как IgG сам по себе не способен спонтанно индуцировать агглютинацию in vitro. Для этого данный анализ нацелен на демонстрацию связывания данных антител на анализируемых эритроцитах известной антигенности. Данный способ проводится одновременно на нескольких эритроцитах с разными известными антигенностями, и сравнение результатов делает возможным идентификацию специфичности присутствующего IgG.

Риск больше для самых иммуногенных антигенов, таких как Rh D (RH1), но также и для других резус-типов (Е (RH3) больше с (RH4) больше е (RH5) больше С (RH3)), антиген системы Kell (KEL1), антигены системы Duffy (FY1, FY2), антигены системы Kidd (JK1, JK2) и т.д.

На практике невозможно принимать во внимание все эти антигены при проведении переливания, так как получение правильной группы крови в правильный момент не было бы возможным, особенно так как некоторые антигенные комбинации являются крайне редкими. При стандартных переливаниях принимаются во внимание только группа АВО и присутствие или отсутствие антигена D (RH:1 или RH:-1). В ситуациях, когда присутствуют транзиторные антитела, принимается во внимание целый ряд других систем, а именно: системы Rh (С (RH2) или с (RH4) и E (RH3) или е (RH5)) и системы Kell, и иногда других систем. Следовательно, для данных ситуаций риска важно обеспечивать совместимость между группой крови донора и группой крови реципиента, принимая во внимание присутствие или риск появления данных транзиторных антител к эритроцитам.

Таким образом, у пациентов-реципиентов с транзиторными антителами к эритроцитам или находящихся в ситуации риска, как, например, у пациентов, получающих многочисленные переливания, важно выбирать разовые дозы эритроцитарной массы, которые переливаются, таким образом, чтобы эритроциты донора были лишены антигенов, против которых направлены антитела реципиента или вероятно их появление.

Анализы для определения данных групп крови и для поиска и идентификации транзиторных антител к эритроцитам являются обязательными у данных пациентов и используются предупредительно у всех пациентов-реципиентов перед введением эритроцитарной массы и у беременных женщин для выявления потенциальной несовместимости в системе мать-плод. Дополнительные анализы посредством прямого анализа совместимости с эритроцитами донора в присутствии сыворотки или плазмы реципиента также обязательно использовать для подтверждения совместимости. В данных случаях не должна обнаруживаться ни реакция агглютинации, ни реакция лизиса в методиках, используемых в IAT.

Поиск так называемых транзиторных антител влечет за собой выявление присутствия или отсутствия в крови индивида иммуноглобулинов, направленных против разных антигенов эритроцитов. Когда антитела уже зафиксированы in vivo, проводят прямой анализ или прямой анализ Кумбса. В случае поиска аллоантител целью является выявление фиксации данных иммуноглобулинов на анализах эритроцитов, антигены которых известны, с использованием непрямой методики Кумбса.

В области иммуногематологии имеется большое число способов и устройств, используемых для выявления и/или идентификации эритроцитарных антигенови для выявления и/или идентификации антител к эритроцитам, но они имеют много недостатков.

Способ предметного стекла заключается в смешивании на стеклянном предметном стекле или белой фарфоровой подложке капли крови донора или реципиента с антителом против А (анти-ABO1), антителом против В (анти-ABO2) и антителом против D (анти-RH1) по-отдельности. Агглютинацию можно наблюдать визуально, из чего можно определять системы крови АВО и Rh D. Данный анализ завершается за 5-10 мин и является недорогим. Однако он является нечувствительным способом. Данный анализ не может проводиться для слабо- или редкореагирующих антигенов, результаты от которых сложно интерпретировать, и, кроме того, низкий титр антитела против А (анти-ABO1) или антитела против В (анти-ABO2) мог бы приводить к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Из-за его быстрых результатов он является очень ценным в случаях скорой помощи для предварительного определения соответствия групп крови.

Однако он не является достаточно надежным для полного обеспечения безопасного переливания.

Пробирочный анализ заключается в определении согласно анализам и Beth-Vincent, и Simonin-Michon. В данном способе для определения групп по Beth-Vincent клетки крови помещают в две пробирки, наряду с физиологическим раствором в качестве разбавляющей среды, и затем одну каплю каждого из антитела против А (анти-ABO1) и антитела против В (анти-ABO2) по отдельности добавляют в данные образцы. Данные пробирки подвергают центрифугированию в течение нескольких минут и затем образующийся матрикс легко встряхивают для наблюдения агглютинации. Целью центрифугирования является обеспечение усиленных химических взаимодействий, особенно для реакции более слабых антител, таким образом, приводя к агглютинации. Аналогичным образом, обратное разделение на группы Simonin-Michon может проводиться посредством обработки сыворотки крови против реактивных групп А1 и В эритроцитов (и возможно групп крови О и А2), и затем отслеживается картина агглютинации. В общем, способ пробирки является значительно более чувствительным, чем способ предметного стекла, требует малого объема реактивов, и также могут быть выявлены некоторые неожиданные антигены. Однако у младенцев обратное разделение на группы является в некоторой степени сложным в осуществлении, так как они продуцируют недостаточные количества антител, подлежащих определению. Поскольку данный анализ является ручным способом, его применение для высокопроизводительного анализа является очень ограниченным.

Среди классических способов технология микропланшетов состоит из большого числа маленьких пробирок, которые содержат несколько микролитров (мкл) реактивов, которые обрабатываются относительно образцов крови. После центрифугирования и инкубации последующую агглютинацию можно проверять посредством устройства автоматического считывания. Данный способ является более чувствительным и быстрым анализом для типирования крови и для выявления/идентификации антител к эритроцитам с использованием малых объемов реактивов и возможностью автоматизации для высокопроизводительного анализа. Однако поскольку для методик микропланшетов требуется фаза центрифугирования с последующей стадией встряхивания, имеется, следовательно, риск отмены слабой агглютинации без успеха в ресуспендировании сильной агглютинации. Они должны проводиться при визуальной проверке, и особенное внимание должно уделяться явлениям прилипания некоторых реактивов.

Методики фильтрования посредством гелевого анализа являются стандартной процедурой для количественного измерения агглютинации клеток. Колонка содержит гелевый матрикс для захвата агглютинатов. Для типирования крови эритроциты смешиваются с реактивами против А (анти-ABO1), против В (анти-ABO2) и против D (анти-RH1) или другими антителами против других групп крови в микропробирках при контролируемой инкубации и центрифугировании. Для обратного типирования крови и для выявления/идентификации антител к эритроцитам плазму или сыворотку смешивают с эритроцитами с известной антигенностью при контролируемой инкубации и центрифугировании. Частицы геля захватывают агглютинаты, тогда как обеспечивается прохождение через колонку неагглютинированных клеток крови. Время анализа может быть уменьшено посредством применения стеклянных шариков вместо гелевого вещества, так как данным способом могут достигаться более высокие скорости центрифугирования, что приводит к быстрым результатам. Данная методика является чувствительной, прямой и относительно легкой в осуществлении для менее подготовленного персонала. Однако главный риск заключается в невыявлении некоторых агглютинаций, особенно во время плазматического анализа группы АВО из-за диссоциации маленьких агглютинатов посредством усилий сдвига по мере того, как они проходят в гель.

Также имеется большой недостаток всех данным методик, так как для них требуется стадия центрифугирования для декантации эритроцитов или необходимость пропускания их через гель - ограничивающая стадия, которая добавляет значительное время и стоимость анализа, и для которой необходимо применение объемных центрифуг, с которыми сложно обращаться.

Другие способы, основанные на молекулярном импринтинге (относительно обзора: Mujahid, 2016, Sensors), на методике анализа поверхности чипа с антителами посредством визуализации плазмонным резонансом (Houngkamhang, 2013, sensors; Pipatpanukul, 2018, Biosensors and Bioelectronics), на анализе квантовых точек-магнитных шариков (Xu, 2017, International Journal of Nanomedicine) или на микроструях, приводящихся в движение капиллярами или вакуумом (Zhai, 2017, Lab on a Chip), и в связанной с этим области также были описаны другие способы.

В WO 2012010666 используются магнитные иммунодиагностические способы для определения комплексов антитело/антиген группы крови и фенотипа.

Способ иммунофильтрования, описанный, например, в заявке ЕР 2167967, заключается в захвате аналита, присутствующего в образце, по мере того, как он проходит через пористую мембрану, несущую захватывающий элемент, и выявлении его присутствия посредством выявляющего элемента. У данного способа имеются значительные сложности с чувствительностью и специфичностью, так как при внесении образца он распределяется по и впитывается в пористую мембрану, и многие аналиты теряются в мертвом объеме данной пористой мембраны или выходят из захватывающей области. То же самое применимо к выявляющему раствору. Следовательно, необходимо увеличивать размер поглощающей системы для того, чтобы иметь способность вносить большие объемы образцов, подлежащих анализу, и выявляющего раствора, предотвращая выполнение минитюаризированных анализов, кинетика которых контролируется, не требующих получения выявляющих агентов и применимых с роботизированной пипеткой.

В попытке решить данную проблему и сконцентрировать сигнал, испускаемый после реакции антиген/антитело, в заявке СА 1312265 или WO 02022263 была предложена установка над и под гидрофильной пористой мембраной гидробобной структуры, прокалываемой для принуждения прохождения потока через захватывающее пятно. Однако с данными устройствами все еще существует проблема центрифужной диффузии из пятна, и выявляющие элементы, которые проходят через захватывающее пятно, и которые не зафиксированы на нем, будут способны центрифужно диффундировать в гидрофобную пористую мембрану и сохраняться на периферии данного пятна.

Другой важной проблемой существующих устройств иммунофильтрования сегодня является контроль скорости движения образца через мембрану и в некоторых случаях времени предынкубации. Это время является важным, так как взаимодействие между захватывающим элементом (часто антителом) и аналитом (часто антигеном), а также между аналитом и выявляющим элементом имеет специфическую кинетику. Без особой системы прохождение через гидрофобную мембрану является быстрым (500 мкл/мин).

Для контроля потока предлагали использовать клапан, в частности, в заявке US 2008318342.

Для контроля времени предынкубации в заявке WO 03016902 предлагали использовать устройство из двух частей: верхней части, содержащей участок для сбора образца и пористую мембрану, и нижней части, содержащей пористую мембрану и абсорбирующую мембрану.

Такие механические подходы являются сложными в осуществлении с использованием робота, так как для них требуется разработка и применение предназначенных для этого систем. Они также подвергают профессионалов воздействию любых выступов во время обращения.

Другой способ, описанный в ЕР 0334015, заключается в применении дополнительной мембраны, расположенной в основании первой, для контроля тока, но предложенное устройство не может решить проблемы, связанные с диффузией образца и выявляющего элемента в гидрофильной пористой мембране.

Переливание тромбоцитов, также известных как тромбоцитарная масса, используется для предупреждения или лечения кровотечения у людей либо с низким числом тромбоцитов, либо с плохой функцией тромбоцитов. Предупредительное переливание часто осуществляется у тех, уровни тромбоцитов которых меньше, чем 10×10⁹/л. У тех, кто страдает от кровотечения, переливание типично проводится в количестве меньшем, чем 50×10⁹/л. Тромбоциты даются посредством инъекции в вену. Тромбоциты могут быть получены либо из цельной крови, либо посредством афереза. К настоящему времени идентифицировали 33 человеческих тромбоцитарных аллоантигена (HPA) на шести функционально важных комплексах гликопротеинов тромбоцитов (GP). Наибольшее число распознаваемых HPA (20 из 33) находится на комплексе GPIIb/IIIa, который служит в качестве рецептора для лигандов, важных в опосредовании гемостаза и воспаления. Они включают НРА-1а - HPA, чаще всего участвующий во FNAIT (фетальная и неонатальная аутоиммунная тромбоцитопения) и РТР в популяциях кавказской расы. Другие комплексы GP тромбоцитов - GPIb/V/IX, GPIa/IIa и CD109 - экспрессируют остальные 13 HPA. Из распознаваемых HPA 12 встречаются в виде шести серологически и генетически определенных биаллельных «систем», где форма «а» обозначает аллель с более высокой частотой, и форма «b» - с меньшей частотой. Двадцать один другой HPA представляют собой малочастотные или редкие антигены, для которых постулируемые более высокочастотные аллели «а» еще не были идентифицированы в качестве специфичностей антител. Помимо маркеров HPA, тромбоциты также экспрессируют антигены АВО и человеческий лейкоцитарный антиген (HLA). Соответствие по группе крови (АВО, RH1) типично рекомендуют перед тем, как дают тромбоциты.

Точное типирование пациентов на антигены HPA требуется в нескольких разных клинических ситуациях, и службам по переливанию крови необходимо поддерживать группы типированных по HPA доноров аферезных тромбоцитов и доноров цельной крови для поддержки пациентов, аллоиммунизированных HPA. Ценность серологического НРА-фенотипирования является ограниченной, так как часто от тромбоцитопенических пациентов можно получить слишком мало тромбоцитов, и надежные реактивы серотипирования для антигенов HPA, отличных от НРА-1а и НРА-5b, являются редкими. В отличие от фенотипирования эритроцитов, за исключением НРА-1а, не было разработано моноклональных антител для типирования HPA. Однако недавно было опубликовано несколько способов быстрого скрининга с использованием либо поликлональных, либо рекомбинантных антител против НРА-1а. Данные анализы фенотипирования могут дополнять анализы генотипирования для предоставления групп доноров, отобранных по HPA.

Важно обеспечивать совместимость между тромбоцитами донора и тромбоцитами реципиента. Однако, часто используются несоответствующие тромбоциты из-за недоступности соответствующих тромбоцитов. Несовместимость может приводить к аллоиммунным тромбоцитарным расстройствам, включающим фетальную и неонатальную аллоиммунную тромбоцитопению (FNAIT), посттрансфузионную пурпуру (РТР) и мультитрансфузионную тромбоцитарную рефракторность (MPR).

FNAIT, часто известная как аллоиммунная тромбоцитопения в системе «мать-плод» (FMAIT), случается как следствие иммунизации матери против аллоантигенов тромбоцитов плода, унаследованных от отца. Материнские аллоантитела IgG затем пересекают плаценту и вызывают иммунное разрушение тромбоцитов во время внутриутробного развития - ситуацию, аналогичную гемолитическому заболеванию новорожденного.

Посттрансфузионная пурпура (РТР) является редким, но тяжелым заболеванием, которое случается приблизительно через неделю после переливания любого продукта крови, содержащего тромбоциты или тромбоцитарные мембраны. Пациенты предположительно сенсибилизируются предыдущей беременностью или переливанием крови и отвечают на второй стимул несовместимых тромбоцитов посредством образования высокого титра антител против HPA (и часто HLA). Возникающее иммунное разрушение перелитых тромбоцитов может способствовать реакциям на переливание, которые обычно случаются.

MPR определяется как неадекватное увеличение числа тромбоцитов после переливания случайных донорских тромбоцитов, идентичных по АВО. Она является обычным осложнением у пациентов, получающих многочисленные переливания тромбоцитов.

Несмотря на то, что за последние 25 лет был разработан широкий спектр методик для выявления антител против HPA, четыре методики или их модификации стали самыми обычными: (1) иммунофлуоресцентный анализ тромбоцитов (PIFT); (2) анализ на основе иммобилизации моноклональными антителами антигенов тромбоцитов (MAIPA); (3) твердофазный анализ прилипания эритроцитов и (4) целый ряд методик на основе ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Однако эффективность в выявлении антител к тромбоцитам зависит от множества факторов, включающих методики, группы клеток и опыт оператора, что может сделать некоторые из вышеупомянутых методик затратными, сложными в осуществлении и менее надежными.

Для выявления потенциальной инфекции, передающейся через переливание крови, на протяжении последних четырех десятилетий было разработано много диагностических анализов, в которых используется иммунный ответ. Чаще всего используемые анализы сконструированы либо для выявления антигенов инфекционных агентов, таких как вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены, либо для выявления антител, направленных против инфекционного агента, продуцированных иммунизацией при инфекции. Тем не менее, данные анализы не подходят ко всем ситуациям, и каждый анализ имеет ограничения, которые должны быть известны и приниматься во внимание во время его выбора. Часто иммунодиагностика основывается на применении антитела в качестве реактива.

Имеются разные способы, используемые в иммунодиагностических анализах. Некоторые из данных способов описываются ниже.

Иммунопреципитация является простейшим способом иммуноанализа, в котором измеряется количество осадка, который образуется после инкубации реактива-антитела с образцом, и который взаимодействует с соответствующим ему антигеном с образованием нерастворимого агрегата. Реакции иммунопреципитации могут быть качественными или количественными.

В иммуноанализах на основе частиц выявляется присутствие в образце антитела или специфических антигенов, которые анализируются с использованием частиц, которые покрываются либо антигеном, либо подходящим антителом. Посредством связывания нескольких антител с частицей (желатиновой или латексной) данная частица способна к одновременному связыванию со многими молекулами и облегчает агглютинацию. Это значительно ускоряет скорость видимой реакции. Анализ агглютинации Treponema pallidum на основе частиц (также именуемый анализ ТРРА) является другим примером иммуноанализов на основе частиц, используемых для выявления антител к возбудителю сифилиса, который является возможным инфекционным агентом, передающимся при переливании крови (Manavi et al. 2006 Int. J. STD AIDS). Он представляет собой непрямой анализ агглютинации, в котором желатиновые частицы сенсибилизируются антигеном Т. pallidum. Данные частицы агрегируют с образованием скоплений, когда сыворотка пациента является позитивной в отношении сифилиса, тогда как отрицательный тест не демонстрирует образования скоплений желатиновых частиц.

Иммунонефелометрический анализ представляет собой другой пример иммуноанализов, разработанных для выявления инфекций. Когда иммунные комплексы, образованные объединением антитела и антигена, являются слишком маленькими для осаждения, данные комплексы можно измерять с использованием прибора, именуемого нефелометром, так как они будут рассеивать падающий свет. Концентрацию антигена можно определять в пределах мин реакции.

В радиоиммуноанализе (RIA) используются радиоактивные изотопы для мечения либо антигена, либо антитела. Данный изотоп испускает гамма-лучи, которые обычно измеряются после удаления несвязанной радиоактивной метки. Главным преимуществом RIA по сравнению с другими иммуноанализами является более высокая чувствительность, легкое выявление сигнала и хорошо установленные, быстрые анализы. Главными недостатками являются риски для здоровья и безопасности, накладываемые применением радиации, и время и затраты, связанные с поддержанием лицензированной программы радиационной безопасности и утилизации. По этой причине RIA был, главным образом, заменен в установившейся клинической лабораторной практике ферментативными (EIA), флуоресцентными (FIA) или хемилюминисцентными (CLIA) иммуноанализами.

EIA, FIA и CLIA в настоящее время являются чаще всего используемыми анализами для выявления вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций, особенно передающихся при переливании инфекций в образцах крови доноров. Одним из чаще всего используемых способов EIA для выявления инфекционных заболеваний является твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Имеется множество патентов и публикаций, демонстрирующих эффективности таких анализов для выявления инфекционных агентов.

Данные способы являются аналогичными по их принципу и отличаются только по способу выявления образующихся иммунных комплексов: колориметрическому для EIA и ELISA, и измерению флуоресценции и светимости, продуцируемых ферментативной/химической реакцией для FIA и CLIA. Измерения флуоресценции и хемилюминисценции являются по своей природе более чувствительными, чем колориметрические измерения. Следовательно, данные способы имеют большую аналитическую чувствительность, чем способы EIA, в которых используется измерение оптической плотности.

Также существуют быстрые/простые единичные тесты без промежуточной стадии и одноразового использования, которые используют только раз и выбрасывают. Большинство из этих тестов основывается на иммунохроматографии, в которой образец (кровь, плазма или сыворотка) пропускается через инертную полоску и взаимодействует с реактивами (антитела или антигены), которые были предварительно иммобилизованы на данной полоске. Любая позитивная реакция визуализируеся как пятно или полоса, появляющаяся на данной полоске. Данные тесты легки в применении и не требуют дополнительного реактива, за исключением реактивов, включенных в набор. Они также дают простой качественный результат в пределах нескольких мин. Однако данные тесты не подходят для скрининга большого числа образцов.

Для того чтобы преодолеть вышеописанные недостатки, заявитель применил диагностическое устройство in vitro для выявления из образца крови или одного из ее компонентов по меньшей мере одной реакции между антигеном и антителом, специфично направленным против данного антигена, включающее гидрофобную пористую мембрану, где по меньшей мере одна гидрофильная реакционная область предназначена для получения указанного образца, имеет менее значительную поверхность, чем поверхность гидрофобной пористой мембраны. Данное устройство описывается, например, в патентной заявке WO 2013/186482. Оно исправляет несколько недостатков, обусловленных вышеупомянутыми анализами, в частности, обусловленных иммунофильтрационными анализами посредством:

- предотвращения возвращений выявляющего агента, ответственных за ложноположительные результаты

- повышения чувствительности из-за применения меньших объемов

- миниатюризации и автоматизации системы

- контроля кинетики реакций без необходимости механических манипуляций с прибором.

Несмотря на очевидные преимущества данного устройства, все еще имеется потребность в улучшении чувствительности и специфичности осуществляемой диагностики, когда данная диагностика включает применение захватывающего агента, и когда данный захватывающий агент представляет собой антитело (для выявления соответствующего антигена в образце) или антиген (для выявления соответствующего антитела в образце). При использовании указанного устройства часть захватывающего агента (например, антител против антигенов клеток крови), расположенного на сделанной гидрофильной реакционной области во время диагностического анализа, адсорбируется пористой мембраной с использованием раствора, применяемого для разведения антител. Следовательно, специфичность и чувствительность данного анализа уменьшаются. Для компенсации этой «потери» захватывающего агента необходимо добавлять большое количество захватывающего агента, что может увеличивать стоимость данного диагностического анализа.

Для преодоления этого недостатка авторы настоящего изобретения протестировали несколько технических решений, таких как применение более толстой пористой мембраны или менее пористой мембраны, но без значительного результата.

Вместо этого, исследуя другую возможность модуляции характеристик пористой мембраны или других структурных элементов данного устройства, авторы данного изобретения неожиданно обнаружили то, что добавление особым образом отобранных шариков, на поверхности которых может быть фиксирован или адсорбирован захватывающий агент (например, антитело или антиген), внесенных на реакционную область пористой мембраны, обеспечивает удерживание данного захватывающего агента на поверхности мембраны и, таким образом, улучшает испускаемый сигнал при связывании захватывающим агентом аналита (например, антигена или антитела). Следовательно, применение таких шариков обеспечивает улучшение специфичности и чувствительности раскрытого ранее устройства без применения значительного количества захватывающего агента.

Шарик, на поверхности которого фиксируются антитела и/или антигены, является хорошо известным в данной области для цели постановки диагноза. Например, в международной заявке WO 95/31731 раскрыт способ выявления эритроцитарных антигенов, включающий добавление образца, содержащего клетки крови, в колонку, содержащую частицы, на поверхности которых посредством белковых лигандов фиксируются специфичные антитела к эритроцитам. Однако в описанном способе не применяется устройство, содержащее сделанную гидрофильной пористую мембрану, и он не имеет дело с проблемой, относящейся к абсорбции захватывающего агента через мембрану.

Таким образом, ассоциация сделанной частично гидрофильной пористой мембраны с шариками, на поверхности которых напрямую или опосредованно фиксированы или адсорбированы антитела и/или антигены в качестве захватывающего агента для осуществления диагностического способа in vitro, имеющего высокую специфичность и чувствительность, является неожиданной в свете состояния связанного с этим предшествующего уровня техники.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указано выше, для того, чтобы улучшать чувствительность и специфичность выявления и/или идентификации антигена и/или антитела и для уменьшения количества использованных аналитов, авторы данного изобретения применили устройство, аналогичное устройству, раскрытому в патентной заявке WO 2013/186482, которое дополнительно содержит шарики, расположенные на реакционной области, где антитела и/или антигены фиксируются или адсорбируются на поверхности шарика.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение, таким образом, относится к устройству диагностики in vitro для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающему:

- подложку и

- гидрофобную пористую мембрану, расположенную на данной подложке, содержащую по меньшей мере одну гидрофильную реакционную область, предназначенную для приема указанного образца, причем поверхность данной гидрофильной реакционной области, которая меньше, чем поверхность гидрофобной пористой мембраны, содержит по меньшей мере одно антитело и/или антиген, где указанное антитело и/или антиген является фиксированным или адсорбированным на поверхности шарика.

Авторы настоящего изобретения провели несколько анализов и продемонстрировали то, что диагностическое устройство in vitro по изобретению можно использовать для выявления и/или идентификации разных типов антигенов или антител. Для этого разные типы антител и/или антигенов могут быть фиксированы или адсорбированы на поверхности шарика. Данные антитела могут быть выбраны из антител, направленных против антигенов эритроцитов, из антител, направленных против антигенов тромбоцитов, антител против вирусных антигенов, антител против бактериальных антигенов и антител против паразитарных антигенов или антител против иммуноглобулинов. Данные антигены могут быть выбраны из антигенов эритроцитов, антигенов тромбоцитов, вирусных антигенов, бактериальных антигенов и паразитарных антигенов.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение, таким образом, относится к применению устройства in vitro согласно данному изобретению для определения и/или идентификации:

- по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, содержащей антигены эритроцитов, включая смешанную полевую популяцию, антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены;

- по меньшей мере одного антитела, выбранного из группы, состоящей из антител к эритроцитам, антител к тромбоцитам, противовирусных антител, антибактериальных антител и антипаразитарных антител из образца биологических жидкостей, предпочительно из образца крови или образца компонентов крови.

Авторы данного изобретения, в частности, продемонстрировали то, что устройство in vitro по настоящему изобретению можно использовать в способе in vitro выявления и/или идентификации антигенов эритроцитов, и/или сенсибилизированных in vivo эритроцитов, и/или антигенов тромбоцитов из образца биологических жидкостей, в частности из образца крови или компонентов крови.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антигенов эритроцитов, и/или сенсибилизированных in vivo эритроцитов, и/или антигенов тромбоцитов из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- добавление раствора, содержащего указанный образец, на реакционную область устройства in vitro согласно данному изобретению,

- считывание перед промывкой для получения контроля загрузки образца

- внесение промывочного раствора на реакционную область и

- определение присутствия указанных антигенов или указанных клеток крови посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антигенов или указанных клеток крови посредством определения отсутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Кроме того, авторы данного изобретения также продемонстрировали то, что устройство in vitro по настоящему изобретению можно использовать в способе in vitro выявления и/или идентификации антител к эритроцитам из образца биологической жидкости, в частности, из образца крови или компонентов крови.

Другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антител к эритроцитам из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером и пробами эритроцитов известной антигенности или инкубирование плазмы или сыворотки реципиента с эритроцитами донора,

- внесение данной смеси на реакционную область устройства in vitro согласно данному изобретению,

- внесение промывочного раствора на реакционную область, и

- определение присутствия антител к эритроцитам посредством определения присутствия взаимодействия антитело/антиген, если в реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определения отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия взаимодействия антитело/антиген, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Устройство in vitro по настоящему изобретению можно использовать в способе in vitro для выявления и/или идентификации антител к тромбоцитам из образца биологической жидкости, в частности, из образца крови или компонентов крови.

Другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антител к тромбоцитам из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером и пробами тромбоцитов известной антигенности или инкубирование плазмы или сыворотки реципиента с тромбоцитами донора,

- внесение данной смеси на реакционную область устройства in vitro согласно данному изобретению,

- внесение промывочного раствора на реакционную область, и

- определение присутствия антител к тромбоцитам посредством определения присутствия взаимодействия антитело/антиген, если в реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия взаимодействия антитело/антиген, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Устройство in vitro по изобретению также можно использовать в способе in vitro для выявления и/или идентификации разных типов антигенов, выбранных из группы, содержащей вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены, или разных типов антител, выбранных из группы, содержащей противовирусные антитела, антибактериальные антитела и/или антипаразитарные антитела, причем указанные антитела продуцируются против вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов при инфекции.

Еще один другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антигенов, выбранных из группы, содержащей вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены, из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- возможно инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером,

- добавление раствора, содержащего указанный образец или смесь образца с буфером на реакционную смесь устройства in vitro по данному изобретению,

- возможно считывание перед промывкой для контроля загрузки образца;

- возможно внесение промывочного раствора на реакционную область, и

- определение присутствия указанного антигена посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется окрашенное пятно, или определение отсутствия указанного антигена посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение также относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антител, выбранных из группы, содержащей противовирусные антитела, антибактериальные антитела и/или антипаразитарные антитела из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- возможно инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером,

- добавление раствора, содержащего указанный образец или смесь образца с буфером, на реакционную область устройства in vitro по данному изобретению,

- возможно считывание перед промывкой для контроля загрузки образца;

- возможно внесение промывочного раствора на реакционную область, и

- определение присутствия указанного антигена посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется окрашенное пятно, или определение отсутствия указанного антигена посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Характеристики и преимущества настоящего изобретения выяснятся из следующего подробного описания, из примеров, демонстрирующих некоторые воплощения данного изобретения, также показанные в наборе графических материалов, приложенных к данной заявке.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же самое значение, которое обычно понятно обычному специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение. Некоторые из данных определений упоминаются в части Предшествующий уровень техники настоящей заявки и применяются к настоящему изобретению. Конкретные определения также приводятся ниже в подробном описании ниже.

• Устройство in vitro по изобретению

Как указано выше, авторы настоящего изобретения применили устройство in vitro для определения и/или идентификации антигена и/или антитела с высокой специфичностью и чувствительностью.

В одном аспекте устройство in vitro по настоящему изобретению представляет собой диагностическое устройство in vitro для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, содержащее:

- подложку и

- гидрофобную пористую мембрану, расположенную в указанной подложке, содержащую по меньшей мере одну гидрофильную реакционную область, предназначенную для приема указанного образца, причем поверхность данной гидрофильной реакционной области, которая меньше, чем поверхность гидрофобной пористой мембраны, содержит по меньшей мере одно антитело и/или антиген, где указанное антитело и/или антиген фиксированы или адсорбированы на поверхности шарика.

Устройство по настоящему изобретению подходит для выявления и/или идентификации нескольких типов антигенов или антител. Данное выявление и/или идентификация осуществляется посредством связывания антигена с антителом, фиксированным или адсорбированным на поверхности шарика, или посредством связывания антитела с антигеном, фиксированным или адсорбированным на поверхности шарика. В данном контексте любое антитело и/или антиген могут быть фиксированы или адсорбированы на поверхности шарика в устройстве по настоящему изобретению, в зависимости от типа антигена или антитела, подлежащего выявлению и/или идентификации. Устройство in vitro по изобретению, таким образом, не только служит для выявления и/или идентификации специфических антигенов или антител (таких как антигены эритроцитов и антитела к эритроцитам), но может быть адаптировано для выявления и/или идентификации разных типов антигенов и антител. Специалист в данной области сможет адаптировать устройство in vitro по настоящему изобретению, в зависимости от интересующего антитела или антигена, подлежащего выявлению и/или идентификации, посредством фиксации на поверхности шарика антигена или антитела, связывающихся с интересующим антителом или антигеном соответственно.

Следовательно, термин «антитело» используется в данном документе в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела) любого изотипа, такие как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела, химерные антитела и антигенсвязывающие фрагменты. Антитело, реагирующее со специфическим антигеном, может быть получено способами генной инженерии, такими как селекция библиотек рекомбинантных антител в фаговых или аналогичных векторах, или посредством иммунизации животного антигеном или нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген.

Типичное антитело содержит две идентичные легкие цепи и две идентичные тяжелые цепи, которые соединяются дисульфидными связями. В значении по изобретению термин «легкая цепь» относится к легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего - лямбда (λ) или каппа (κ) - имеющей два последовательных домена: один константный домен и один вариабельный домен.

Термин «тяжелая цепь» относится к цепи иммуноглобулина млекопитающего, обозначенной α, δ, ε, γ и μ. В пределах данных пяти классов иммуноглобулины также могут распределяться на подклассы (IgG1, 2, 3 или 4, IGA1 или 2) согласно тяжелой цепи (γ1, γ2, γ3, γ4, α1 и α2). Каждая тяжелая цепь имеет две области: константную область и вариабельную область. Константная область является идентичной во всех антителах того же самого изотипа. Вариабельная область каждой тяжелой цепи состоит из одного домена Ig.

Термин «вариабельная область» антитела относится к аминоконцевым доменам тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи может называться «VH». Вариабельный домен легкой цепи может называться «VL». Данные домены обычно являются самыми вариабельными частями антитела, и они содержат антигенсвязывающие сайты. Каждая вариабельная область содержит три сегмента, именуемых «областями, определяющими комплементарность» (CDR) или «гипервариабельными областями», которые, главным образом, отвечают за связывание эпитопа антигена. CDR, таким образом, управляет специфичностью связывания антитела. Они обычно называются CDR1, CDR2 и CDR3, и последовательно нумеруются от N-конца. Самые высококонсервативные части вариабельных областей называются «каркасными областями».

В одном воплощении настоящего изобретения антителами, используемыми в данном изобретении, в частности, антителами, фиксированными или адсорбированными на поверхности шарика, являются поликлональные антитела. «Поликлональное антитело» представляет собой антитело, которое продуцируется среди или в присутствии одного или более чем одного другого неидентичного антитела. В общем, поликлональные антитела продуцируются из В-лимфоцита в присутствии нескольких других В-лимфоцитов, продуцирующих неидентичные антитела. Обычно поликлональные антитела получают непосредственно от иммунизированного животного.

Согласно другому воплощению антитела, используемые в данном изобретении, в частности, антитела, фиксированные или адсорбированные на поверхности шарика, представляют собой моноклональные антитела.

Термин «моноклональное антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антителу, возникающему из почти гомогенной популяции антител. Более конкретно, индивидуальные антитела популяции являются идентичными, за исключением нескольких, возможно встречающихся в природе мутаций, которые могут находиться в минимальных пропорциях. Другими словами, моноклональное антитело состоит из гомогенной популяции антител, возникающей из-за роста одного клона клеток (например, гибридомы, эукариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело и т.д.), и обычно характеризуется тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против одного антигена.

Термин «химерное антитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой антитело, в котором константная область или ее часть изменяется, заменяется или обменивается таким образом, что вариабельная область связывается с константной областью другого вида или принадлежащей к другому классу или подклассу антитела.

Термин «антигенсвязывающие фрагменты» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к области на антителе, которая связывается с антигенами. Он состоит из одного константного и одного вариабельного домена каждой тяжелой и легкой цепи.

Согласно одному предпочтительному воплощению настоящего изобретения антитела выбраны из группы, состоящей из антител к эритроцитам, антител к тромбоцитам, антител, направленных против вирусных антигенов, антител, направленных против бактериальных антигенов, и антител, направленных против паразитарных антигенов, предпочтительно из антител к эритроцитам или антител к тромбоцитам.

Термин «антитела к тромбоцитам» или «антитела к антигенам тромбоцитов» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, направленному против одного или более чем одного антигена тромбоцитов. Предпочтительно антитела к антигенам тромбоцитов, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой очищенное или полуочищенное моноклональное антитело или очищенное или полуочищенное поликлональное антитело, или антисыворотку.

Термин «антитела, направленные против вирусных антигенов» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, направленному против вирусного антигена, причем указанные антитела продуцируются при инфекции субъекта. Предпочтительно антитела к вирусным антигенам, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой очищенное или полуочищенное моноклональное антитело, очищенное или полуочищенное поликлональное антитело или антисыворотку. Противовирусные антитела, выявленные и/или идентифицированные устройством in vitro по настоящему изобретению, могут быть выбраны из группы, состоящей из антител, направленных против антигенов, специфических для вируса чикунгунья, цитомегаловируса, вируса лихорадки Денге, Эбола, EBV (вирус Эпштейна-Барр), вируса энцефалита, вируса лейкоза кошачьих, гантавируса, вируса гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита D, гепатита Е, герпеса, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), HTLV (Т-лимфотропный вирус человека), вируса лихорадки Ласа, кори, паротита, норовируса, вируса папилломы, парвовируса, вируса краснухи, вируса SARS (атипичная пневмония), вируса ветряной оспы, вируса Западного Нила и вируса Зика. В частности, выявление антител, направленных против ВИЧ, HTLV, вируса гепатита В или гепатита С является обязательным для безопасности переливания крови. В частности, устройство in vitro по настоящему изобретению используется для выявления и/или идентификации ВИЧ, вируса гепатита В и гепатита С, более конкретно - вируса гепатита В.

Термин «антитела, направленные против бактериальных антигенов» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, направленному против бактериального антигена, которое продуцируется при инфекции субъекта. Предпочтительно антитела против бактериальных антигенов, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой очищенное или полуочищеное моноклональное антитело, очищенное или полуочищеное поликлональное антитело или антисыворотку. Данные антитела могут быть поликлональными или моноклональными антителами, в частности, моноклональными антибактериальными антителами, хорошо известными специалисту в данной области. Например, такие антитела могут быть выбраны из грамположительных или грамотрицательных бактерий, в частности, из Borrelia, Chlamydia, Helicobacter pylori, Mycoplasma, S. typhi, Yersinia, Proteus, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Acinetobacter, Clostridium, Serratia, Propionibacterium, Staphylococcus, Bacillus, Treponema и Enterococcus. В частности, антибактериальная активность направлена против специфического антигена Treponema, в частности, Treponema pallium, которая является ответственной за сифилис.

Термин «антитела, направленные против паразитарных антигенов», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, направленному против паразитарного антигена, которое продуцируется при инфекции субъекта. Предпочтительно антитела против паразитарных антигенов, используемые в настоящем изобретении, могут быть очищенным или полуочищенным моноклональным антителом, очищенным или полуочищенным поликлональным антителом или антисывороткой. Антипаразитарные антитела, используемые в настоящем изобретении, выбраны из группы, состоящей из Toxoplasma, Trypanosoma, Plasmodium. В частности, антитело направлено против специфического антигена Trypanosoma cruzi, которая является ответственной за болезнь Чагаса. Более конкретно антитело направлено против Plasmodium, предпочтительно против Plasmodium falciparum, который является ответственным за малярию.

Термин «антииммуноглобулины» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антителам, направленным против одного или более чем одного иммуноглобулина, такого как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.

Термин «антитела к эритроцитам» или «антитела к антигенам эритроцитов» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, направленному против одного или более чем одного антигена эритроцитов. Предпочтительно антитела к антигенам эритроцитов, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой очищенное или полуочищенное моноклональное антитело, очищенное или полуочищенное поликлональное антитело или антисыворотку. Также можно использовать агглютинины или лектины. Неограничивающий список антител и антигенов, используемых в данном изобретении, следует далее:

Большинство из перечисленных выше антител может быть приобретено у заявителя Diagast. Согласно одному воплощению настоящего изобретения антитела, фиксированные или адсорбированные на поверхности шарика, представляют собой антитела к эритроцитам, выбранные из любого из антител в Таблице 1. Например, антитела к эритроцитам могут быть выбраны из группы, содержащей антитела Анти-А, Анти-В, Анти-АВ, Анти-D, Ahth-RH2, Ahth-RH3, Ahth-RH4, Ahth-RH5 и Анти-Kell, Анти-MNS (MNS1, 2, 3 и 4), Анти-JK (JK1, JK2), Анти-FY (FY1, FY2), Анти-LE (LE1, LE2), Анти-LU (LU1, LU2) и Анти-P1PK.

В контексте настоящего изобретения термин «антиген» относится к заранее определенной молекуле, с которой может селективно связываться антитело. Данный антиген-мишень может представлять собой полипептид, углевод, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен, гликопротеин или гликолипид, или любое другое встречающееся в природе или синтетическое соединение. Предпочтительно антиген-мишень представляет собой полипептид, гликопротеин или гликолипид.

Согласно одному предпочтительному воплощению настоящего изобретения данные антигены выбраны из группы, содержащей антигены эритроцитов (как перечислено в Таблице 1), антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены, более предпочтительно - из антител к эритроцитам или вирусных антигенов. Предпочтительно антигены, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой очищенный или полуочищенный природный антиген, рекомбинантный или синтетический антиген.

Термин «вирусный антиген» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антигену с множественными антигенностями, который является специфичным для штамма и тесно ассоциированным с вирусной частицей. Данный антиген может представлять собой природный или рекомбинантный белок. Вирусные антигены могут быть выбраны, например, в группе, содержащей антигены, специфичные в отношении чикунгунья, цитомегаловируса, вируса лихорадки Денге, Эбола, EBV, вируса энцефалита, вируса лейкоза кошачьих, гантавируса, вируса гепатита А, гепатита В (HBsAg), гепатита С (HCsAg), гепатита D, гепатита Е, герпеса, ВИЧ, HTLV, вируса лихорадки Ласса, кори, паротита, норовируса, вируса папилломы, парвовируса, вируса краснухи, вируса SARS, вируса ветряной оспы, вируса Западного Нила и вируса Зика. В частности, настоящее изобретение относится к идентификации и/или выявлению антигенов HBsAg и HCsAg, так как они являются обязательными для безопасности переливания крови, более конкретно - к HBsAg.

Термин «бактериальный антиген» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле, которая находится на поверхностях бактериальных организмов. Бактериальные антигены могут быть выбраны из любого из бактериальных штаммов, но предпочтительно выбраны из Borrelia, Chlamydia, Helicobacter pylori, Mycoplasma, S. typhi, Yersinia, Proteus, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Acinetobacter, Serratia, Clostridium, Propionibacterium, Staphylococcus, Bacillus и Enterococcus. В частности, может быть выявлен и/или идентифицирован или может быть фиксирован и/или адсорбирован на поверхности шарика специфический антиген бактерии Treponema pallidum, которая является ответственной за сифилис.

Термин «паразитарный антиген» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле, которая находится на поверхности клетки паразита. Данный паразит может быть таким, как определено выше. Предпочтительно паразитарные антигены выбирают из группы, содержащей антигены, специфические для Toxoplasma, Trypanosoma, Plasmodium, более предпочтительно, антигены, специфические для Plasmodium, конкретно для Plasmodium falciparum, вызывающего малярию.

Неисчерпывающий список антигенов и антител, направленных против антигенов вирусов, бактерий и паразитов, приводится в Таблице 2 ниже:

Термин «антиген тромбоцитов» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антигену тромбоцита, имеющему отношение ко всем иммуногенным молекулам, присутствующим на поверхности тромбоцитов, где необходима способность вызывать продукцию антител, направленных против данных молекул, и/или обеспечивать их распознавание. Антигены тромбоцитов могут быть выбраны, например, в группе, содержащей биаллельный антиген НРА-1, -2, -3, -4, -5 и-15.

Термин «антигены эритроцитов», также известные как антиген группы крови, в том виде, в котором он используется в данном документе, относится ко всем иммуногенным молекулам, присутствующим на поверхности эритроцитов, где необходима способность вызывать продукцию антител, направленных против данных молекул, и/или обеспечивать их распознавание. Антигены эритроцитов включают смешанную полевую популяцию антигенов. Неисчерпывающий список антигенов эритроцитов показан в Таблице 1.

Термин «смешанная полевая популяция» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к двум популяциям эритроцитов с разными антигенами, которые можно наблюдать после переливания совместимых эритроцитов между донором и реципиентом (эритроциты О, перелитые пациентам А или В) или после пересадки костного мозга. Устройство in vitro по изобретению обеспечивает выявления образца со смешанной полевой популяцией.

Термин «сенсибилизированные in vivo эритроциты» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к эритроцитам с иммуноглобулином (IgG) или комплементом (C3d), связанными in vivo с поверхностью их мембраны. Сенсибилизированные in vivo эритроциты могут появляться в разных клинических гемолитических состояниях, включающих гемолитические реакции при переливании, гемолитическое заболевание плода и новорожденного (HDFN), аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA) и индуцированные лекарственным средством антитела у пациента.

Согласно другому воплощению настоящего изобретения указанное антитело и/или антиген напрямую или опосредованно фиксируется или адсорбируется на поверхности шарика.

В настоящее время есть несколько способов присоединения биологических лигандов к шарикам, используемым в качестве твердофазных подложек в иммунологических тестах и анализах, включая адсорбцию на простые полимерные шарики, ковалентное присоединение к микросферам, функционализированным на поверхности. Механизм адсорбции основывается, главным образом, на гидрофобных (вандерваальсовых, лондонского типа) притяжениях между гидрофобными частями адсорбированных лигандов и полимерной поверхностью шарика. Этот способ, главным образом, заключается в ковалентном связывании для иммобилизации биомолекул, когда требуется очень активный и стабильный реактив на основе шарика, тогда как непрямая фиксация опосредуется антителами против иммуноглобулинов, такими как антитела против человеческого глобулина (AHG), фиксированными ковалентно или адсорбированными на шариках, которые захватывают второе антитело, направленное против интересующего антигена.

При прямой фиксации или адсорбции антитела и/или антигена на поверхности шарика это осуществляется посредством приведения шариков в контакт с антителами и/или антигенами. Например, раствор, содержащий антитела и/или антигены, может представлять собой неденатурирующий буфер, содержащий раствор с рН, стабилизированным от рН 4 до рН 10, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, даже более предпочтительно от рН 7 до рН 7,5. Данные антитела могут быть либо адсорбированными, либо ковалентно связанными.

Растворы антител выбирают из супернатантов культуры или концентратов супернатантов, очищенных антител, полуочищенных или обогащенных антител. Растворы антигенов выбирают из очищенного или полуочищенного природного антигена, рекомбинантного или синтетического антигена. Данные антитела и/или антигены могут быть добавлены к адъювантам, предназначенным для поддержания их микробиологической стабильности, таким как азид натрия, антибиотики, или их конформационной стабильности, таким как сахара (сахароза, декстроза, трегалоза), а также любой другой агент, известный специалистам в данной области как выполняющий эти функции.

Согласно одному воплощению поверхность шарика содержит по меньшей мере одну химическую группу, выбранную из альдегидных групп, хлорметильной группы, групп NHS и карбоксильных групп.

В частности, когда поверхность шарика содержит альдегидные группы, данная группа взаимодействует с аминогруппой антитела, что обеспечивает прямую фиксацию антитела, направленного на антиген, подлежащий определению и/или идентификации, или антител, используемых для непрямой фиксации (описанных ниже), на поверхности шарика. В случае фиксации антигена данная группа взаимодействует с аминогруппой антигена, что обеспечивает прямую фиксацию антигена, распознаваемого антителами, подлежащими определению и/или идентификации.

В другом конкретном воплощении поверхность шарика содержит группы NHS или также именуемые N-гидроксисукцинимидными (NHS) функциональными группами, предпочтительно она содержит функциональные группы в виде сложного эфира NHS.

Согласно другому воплощению настоящего изобретения данное антитело, направленное на антиген, подлежащий определению и/или идентификации, или на известный антиген, может быть опосредованно фиксированным на поверхности шарика с помощью другого антитела, например, против иммуноглобулина. Такое антитело против иммуноглобулина предпочтительно является направленным против иммуноглобулинов, более предпочтительно IgM или IgG. В данном случае, если поверхность шарика содержит альдегидную группу, аминогруппа антитела против иммуноглобулина взаимодействует с альдегидной группой, фиксируя этим способом антитела против иммуноглобулинов на поверхности шарика. Антитело, направленное на антиген, подлежащий определению и/или подлежащий идентификации, затем фиксируется на антителе против иммуноглобулина посредством взаимодействия белок/белок.

Согласно еще одному другому воплощению антитело, направленное на антиген, подлежащий определению и/или подлежащий идентификации, или на известный антиген, может быть опосредованно фиксировано на поверхности шарика с помощью лиганда, выбранного из белков с аффинностью в отношении антител, таких как белок А, белок G и/или белок L.

Шарики, нанесенные на пористую мембрану устройства in vitro по изобретению, могут быть сделаны из разных типов материалов, таких как стекло, полимер, в частности, латекс. Предпочтительно данные шарики выбраны из группы стеклянных шариков, полистирольных шариков, функционализированных СООН, агарозных шариков, функционализированных белком A/G и/или L, агарозных шариков, функционализированных NHS, шариков, функционализированных эпокси, латексных шариков, функционализированных хлорметилом, или шариков, функционализированных альдегидом.

Более предпочтительно данные шарики представляют собой латексные шарики, в частности латексные шарики, функционализированные альдегидом.

Согласно одному воплощению данные шарики используются в концентрации, составляющей от 1% до 10%, предпочтительно от 1% до 5%, более предпочтительно от 2% до 6% или от 1% до 3%, даже боле предпочтительно 3% от раствора, нанесенного на сделанную гидрофильной реакционную область пористой мембраны, причем нанесенный объем указанного раствора составляет от 1 до 100 мкл, предпочтительно от 1 до 50 мкл, более предпочтительно от 5 до 50 мкл и даже более предпочтительно от 1 до 10 мкл или от 5 до 10 мкл.

Размер шариков выбирают как функцию размера поры гидрофобной пористой мембраны. Размер шариков должен превосходить размер пор пористой мембраны для того, чтобы избежать поглощения шариков в пористую мембрану. Однако размер шариков не должен быть очень существенным для того, чтобы избегать явления агглютинации. Квалифицированный специалист смог бы выбрать размер шариков, в зависимости от размера пор пористой мембраны.

В одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения размер шариков составляет от 1 мкм до 130 мкм, предпочтительно от 5 мкм до 20 мкм и более предпочтительно - 9 мкм.

Согласно одному воплощению устройства in vitro по изобретению пористая мембрана имеет толщину, составляющую от 0,4 мм до 2 мм, предпочтительно от 0,6 мм до 1,5 мм.

Гидрофобная пористая мембрана может содержать любое вещество, которое не изменяется водными растворителями. Данное вещество, в частности, может быть выбрано из природных полимеров, модифицированных или не модифицированных химически, таких как, например, нитроцеллюлозный полимер, целлюлоза, или из синтетических полимеров, таких как, например, полиэтилен, полиэтилен высокой плотности (HDPE) или фторированные полимеры, такие как поливинилидена фторид (PVDF), предпочтительно полиэтилен. Данные полимеры могут быть функционализированными или не функционализированными группами реактивов, способных создавать связи с захватывающими агентами, используемыми позднее.

Гидрофобная пористая мембрана содержит по меньшей мере одну гидрофильную реакционную область, на которую наносятся шарики. Данная реакционная область имеет поверхность, меньшую, чем поверхность гидрофобной пористой мембраны, то есть, данная мембрана не может быть сделана полностью гидрофильной.

Гидрофильная(ные) реакционная(ные) область(ти) данной пористой мембраны предпочтительно была сделана гидрофильной посредством местного добавления поверхностно-активного вещества, без модификации химических функций пористого субстрата посредством предшествующей химической или физической обработки данной гидрофобной пористой мембраны.

В контексте настоящего изобретения термин «поверхностно-активное вещество» означает любой агент, делающий гидрофильным, то есть, любое вещество, способное делать гидрофобную мембрану гидрофильной достаточным образом для того, чтобы пропускать образец, содержащий анализируемые аналиты, посредством капиллярных сил.

Использованное поверхностно-активное вещество может быть выбрано из природных поверхностно-активных веществ, природных поверхностно-активных веществ, модифицированных химически или полученных химическим синтезом. Предпочтительно это неионное поверхностно-активное вещество, например, Triton Х-100, Tween 20 или сапонин, полиоксиэтилен или нонил-β-О-глюкозид.

Данное поверхностно-активное вещество может быть разведено в водном растворе или в органическом растворителе, таком как этанол, в концентрации от 0,01 до 5% (масс./об.). Предпочтительно поверхностно-активное вещество, используемое для того, чтобы делать мембрану локально гидрофильной, используется в концентрации от 0,1% до 3%, более предпочтительно от 0,5 до 2% и даже более предпочтительно от 0,5 до 1% (масс./об.).

Для того чтобы сделать гидрофильной гидрофобную пористую мембрану, на данную мембрану наносят от 0,1 до 5 мкл, предпочтительно от 0,3 до 3 мкл, более предпочтительно от 0,5 до 2 мкл раствора, содержащего поверхностно-активное вещество.

Таким образом, согласно одному воплощению гидрофильная реакционная область гидрофобной пористой мембраны приводится в гидрофильное состояние посредством поверхностно-активного вещества, предпочтительно используемого в концентрации, составляющей от 0,01 до 5% масс./об., более предпочтительно от 0,1% до 3% масс./об., даже более предпочтительно от 0,5% до 2% масс./об. раствора, и где от 0,1 до 5 мкл, предпочтительно от 0,3 до 3 мкл и более предпочтительно от 0,5 до 2 мкл указанного раствора, содержащего поверхностно-активное вещество, наносится на гидрофобную пористую мембрану.

Концентрация использованного поверхностно-активного вещества, коррелирующая с другими характеристиками мембраны (в частности, пористостью и толщиной), контролирует скорость движения жидкостей, которые проходят через мембрану. Обычно допускают, что не нужно превышать максимальную дозу 0,1% для Triton Х-100 и 0,05% для Tween для получения гидрофильной мембраны, предназначенной для приема захватывающего элемента. Но из-за конкретных характеристик мембраны согласно изобретению можно использовать детергенты, способные делать данную мембрану локально гидрофильной, в дозе вплоть до 5%, предпочтительно вплоть до 3%, особенно для Triton Х-100 или Tween 20, без нарушения реакционной способности данной области, что облегчает создание гидрофильности данной мембраны.

Та же самая гидрофобная мембрана может содержать несколько гидрофильных реакционных областей при условии, что данные области не пересекаются.

Данные реакционные области могут находиться во всех геометрических формах, но предпочтительно в форме кружков или пятен диаметра от 0,3 мм до 20 мм.

Данная реакционная область может быть гидрофильной по всей толщине пористой мембраны и/или на поверхности.

Данная реакционная область может иметь одну степень обеспечения гидрофильности, т.е. данная реакционная область имеет одинаковую степень обеспечения гидрофильности.

Согласно одному воплощению реакционная область может содержать несколько областей, имеющих разные степени обеспечения гидрофильности. Например, реакционная область может содержать две гидрофильные области с большей степенью обеспечения гидрофильности в центре реакционной области, чем на периферии. Данные гидрофильные области предпочтительно находятся только на поверхности мембраны.

Реакционная область также может содержать две гидрофильные области с разной степенью обеспечения гидрофильности: одну на поверхности и другую в толще.

В случае, когда реакционная область содержит две гидрофильные области, данная реакционная область была сделана гидрофильной с использованием двух разных поверхностно-активных веществ без модификации химических функций пористого субстрата посредством предшествующей химической или физической обработки данной пористой мембраны.

Преимущественно, конфигурация реакционной области с двумя областями, имеющими разную степень обеспечения гидрофильности, в частности, на поверхности, является полезной при выявлении смешанной полевой популяции из образца крови или компонентов крови. Данная конфигурация также является особенно приспособленной для выявления и/или идентификации конкретных антител и/или антигенов в образце, подлежащем анализу.

Устройство in vitro по изобретению согласно одному воплощению может содержать абсорбирующий слой (или также именуемый абсорбирующей мембраной), расположенный под пористой мембраной. Данный слой абсорбирует жидкости, нанесенные на уровне реакционных областей, которые не удерживаются пористой мембраной, в частности, когда данная реакционная область является гидрофильной по всей толщине мембраны.

Абсорбирующий слой может содержать материал, обеспечивающий пассивную абсорбцию посредством капиллярных сил, как, например, абсорбирующую бумагу, целлюлозу и т.д., или может быть сделан из абсорбирующих полимеров. В качестве примера, могут быть перечислены следующие продукты для использования в качестве абсорбирующего слоя:

- MerckMillipore® С048, С068, С083, С248 (Merck)

- Whatman® CF3, CF4, CF10, сорт 470, CF5, CF6, CF7, сорт 900, сорт 300

- Ahlstrom® сортов 601, 642, 631, 238, 237, 222, 243, 320 (Munktell)

- Pall сортов 111, 113, 133, 165, 197, 8975, 8964, 8301 (Pall Corporation), мембрана для прямого сбора, хранения и эффективного быстрого высвобождения биологических образцов для клинической диагностики Accuwik® Ultra

- сверхабсорбирующий слой Cleanis Gelmax®.

- Мс Arlaid Т-499, SCP-300-TCF, Т-089, Т-183-5 и SCP-200-TCF

Композиция абсорбирующей мембраны и ее размеры должны быть выбраны таким образом, что она может абсорбировать все растворы, используемые во время анализа (V_общий в мкл). Каждая мембрана отличается абсорбирующей способностью (С в мкл/см²), мембрану и ее размеры (D в см²) выбирают так, чтобы удовлетворять следующее уравнение: D больше V_общий/С.

Согласно одному воплощению устройство in vitro по изобретению также содержит по меньшей мере еще один слой, расположенный между пористой гидрофобной мембраной и адсорбирующим слоем, причем указанный слой сделан из дренажного вещества. Осущающим веществом является такое вещество, как, например, вата, NA7150PES, NT9610HY, NT9750HY NV170F, NV250F, NV340F, (Subrenat) или Packtex HY050B.

Пористая мембрана и возможно слои абсорбента и дренажа организованы на подложке данного устройства.

Подложка устройства in vitro согласно изобретению предпочтительно представляет собой твердую подложку. Она, например, может представлять собой раковину.

Данная подложка предпочтительно содержит твердый материал, не позволяющий жидкости убегать. Это могут быть, в частности, пластмассы, такие как полипропилен, полиэтилен, полистирол, акронитрил-бутадиен-стирол, полиэтилена терефталат, поликарбонат, полиамид, поливинилхлорид, метилполиметакрилат.

Подложка устройства in vitro по изобретению предпочтительно содержит две части: нижнюю часть, на которой располагается гидрофобная пористая мембрана, дренажный слой и абсорбирующий слой, и верхнюю часть, которая покрывает нижнюю часть.

Предпочтительно на поверхности нижней части подложки организован абсорбирующий слой, на котором располагается гидрофобная пористая мембрана. Более предпочтительно между абсорбирующим слоем и пористой мембраной организован дренажный слой. Даже более предпочтительно на поверхности нижней части подложки организован слой пены, на который нанесен абсорбирующий слой, затем дренажный слой, на который наложена гидрофобная пористая мембрана, содержащая по меньшей мере одну гидрофильную реакционную область, поверхность которой меньше, чем поверхность мембраны, и на данную реакционную область наносятся шарики с антителами, фиксированными и/или адсорбированными на их поверхности (Фиг. 1а и b).

Верхняя часть подложки покрывает нижнюю часть таким образом, что гидрофобная пористая мембрана и любой один или все другие слои, когда они присутствуют на подложке, могут быть заделаны в данную подложку.

Верхняя часть подложки предпочтительно содержит по меньшей мере одно или более чем одно отверстие. Данное(ные) отверстие(тия) соответствует(ют) области сбора образца, нанесенного на гидрофильную реакционную область. Гидрофильная область может иметь идентичный размер размеру основания отверстия, меньший или больший, при условии, что две гидрофильные области всегда разделены гидрофобной областью на мембране.

Область сбора должна быть такого размера, что она может содержать по меньшей мере максимальный объем образца или реакционной смеси, подлежащих анализу, нанесенных на реакционную мембрану.

Согласно одному воплощению разные части устройства in vitro по изобретению могут быть собраны пользователем, если они поставляются в виде набора. Данное устройство может поставляться в виде одного блока.

Как указано выше, устройство in vitro по изобретению также может выявлять и/или идентифицировать антитело.

Согласно одному воплощению выявление антитела осуществляется посредством связывания специфического известного антигена, фиксированного и/или адсорбированного на поверхности шарика. Антитело, подлежащее идентификации и/или определению в образце биологической жидкости, может специфично связываться с известным антигеном. Выявление данного связывания обеспечивает выявление антитела, специфично направленного против указанного антигена.

Согласно другому воплощению изобретения выявление антител может осуществляться посредством фиксации или адсорбции антииммуноглобулина (антитела) на поверхности шарика, который представляет собой антитело против иммуноглобулина, способное связывать другое антитело (подлежащее выявлению и/или идентификации), присутствующее в образце, подлежащем анализу. Данное второе антитело затем будет выявляться и/или идентифицироваться с использованием выявляющего агента, например, меченого антигена, специфично связываемого данным антителом.

Согласно другому воплощению изобретения выявление антител может осуществляться посредством фиксации или адсорбции белка с аффинностью в отношению антител на поверхности шарика, который способен к связыванию с антителом (подлежащим выявлению и/или идентификации), присутствующим в образце, подлежащем анализу. Данное антитело затем будет выявляться и/или идентифицироваться с использованием выявляющего агента, например, меченого антигена, специфично связываемого данным антителом.

В одном воплощении при определении и/или идентификации антител к эритроцитам шарики фиксируют или адсорбируют антитело против иммуноглобулина (против IgG и/или против IgM), которое будет захватывать в образце крови, особенно сыворотке или плазме, циркулирующие антитела к эритроцитам. Выявление и идентификация данных антител могут проводиться с использованием эритроцитов, несущих соответствующий антиген.

В одном воплощении при определении и/или идентификации антител к эритроцитам данные шарики фиксируют или адсорбируют антитело против иммуноглобулина (против IgG и/или против IgM), которое будет захватывать антитела к эритроцитам, присутствующие на поверхности сенсибилизированных in vivo эритроцитов. Выявление и идентификация данных антител проводятся посредством самих сенсибилизированных in vivo эритроцитов.

В одном воплощении шарики фиксируют или адсорбируют антитело против C3d, которое будет захватывать эритроциты, сенсибилизированные in vivo комплементом, которые образуются из-за активации комплемента, посредством фиксации in vivo антитела типа IgM к эритроцитам. Выявление и идентификация данных антител проводятся посредством самих сенсибилизированных in vivo эритроцитов.

Тот же самый принцип может применяться к антителам, направленным против вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов, которые циркулируют в крови анализируемого субъекта, подозреваемого в том, что он инфицирован, с использованием, например, другой системы выявления, такой как, например, второй набор цветных шариков, связанных с соответствующими антигенами или антителом, конъюгированным с ферментом (например, пероксидазой хрена) или с наночастицами коллоидного золота.

Устройство in vivo по настоящему изобретению предназначено для определения и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологических жидкостей.

В контексте настоящего изобретения термин «образец биологической жидкости» относится к любому образцу, полученному из биоорганических жидкостей, продуцированных живым организмом. Данные биологические жидкости выбраны из группы, содержащей внеклеточные жидкости, внутрисосудистые жидкости, интерстициальные жидкости, лимфатические жидкости и трансцеллюлярные жидкости. В частности, образец биологической жидкости выбран из группы, содержащей кровь и компоненты крови, мочу, слюну и т.д.

В более предпочтительном воплощении образец биологической жидкости представляет собой образец крови или образец компонентов крови. Термин «образец крови» или «образец компонентов крови» означает цельную кровь или один из ее компонентов, выбранный, в частности, из фракции эритроцитов, фракции лейкоцитов, тромбоцитов, плазмы или сыворотки.

В частности, когда устройство in vitro по настоящему изобретению используется для выявления и/или идентификации антигенов эритроцитов и/или антител, направленных против данных антигенов, данный образец представляет собой образец крови или образец компонентов крови.

В частности, когда устройство in vitro по настоящему изобретению используется для выявления и/или идентификации вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов и/или антител, направленных против данных антигенов, данный образец представляет собой образец крови или образец компонентов крови.

Образец, как описано выше, можно получать от любого организма, в частности от млекопитающего и, более конкретно, от человека.

Предпочтительные воплощения

Разные предпочтительные конкретные характеристики, соответствующие разным типовым элементам устройства in vitro согласно данному изобретению, были описаны выше в разделе, конкретно относящемся к данному элементу. В контексте данного изобретения каждый список подходящих характеристик для конкретного элемента и каждая конкретная характеристика, раскрытая для конкетного элемента, могут быть объединены с любым другим типовым элементом, причем список подходящих характеристик для указанного другого элемента или любая конкретная характеристика раскрыты для указанного другого элемента.

В частности, предпочтительные воплощения элемента устройства in vitro согласно данному изобретению могут быть объединены с любым другим типовым элементом или с предпочтительными воплощениями указанного другого элемента.

Предпочтительные воплощения, соответствующие воплощениям, в которых по меньшей мере один элемент ограничивается предпочтительным воплощением, перечислены в Таблице 3 ниже:

Применение устройства in vitro по изобретению

Устройство in vitro по изобретению можно использовать для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологической жидкости.

Как указано выше, данное устройство подходит для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела, в зависимости от антитела и/или антигена, фиксированного или адсорбированного на поверхности шарика.

Авторы данного изобретения провели исследования для того, чтобы продемонстрировать то, что устройство in vitro по настоящему изобретению подходит для применения с антителами, фиксированными на поверхности шариков, имеющих структурные отличия, как, например, антитела, направленные против антигенов эритроцитов, и антитело, направленное против по меньшей мере одного антигена, специфичного для вируса, бактерии или паразита. Например, анализируемое антитело представляет собой антитело, направленное против антигена HCV (HCsAg) или HBV (HBsAg), вызывающих гепатит С и В, соответственно, причем указанное антитело может быть фиксировано или адсорбировано на поверхности шарика для того, чтобы выявлять и/или идентифицировать перечисленные антигены соответственно. Предпочтительно указанное антитело представляет собой антитело, направленное против антигена HBV (HBsAg).

В частности, авторы данного изобретения продемонстрировали то, что устройство in vitro по настоящему изобретению является полезным для выявления и/или идентификации антигенов, и/или антител эритроцитов, вирусов, бактерий и паразитов из биологической жидкости, в частности, из образца крови или образца компонентов крови.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение, таким образом, относится к применению устройства in vitro согласно данному изобретению для определения и/или идентификации:

- по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, содержащей антигены эритроцитов, включающие смешанную полевую популяцию, антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены и антигены паразитов;

- по меньшей мере одного антитела, выбранного из группы, содержащей антитела к эритроцитам, антитела к тромбоцитам, противовирусные антитела, антибактериальные антитела и антипаразитарные антитела из образца биологических жидкостей, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови

из образца биологических жидкостей, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови.

Как указано выше, разные типы антигенов или антител могут быть выявлены и/или идентифицированы устройством in vitro по изобретению, в зависимости от типа антител или антигенов, фиксированных или адсорбированных на поверхности шарика.

В частности, устройство in vitro по настоящему изобретению используется для выявления и/или идентификации антигенов группы, содержащей антигены эритроцитов, антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены. Более конкретно, данное устройство используется для выявления и/или идентификации антигенов эритроцитов.

Устройство in vitro по настоящему изобретению можно использовать, в частности, для определения и/или идентификации (или также фенотипирования) эритроцитов, то есть, определения антигенов на их поверхности. Фенотипирование эритроцитов обычно означает определение и/или идентификацию групп крови. В контексте настоящего изобретения термин «группа крови» относится, например, к группам, выбранным из систем АВО, D, Rh, Kell, MNS, JK (Kidd), FY (Duffy), LE (Lewis), LU (Lutheran), P1PK.

Устройство in vitro по настоящему изобретению также используется для выявления и/или идентификации антител, выбранных из группы, содержащей антитела к эритроцитам или также именуемые антитела против клеток крови, которые включают аутоантитела, аллоантитела, гетероантитела и холодный антиглобулин. В частности, данные антитела выявляются и/или идентифицируются из образца крови или образца компонентов крови.

Устройство in vitro по настоящему изобретению, в частности, можно использовать для следующего:

- анализ Simonin-Michon, в котором идентифицируется присутствие антител против А (анти-ABO1) или против В (анти-ABO2);

- поиск или идентификация антител, направленных против клеточных антигенов, в частности, эритроцитов, в показателях поиска аллоантител, аутоантител, гетероантител или даже холодных агглютининов посредством непрямого антиглобулинового анализа;

- поиск совместимости между эритроцитами донора и кровью реципиента посредством проведения реакции определения групп крови;

- поиск антител, фиксированных in vivo, на эритроцитах посредством прямого антиглобулинового анализа.

Термин «аллоантитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, продуцируемому субъектом, которое взаимодействует с одним или более чем одним антигеном от генетически отличного индивида того же самого вида. Данные аллоантитела продуцируются иммунизацией после переливания крови, во время беременности, после трансплантации или пересадки.

Термин «аутоантитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, продуцируемому от субъекта, направленному против одного или более чем одного антигена от того же самого субъекта. Выявление аутоантител предпочтительно проводится после переливания крови или в случае гемолитической анемии (аутоиммунная, индуцированная лекарственным средством или после переливания крови).

Термин «гетероантитело» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к одному или более чем одному антителу, продуцируемому от субъекта, направленному против одного или более чем одного антигена от другого вида.

Термин «холодный агглютинин» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антителам, которые вызывают агглютинацию эритроцитов при низких температурах.

Термин «реакция определения группы крови» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к анализу, который проводится перед переливанием крови для определения того, совместимы ли эритроциты донора с кровью или плазмой намеченного реципиента.

Противовирусные, антибактериальные и антипаразитарные антитела, выявленные и/или идентифицированные устройством in vitro, представляют собой иммунные антитела, продуцированные против вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов при инфекции субъекта.

Устройство in vitro по настоящему изобретению также можно использовать для выявления присутствия патогенного агента посредством определения присутствия одного или более чем одного вирусного, бактериального или паразитарного антигена.

• Способы по изобретению

Устройство in vitro по изобретению особенно подходит для применения в способах in vitro выявления и/или идентификации антигенов, выбранных из группы, содержащей антигены эритроцитов, включающие смешанную полевую популяцию, эритроциты, сенсибилизированные in vivo (также именуемые C3d-позитивными клетками), антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены, паразитарные антигены, или для выявления и/или идентификации антител к эритроцитам, включая сенсибилизированные in vivo эритроциты (IgG-позитивные клетки), и/или антител к тромбоцитам, и/или антител, направленных против вирусных, бактериальных и паразитарных антигенов, которые продуцируются в крови против вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов при инфекции субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антигенов эритроцитов, включая смешанную полевую популяцию и/или сенсибилизированные in vivo эритроциты (C3d-позитивные клетки), и/или антигены тромбоцитов из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- добавление раствора, содержащего указанный образец, на реакционную область устройства in vitro согласно изобретению и

- считывание до промывки для контроля загрузки образца;

- нанесение промывочного раствора на реакционную область и

- определение присутствия указанных антигенов или клеток крови посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антигенов или клеток крови посредством определения отсутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Согласно одному воплощению перед нанесением образца, подлежащего анализу, на реакционную область, содержащую шарики, можно продолжать с гидратацией реакционной области, которая уже была сделана гидрофильной, посредством буферного раствора. Данный буфер может содержать раствор с рН, стабилизированным от рН 6 и рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, в частности, от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 250 мОсм до 800 мОсм, предпочтительно от 300 мОсм до 600 мОсм. Данный раствор возможно может содержать поверхностно-активное вещество в низкой концентрации (Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.), насыщающие агенты (BSA) (бычий сывороточный альбумин) и/или агенты, способные потенцировать реакции антиген-антитело. Данный буфер возможно может иметь протеазную активность, например, полученную добавлением ферментов, таких как папаин или бромелаин. Данный буфер возможно может содержать поликатионные агенты, такие как полибрен или полилизин, для потенцирования реакции и поддержания эритроцитов в более длительном контакте с захватывающими элементами.

Описанный выше способ in vitro, таким образом, возможно включает стадию гидратации пористой мембраны перед добавлением анализируемого образца.

Согласно другому воплощению описанный выше способ in vitro также включает другую возможную стадию разведения эритроцитов, подлежащих фенотипированию, в буферном растворе, в частности, в буферном растворе, известном как благоприятный для иммуногематологических реакций, возможно содержащем добавки, такие как, например, буфер, содержащий раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, в частности, от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 250 мОсм до 800 мОсм, предпочтительно от 300 мОсм до 600 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (в частности, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.), насыщающие агенты (например, BSA) и/или агенты, способные потенцировать реакции антиген-антитело. Данный буфер возможно может иметь протеазную активность, например, полученную добавлением ферментов, таких как папаин или бромелаин. Данный буфер возможно может содержать поликатионные агенты, такие как полибрен или полилизин, для потенцирования реакции и поддержания глобул в более длительном контакте с захватывающим элементом.

Согласно еще одному другому воплощению данный способ по изобретению, описанный выше, возможно включает дополнительную стадию инкубирования анализируемого образца перед нанесением его на реакционную область, предпочтительно при температуре от 15 до 40°С, в частности, от 18°С до 37°С, в течение периода от 2 с до 30 мин и, в частности, от 1 мин до 20 мин.

Аналогично, для считывания результатов необходимо применять стадию промывки буфером. Промывочный буфер предпочтительно содержит PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), TBS (солевой буфер с Tris) или физиологический раствор с рН от 2 до 10, предпочтительно от 5 до 9. Осмолярность данного буфера должна контролироваться для того, чтобы избегать гемолиза эритроцитов. Данный буфер должен быть выбран таким образом, чтобы не отделять выявляющие агенты или окрашенные аналиты, напрямую или опосредованно фиксированные на захватывающих агентах (антитела, фиксированные и/или адсорбированные на поверхности шариков). Неожиданно то, что для применения устройства in vitro по изобретению предпочтительно использовать слегка гиперосмотические промывочные растворы (то есть, от 300 мОсм до 800 мОсм), полученные посредством присутствия солевых агентов, таких как NaCl, или неионных осмолитов, таких как, например, глицин или таурин. Данный буфер возможно может быть окрашен красителями, контрастирующими с цветом выявляющего агента. Например, если выявляющие агенты представляют собой эритроциты, раствор промывочного буфера может иметь синий или зеленый цвет. В промывочный раствор также можно добавлять низкую дозу поверхностно-активного вещества для устранения фонового шума. Данные поверхностно-активные вещества предпочтительно представляют собой неионные поверхностно-активные вещества и, в частности, сложные эфиры сахара, в частности, сложные эфиры полиоксиэтилена и сорбитана (Tween).

Во время применения устройства in vitro можно наносить жидкости, особенно посредством пипеточной системы или посредством капиллярной системы повышенной производительности.

В указанном способе in vitro обеспечением гидрофильности реакционных областей пористой мембраны устройства in vitro по изобретению может быть обеспечение гидрофильности по толщине, т.е. обеспечение гидрофильности осуществляется по всей толщине пористой мембраны.

Обеспечение гидрофильности может осуществляться посредством водного раствора Triton Х100 в концентрации от 0,01% масс./об. до 5% масс./об., предпочтительно от 0,1% масс./об. до 3% масс./об., предпочтительно от 0,5% масс./об. до 2% масс./об. в объеме от 0,1 мкл до 5 мкл, предпочтительно от 0,3 мкл до 3 мкл и более предпочтительно от 0,5 мкл до 2 мкл.

В некоторых приложениях при применении Triton обеспечение гидрофильности пористой мембраны может быть частичным, таким образом, что оно не осуществляется по всей толщине мембраны.

Если эритроциты, присутствующие в образце, несут антиген (антигены эритроцитов или антитела, фиксированные на сенсибилизированных in vivo эритроцитах), распознаваемый специфичным антителом, фиксированным или адсорбированным на поверхности шарика, данные эритроциты остаются иммобилизованными на поверхности шарика, расположенного на реакционной области, несмотря на промывку, и данная реакционная область остается красной или розовой. Если эритроциты, присутствующие в образце, не несут антиген, распознаваемый антителом, фиксированным или адсорбированным на поверхности шарика, данные эритроциты смываются промывочным раствором, и реакционная область остается бесцветной.

Считывание результатов может быть визуальным или автоматическим.

Выявление и/или идентификация эритроцитов, сенсибилизированных in vivo, обеспечивает выявление аутоантител или аллоантител, адсорбированных на поверхности эритроцитов. В частности, данное выявление основывается на применении шариков, связанных с антителами против иммуноглобулинов (анти-IgG) или антителом против C3d (для IgM), которые будут захватывать эритроциты, подлежащие анализу, через IgG или C3d (образование которого индуцируется IgM), фиксированные на их мембране.

Преимущественно для устройства по изобретению не требуется ни центрифугирование, ни встряхивание, ни приложение вакуума, ни специализированное устройство. Его также можно полностью автономно использовать вручную и легко автоматизировать на роботах.

Кроме того, авторы изобретения также продемонстрировали то, что устройство in vitro по настоящему изобретению можно использовать в способе in vitro выявления и/или идентификации антител к эритроцитам (аллоантител, аутоантител и холодного агглютинина) из образца биологической жидкости, в частности, из образца крови или компонентов крови.

Другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антител к эритроцитам из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером и тест-эритроцитами известного фенотипа,

- нанесение данной смеси на реакционную область устройства in vitro по изобретению,

- нанесение на реакционную область промывочного раствора и

- определение присутствия антител к эритроцитам посредством определения присутствия реакции антитело/антиген, если в реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия реакции антитело/антиген, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Данную стадию инкубирования можно проводить в присутствии агента, способного агрегировать эритроциты, при температуре от 4 до 40°С в течение периода от 3 до 60 мин, предпочтительно от 5 до 30 мин. Специалист смог бы определить данную температуру, в зависимости от антитела, подлежащего выявлению и/или идентификации.

Буфер, используемый на стадии инкубации, представляет собой буфер с низкой ионной силой, такой как буфер LISS (например, содержащий меньше, чем 50 мМ NaCl).

Согласно одному воплощению данного способа в смесь, полученную на стадии инкубации, можно добавлять агент, способный агрегировать эритроциты, например, раствор гексадиметрина бромида, предпочтительно гексадиметрина бромид в концентрации в растворе от 0,01 до 2% (масс./об.), даже более предпочтительно от 0,05 до 0,5%. Гексадиметрина бромид стимулирует агрегацию эритроцитов.

Согласно другому воплощению способа выявления и/или идентификации антител к эритроцитам человеческий антиглобулин или реактив против комплемента может быть нанесен на реакционную область после нанесения агента, способного агрегировать эритроциты.

Промывочный раствор, используемый для промывки реакционной области, может быть таким, как, например, гипертонический физиологический раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, предпочтительно от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 300 мОсм до 800 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (например, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.) и краситель цвета, контрастирующего с красным (синего или зеленого).

Образец, подлежащий нанесению, может быть плазмой, сывороткой или цельной кровью, или компонентами крови, разбавленными или не разбавленными в буфере, содержащем раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, в частности, от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 250 мОсм до 800 мОсм, предпочтительно от 300 мОсм до 600 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (например, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.), насыщающие агенты (особенно BSA) и/или агенты, способные потенцировать реакции антиген-антитело. Данный буфер предпочтительно имеет солесодержание меньше, чем 50 мМ за счет NaCl.

Если анализируемая плазма содержит антитела, направленные против антигена, присутствующего в выявляющем агенте (тест-эритроциты), в реакционной области появляется красное (или розовое) пятно. Бесцветный центр означает отсутствие или невыявляемую дозу антител, направленных против антигена, присутствующего в выявляющем агенте (тест-эритроциты).

Считывание результатов может быть визуальным или автоматическим.

Другой аспект настоящего изобретения, кроме того, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антител к тромбоцитам из образца крови или образца компонентов крови, включающий следующие стадии:

- инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером и тест-тромбоцитами известной антигенности или инкубирование плазмы или сыворотки реципиента с тромбоцитами донора,

- нанесение данной смеси на реакционную область устройства in vitro по изобретению,

- нанесение на реакционную область промывочного раствора и

- определение присутствия антител к тромбоцитам посредством определения присутствия взаимодействия антитело/антиген, если в реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия взаимодействия антиген/ антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Устройство in vitro по изобретению также можно использовать в способе in vitro выявления и/или идентификации другого типа ангигенов, выбранных из группы, содержащей вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены.

Еще один другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации ангигенов, выбранных из группы, содержащей вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- возможно инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером,

- добавление раствора, содержащего указанный образец или смесь данного образца с буфером, на реакционную область устройства in vitro по изобретению,

- возможно считывание перед промывкой для контроля загрузки образца;

- возможно нанесение на реакционную область промывочного раствора и

- определение присутствия указанного антигена посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, предпочтительно если в реакционной области появляется окрашенное пятно, или определение отсутствия указанных антигенов посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, предпочтительно если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Стадию инкубации можно проводить в присутствии агента, способного усиливать реакцию, при температуре от 4 до 40°С, в течение периода от 3 до 60 мин, предпочтительно от 5 до 30 мин. Специалист смог бы определить подходящую темературу, в зависимости от антитела или антигенов, подлежащих выявлению и/или идентификации.

Буфер, используемый на стадии инкубирования, представляет собой буфер с молекулой для усиления реакции.

Образец, подлежащий нанесению, может быть биологической жидкостью, например: плазма, сыворотка или цельная кровь или компоненты крови, разведенные или не разведенные в буфере, содержащем раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, в частности, от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 250 мОсм до 800 мОсм, предпочтительно от 300 мОсм до 600 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (например, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.), насыщающие агенты (особенно BSA) и/или агенты, способные потенцировать реакции антиген-антитело. Данный буфер предпочтительно имеет солесодержание меньше, чем 50 мМ за счет NaCl.

Промывочный раствор, используемый для промывки реакционной области, может быть таким, как, например, гипертонический физиологический раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, предпочтительно от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 300 мОсм до 800 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (например, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.).

Выявление взаимодействия антиген/антитело может осуществляться предпочтительно посредством применения окрашенных шариков или HRP (пероксидаза хрена), связанной с антителами или другой молекулой, которая взаимодействовала бы с соответствующими антигенами патогена.

Специалист смог бы определять другие способы мечения, обеспечивающие выявление и/или идентификацию указанных антигенов.

Если анализируемая плазма содержит антигены, направленные против антитела, присутствующего в выявляющем агенте, в реакционной области появляется бесцветное пятно. Бесцветный центр означает отсутствие или невыявляемую дозу антигенов, направленных против антитела, присутствующего в выявляющем агенте.

Считывание результатов может быть визуальным или автоматическим.

Как указано выше, антитела, направленные против антигенов, выбранных из группы вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов, также могут быть выявлены и/или идентифицированы с использованием устройства in vitro по настоящему изобретению. На самом деле, в большинстве случаев, когда присутствие или отсутствие патогена (вируса, бактерии или паразита) определяется, например, во время переливания крови, оно идет посредством определения и/или идентификации антител, продуцируемых инфицированным субъектом, направленных против указанных антигенов. Данные антитела также упоминаются в настоящей заявке как иммунные антитела, продуцированные против вирусных, бактериальных или паразитарных антигенов при инфекции субъекта. Они могут циркулировать в крови инфицированного субъекта.

Таким образом, согласно еще одному другому аспекту устройство in vitro по изобретению также может использоваться в способе in vitro выявления и/или идентификации разных антител, направленных против вирусных антигенов, бактериальных антигенов и паразитарных антигенов, которые продуцируются при инфекции субъекта.

Еще один другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу in vitro выявления и/или идентификации антител, выбранных из группы, содержащей антитела, направленные против вирусных антигенов, бактериальных антигенов и паразитарных антигенов, предпочтительно указанные антитела продуцируются при инфекции из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающему следующие стадии:

- возможно инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером

- добавление раствора, содержащего указанный образец или смесь образца с буфером, на реакционную область устройства in vitro по изобретению,

- возможно считывание перед промывкой для контроля загрузки образца;

- возможно нанесение промывочного раствора на реакционную область и

- определение присутствия указанных антител посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, предпочтительно, если в реакционной области появляется окрашенное пятно, или определение отсутствия указанного антитела посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, предпочтительно, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

Стадия инкубирования может проводиться в присутствии агента, способного усиливать реакцию, при температуре от 4 до 40°С в течение периода от 3 до 60 мин, предпочтительно от 5 до 30 мин. Специалист смог бы определить подходящую температуру, в зависимости от антитела или антигенов, подлежащих выявлению и/или идентификации.

Буфер, используемый на стадии инкубирования, представляет собой буфер с молекулой для усиления реакции.

Промывочный раствор, используемый для промывки реакционной области, может быть таким, как, например, гипертонический физиологический раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, предпочтительно от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 300 мОсм до 800 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (например, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.).

Образец, подлежащий нанесению, может представлять собой биологическую жидкость, например: плазму, сыворотку или цельную кровь, или компоненты крови, разведенные или не разведенные в буфере, содержащем раствор с рН, стабилизированным от рН 6 до рН 8,5, предпочтительно от рН 6,5 до рН 7,8, в частности, от рН 7 до рН 7,5, и осмолярностью от 250 мОсм до 800 мОсм, предпочтительно от 300 мОсм до 600 мОсм. Данный раствор возможно может содержать детергенты в низкой концентрации (например, Tween 20 от 0,01 до 0,05% масс./об.), насыщающие агенты (например, BSA) и/или агенты, способные потенцировать реакции антиген-антитело. Данный буфер предпочтительно имеет солесодержание меньше, чем 50 мМ на основе NaCl.

Если анализируемая плазма содержит антитела, направленные против антигена, присутствующего в выявляющем агенте, в реакционной области появляется бесцветное пятно. Бесцветный центр означает отсутствие или невыявляемую дозу антител, направленных против антигена, присутсвующего в выявляющем агенте.

Выявление реакции антитело/антиген предпочтительно проводится посредством применения цветных шариков или HRP (пероксидаза хрена), связанных с антителами или молекулой, которая взаимодействовала бы с соответствующими антигенами патогенов.

Специалист смог бы определить другие способы мечения, обеспечивающие выявление и/или идентификацию указанного антитела.

Считывание результатов может быть визуальным или автоматическим.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: а. Диаграмма конкретного воплощения устройства in vitro по изобретению, рассматриваемого в перспективе, указанное устройство содержит пористую мембрану, включающую реакционную область, на которую наносят несколько шариков, имеющих размер 9 мкм, на поверхности которых напрямую или опосредованно фиксированы или адсорбированы антитела или антигены. Под мембраной показаны три слоя: слой дренажного вещества, слой абсорбирующего вещества и слой пены. На Фиг. 1 также показан полученный посредством сканирующей электронной микроскопии (SEM) вид среза пористой мембраны, содержащей шарики и антитела, фиксированные на их поверхности, б. Схема конкретного воплощения устройства in vitro по изобретению, причем указанное устройство содержит подложку, на которой располагается пористая мембрана, включающая сделанную гидрофильной реакционную область, на которую наносят несколько шариков, на поверхности которых фиксированы антитела. Такие же слои, как и слои, показанные на Фиг. 1а, показаны под пористой мембраной.

Фиг. 2: сравнительные анализы выявления антигенов эритроцитов с использованием Анти-АВО01, Анти-АВО02, Анти-АВО03, Анти-RH1, Ahth-RH2, Ahth-RH3, Ahth-RH4, Ahth-RH5, Анти-KEL1 и негативного контроля посредством такого устройства in vitro, как описанные в WO2013/186482 (Фиг. 2а), и устройства in vitro по настоящему изобретению (Фиг. 2б).

Фиг. 3: выявление антигенов эритроцитов АВО01, АВО02 и АВО3 посредством антитела IgM, опосредованно фиксированного на латексных шариках через белок на белке A/G/L.

Фиг. 4а и b: выявление антигена эритроцитов АВО01 посредством антитела IgM, связанного с AHG (антитело против человеческого глобулина), связанного с хлорметильными латексными шариками, с двумя разными объемами шариков, связанных с антителами, загруженных на мембрану (а: 20 мкл и b: 10 мкл). end: выявление антигена эритроцитов АВО01 посредством антитела IgG, связанного с AHG, связанным с хлорметильными латексными шариками, с двумя разными объемами шариков, связанных с антителами, загруженных на мембрану (с: 20 мкл и d: 10 мкл).

Фиг. 5: выявление антигенов эритроцитов с использованием специфичного антитела IgM, связанного с AHG, связанным с эпоксидными шариками, (антигены a: RH2; b: RH3; с: RH4; d: RH5; е: KEL1 и f: негативный контроль).

Фиг. 6: выявление антигенов эритроцитов FY1 и RH1 специфичными антителами IgG, связанными с AHG (антитело против человеческого глобулина), связанными с NHS агарозными шариками, при условиях, описанных а Примере 3. а. b. и с. представляют разные методики выявления, и d. разные устройство для реакции и методику выявления.

Фиг. 7: выявление антигенов эритроцитов АВО02 и смешанных полевых популяций разными количествами (от 1 до 5%) анти-АВО02, связанных с 9 мкм альдегид-латексными шариками, загруженными на пористую мембрану.

Фиг. 8: а. Выявление антигенов эритроцитов АВО01, RH2, RH5 и KEL1 посредством разных количеств специфичных антител, связанных с 9 мкм альдегид-латексными шариками (от 0,125 до 4%), на устройстве, содержащем мембрану толщиной 1,5 мм. b. Выявление антигенов эритроцитов АВО01, RH2 и KEL1 посредством специфичных антител, связанных с 9 мкм альдегид-латексными шариками (4%), на устройстве, содержащем мембрану толщиной 0,6 мм.

Фиг. 9: выявление антигена эритроцитов ABO1 специфичными антителами, связанными с 9 мкм альдегид-латексными шариками, загруженными на устройство in vitro, содержащее мембрану толщиной 0,6 мм, сделанную гидрофильной с использованием a. Triton Х-100, b. полиоксиэтилена и с. нонил-β-й-глюкозида.

Фиг. 10: а. Выявление антигена эритроцитов RH2 специфичными антителами, связанными на 9 мкм альдегид-латексных шариках на устройстве, содержащем Т-499 (слева) или SCP-300-TCF (справа) в качестве абсорбента. b. Выявление антигена эритроцитов RH2 специфичными антителами, связанными с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками, на устройстве, содержащем Т-099 (слева) или Т-499 (справа) в качестве абсорбента, с. Выявление антигена эритроцитов RH2 специфичными антителами, связанными на 9 мкм альдегид/сульфатных латексных шариках, на устройстве, содержащем Т-499 (слева) или Т-183-5 (справа) в качестве абсорбента, d. Выявление антигена эритроцитов RH2 специфичными антителами, связанными с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками, на устройстве, содержащем Т-499 (слева) или SCP-200-TCF (справа) в качестве абсорбента. Для каждого изображения устройство показано разобранным; сверху вниз: мембрана на пластмассовом устройстве и абсорбент.

Фиг. 11: а. Выявление антигена эритроцитов АВО02 антителом против АВО03, связанным с 9 мкм альдегид-латексными шариками, на устройстве, содержащем вату в качестве дренажного слоя. b. Выявление антигена эритроцитов АВО02 антителом против АВО03, связанным с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками, на устройстве, содержащем NT 9750 HY в качестве дренажного слоя. с. Выявление антигена эритроцитов АВО02 антителом против АВО03, связанным на 9 мкм альдегид/сульфатных латексных шариках, на устройстве, содержащем NT 9610 HY в качестве дренажного слоя. Для каждого изображения устройство показано разобранным; сверху вниз: мембрана, дренажный слой и абсорбент.

Фиг. 12: а. и с. Выявление антигенов эритроцитов АВО01 или АВО02 посредством антитела IgM (анти-АВО01 и анти-АВО02), связанного с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками. b. и d. Интерпретация сигнала, обеспечивающая различение смешанных полевых популяций.

Фиг. 13: а. Выявление слабых антигенов RH1: разные типы слабых эритроцитов RH1 (Df1, Df2, …) захватываются антителом против RH1 (клоны НМ16 и ESD1), фиксированным на белке A/G/L, связанном с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками. b. Выявление антигенов Duffy (FY1 и FY2), KIDD (JK1 и JK2) и MSN (системы MNS3 и MNS4): позитивные эритроциты захватываются специфичными антителами, фиксированными на белке A/G/L, связанном с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками.

Фиг. 14: обратное определение группы, анализируемые эритроциты известного фенотипа (А1, А2, В и О) инкубируются с плазмой и захватываются антителом против человеческого IgM (клоны CP6D4), связанным с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками.

Фиг. 15: прямая проба Кумбса: а. Эритроциты, сенсибилизированные IgG, захватываются антителами против человеческих глобулинов (клоны SA6532, СРС5-1 и 188 33), связанными с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками. b. Позитивные эритроциты захватываются антителом против человеческого глобулина (SA6532) и/или антителом против человеческого C3d (С7610), связанным с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками, с. Позитивные эритроциты фиксируются на антителе потив человеческого глобулина (SA6532) и/или антителе против человеческого C3d (С7610) и захватываются на белке A/G/L, связанном с 9 мкм альдегид/сульфатными латексными шариками.

Фиг. 16: выявление антител, специфичных в отношении антигена MSP1 Plasmodium falciparum, а. Применение устройства по изобретению со способом выявления с HRP. b. Применение устройства по изобретению с 1 мкм шариками красного цвета в качестве способа выявления, с. Применение устройства по изобретению с наночастицами коллоидного золота в качестве способа выявления. Для каждого примера показаны негативная и позитивная реакция, а также количественное измерение интенсивности сигнала (п равно 3-5).

Фиг. 17: выявление антител, специфичных в отношении антигенов р15, р17 и р47 Treponema pallidum с использованием устройства по изобретению с 1 мкм шариками красного цвета в качестве способа выявления. Показаны негативная и позитивная реакция, а также количественное измерение интенсивности сигнала (п равно 3).

Фиг. 18: выявление антител, специфичных в отношении антигена HBsAg из вируса гепатита В с использованием устройства по изобретению с 1 мкм шариками красного цвета в качестве способа выявления. Показаны негативная и позитивная реакция, а также количественное измерение интенсивности сигнала (n равно 3).

Фиг. 19: выявление антигена HBsAg из вируса гепатита В. а. Использование устройства по изобретению с HRP (пероксидаза хрена) в качестве способа выявления (график и фотография). b. Использование устройства по изобретению с 1 мкм шариками красного цвета в качестве способа выявления. Для каждого примера показаны негативная и позитивная реакция, а также количественное измерение интенсивности сигнала (n равно 3).

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: типирование и фенотипирование эритроцитов в устройстве in vitro с прямым и непрямым связыванием антител к эритроцитам на шариках посредством антител к иммуноглобулинам IgM и IgG

1. Протокол для получения устройства in vitro, которое содержит на поверхности реакционной области антитела к эритроцитам, непосредственно нанесенные на мембрану.

1.1. Материалы для получения устройства in vitro:

- 0,6 мм гидрофобная мембрана «POREX» с пористостью от 9 до 12 мкм; хлопок;

- Cleanis;

- Буфер для обеспечения гидрофильности (1% Triton, 1% зеленый краситель, фосфатно-солевой буферный раствор).

- Промывочный буфер (состав TLA);

- Буфер для разведения (Chromasolcoombs);

- Антитела (анти-АВО01, анти-АВО02, анти-АВО03, анти-RHI, анти-RH2, анти-RH3, анти-RH4, анти-RHS, анти-KEL1, негативный контроль).

1.2. Способ приготовления реакционной среды:

- внести в каждую лунку 1 мкл раствора, обеспечивающего гидрофильность;

- сушка 16 часов при 37°С и 10%-ной влажности;

- внести 2 мкл антитела на лунку;

- сушка 72 часа при 37°С и 10%-ной влажности.

Материалами для осуществления анализа являются подложка для реакции, промывочный буфер и буфер для разведения.

1.3. Воплощение анализа:

- развести осадок эритроцитов до 20% в буфере для разведения;

- внести 20 мкл суспензии в лунки;

- инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре;

- внести 80 мкл промывочного буфера;

- инкубировать 1 мин при комнатной температуре;

- внести 80 мкл промывочного буфера.

2. Протокол для получения устройства in vitro с прямым и непрямым связыванием антител к эритроцитам на шариках посредством антител против иммуноглобулинов IgM и IgG.

2.1. Протокол для прямого связывания антител против АВО01 (анти-А), против АВО02 (анти-В) и против АВО03 (анти-АВ) с латексными шариками.

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм альдегид/сульфатные латексные шарики от Thermo Fisher, 4% масс./об.) добавляют 100 мкл 20× фосфатно-солевого буферного расвора, и растворяют 2 мл концентрированных антител. Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе антител на шариках 150 мкл 1 М этаноламина, с последующим смешиванием в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец, осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере с получением массы введенного раствора шариков.

2.2. Протокол непрямого связывания антител против RH1, против RH2, против RH3, против RH4, против RH5 и против KEL1

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков добавляют 200 мкл 20× фосфатно-солевого буферного раствора и растворяют 250 мкл 6D4 (антитело против человеческого IgM, клон Diagast) в концентрации 1 мг/мл или 100 мкл С5-1 (антитело против человеческого IgG, клон Diagast) в концентрации 3,69 мг/мл. Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе антител на шариках 150 мкл 1 М этаноламина, с последующим смешиванием в течение 2 часов при комнатной температуре. Шарики со связанным антителом к человеческому глобулину (AHG) затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Осадок шариков ресуспендируют с 2 мл концентрированного антитела плюс 2 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Образующиеся шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец, осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере с получением массы введенного раствора шариков. Шарики негативного контроля прямо насыщают этаноламином.

Клоны антител, использованные в Примерах, показаны в Таблице 4 ниже:

Клоны антител в Таблице 4 представляют собой клоны, полученные и продаваемые заявителем (Diagast, Франция).

2.3. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (NA7150 PES от Subrenat) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% Triton Х-100; 0,5% зеленого красителя и 0,13 М сахарозы) и потенциально сушат в течение 1 часа при 37°С, 10%-ной влажности. Затем наносят в виде пятен 5 мкл шариков, связанных с антителом или негативным контролем, в концентрации 4%, и данное устройство сушат в течение 1 часа при 37°С, 10%-ной влажности перед немедленным применением или длительной консервацией.

Анализ инициируется посредством разведения эритроцитов в концентрации 5% в Chromasolcoombs (препарат Diagast), и 10 мкл вводят в каждую лунку, с последующими двумя 30 мкл промывками (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,2% Tween 20 и 0,54% зеленого красителя).

В данном примере заявитель также сравнил устройство in vitro, содержащее антитела к эритроцитам, связанные с шариками, для определения групп крови и фенотипирования, полученные описанным выше протоколом, с устройством in vitro, в котором антитела к эритроцитам непосредственно наносятся в виде пятен на пористую мембрану (аналогично антителам, описанным в WO2013/186482).

3. Результаты

Полученные сравнительные результаты показаны на Фиг. 2, где присутствие темно-серого пятна (соответствующего красному пятну в цветной версии) указывает на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию (присутствие антигена на поверхности эритроцита), тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию (отсутствие антигена на поверхности эритроцита).

Из Фиг. 2 очевидно, что антитела групп крови анти-АВО01, анти-АВО02, анти-АВО03, анти-RH1, анти-RH2, анти-RH3, анти-RH4, анти-RH5 и анти-KEL1, напрямую или опосредованно фиксированные на поверхности шарика, специфично связываются с соответствующими антигенами, присутствующими на поверхности эритроцитов проанализированных образцов. В самом деле, поверхность пятна, где были нанесены шарики, остается хорошо окрашенной красным, что указывает на то, что антитела к эритроцитам не адсорбируются пористой мембраной, что обеспечивает специфичное и чувствительное выявление антигенов эритроцитов (Фиг. 2b).

Из Фиг. 2а можно видеть то, что в устройстве in vitro без шариков реакции с некоторыми антителами, в частности, с антителами против RH1, против RH3, против RH4, против RH5 и против KEL1, имеют низкие чувствительности (очень низкая интенсивность темно-серого).

При сравнении результатов на Фиг. 2b, полученных с устройством in vitro по изобретению, с результатами Фиг 2а, полученными с устройством in vitro без шарика, оказывается, что серые пятна для антител против RH1, против RH3, против RH4, против RH5 и против KEL1 значительно лучше видны на Фиг. 2b, чем пятна Фиг. 2а, что демонстрирует то, что устройство in vitro по изобретению позволяет получать более чувствительное выявление большинства антигенов эритроцитов.

ПРИМЕР 2: непрямое (опосредованное) связывание антител к эритроцитам посредством аффинных белков к антителам

1. Непрямое (опосредованное) связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% латексных шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.) добавляют 5 или 2,5 мкг белка AGL, растворенного в 3 мл 1× PBS. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

На 1 мл центрифугированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об., связанные с белком AGL) добавляют 3 мл 1× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 1 мл антитела против АВО01 (клон Diagast 91 13 D10) или антитела против АВО02 (клон Diagast 96 21 А8), или против АВО03 (клон Diagast 152D12). Данный раствор перемешивают переворачиванием для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 М сахарозой) с получением массы введенного раствора шариков.

2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанным антителом в концентрации 2%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл эритроцитов, разведенных в концетрации 1,5% в 1× PBS, дополненном 0,00625% Tween 20.

Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Получают изображение после промывки.

3. Результаты

На Фиг. 3 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающее на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

Пример 3: связывание антител эритроцитов на шариках, имеющих разные химические функциональные группы на их поверхности и разный размер в разных условиях реакции

1. Хлорметильная группа

1.2. Связывание антител

На 500 мкл гомогенизированных хлорметильных шариков (хлорметильные латексные шарики от Thermo Fisher, 4% масс./об., 2,0 мкм) добавляют 1,5 мл фосфатного буфера, и полученный раствор центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин. Супернатант отбрасывают, и осадок шариков затем ресуспендируют со смесью 950 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и 50 мкл концентрированного СРС51 или CP6D4 (Diagast AHG). Раствор шариков с антителом инкубируют в течение ночи при комнатной температуре на качалке для пробирок.

После химического связывания AHG раствор шариков центрифугируют при 3000 g в течение 15 мин, и супернатант отбрасывают. Шарики промывают 1,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора, и данный раствор центрифугируют при 3000 g в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, и избыток активных групп блокируют добавлением 1 мл 1 M этаноламина перед перемешиванием в течение 20 мин при комнатной температуре. Раствор шариков со связанным AHG центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин перед промывкой 1,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора. 1 мл концентрированных антител против А (анти-ABO1) (клоны IgM 91 13 D10 или IgG 162 47 (3) Е6, оба клона от Diagast) растворяют на осадке шариков, и данный раствор перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре перед центрифугированием и промывкой 1,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

1.2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 2,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фильтрованная вода, дополненная 1% Triton Х-100), и затем наносят в виде пятен 20 мкл (Фиг. 4А и 4С) или 10 мкл (Фиг. 4 В и 4D) антител, связанных с шариками, в концентрации 4%. Данному устройству дают постоять 30 мин при комнатной температуре перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 13 мкл смеси 30 мкл эритроцитов в концетрации 10% в chromasolcoombs (препарат Diagast) и 10 мкл раствора гексадиметрина бромида.

Реакционную зону дважды промывают 25 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,1% Tween 20.

1.3. Результаты

На Фиг. 4 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серого пятна (соответствующего красному пятну на цветном изображении), указывающее на образование иммунного комплекса (эритроциты группы А) и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию (эритроциты группы В).

2. Эпоксидная группа

2.1. Связывание антител

0,5 г эпоксидной смолы (эпоксидная смола Biorad Profinity, поставленная в виде сухого порошка, размер частиц 45-90 микрометров) взвешивают и обеспечивают ее набухание в 50 мл фосфатно-солевого буферного раствора в течение 30 мин при легком встряхивании. Увеличивают объем раствора шариков до 5 мл, что дает раствор с концентрацией приблизительно 10%.

Шарики центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин, супернатант отбрасывают, и осадок ресуспендируют в 4,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора, затем вновь центрифугируют.

360 мкл концентрированного антитела против IgM AHG (CP6D6 Diagast) растворяют в 12 мл фосфатно-солевого буферного раствора, и данную смесь добавляют на осадок шариков для связывания. Раствор шариков с антителом инкубируют 1 ч 30 мин при комнатной температуре на ротационном шейкере.

После химического связывания AHG раствор шариков центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин, и супернатант отбрасывают. Шарики промывают 4,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора, и данный раствор центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин. Супернатант отбрасывают, и избыток активных групп блокируют добавлением 3 мл 1 M этаноламина перед перемешиванием в течение 45 мин при комнатной температуре. Раствор шариков со связанным AHG центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин перед промывкой 4,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора.

300 мкл анти-RH2, анти-RH3, анти-RH4 или анти-RH5 (соответственно клон Diagast Р3Х255 13 G8, клон Diagast RH3 906, клон Millipore MS33 и клон Diagast P3GD С512) разводят в 2200 мкл фосфатно-солевого буферного раствора и добавляют на шарики со связанным AHG. Для антитела против Kell 1500 мкл разводят в 1000 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, и для негативного контроля используют 2500 мкл фосфатно-солевого буферного раствора. Полученный раствор перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре перед центрифугированием и промывкой. Наконец осадок шариков ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе с консервантами с получением 50%-ного раствора связанных шариков.

2.2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фильтрованная вода, дополненная 1% Triton Х-100) и сушат в течение ночи при комнатой температуре. Затем наносят в виде пятен 10 мкл шариков со связанным антителом, в концентрации 50%. Данному устройству дают постоять 30 мин при комнатной температуре перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 10 мкл неразведенных эритроцитов. Реакционную зону дважды промывают 40 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20 и консервантами.

2.3. Результаты

На Фиг. 5 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию. Каким бы ни был фенотип эритроцитов, негативный контроль приводит к бесцветному пятну.

3. N-гидроксисукцинимидная (NHS) группа

3.1. Связывание антител

1 мл шариков NHS (активированная NHS агарозная суспензия Pierce™) разводят 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора, центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин, супернатант отбрасывают, и осадок ресуспендируют в 4,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора для 3 дополнительных промывок.

2 мл концентрированных антител к IgG AHG (С51 Diagast) растворяют в 3 мл фосфатно-солевого буферного раствора, и данную смесь добавляют на осадок шариков для связывания. Раствор антитела с шариками инкубируют полтора часа при комнатной температуре на ротационном шейкере.

После химического связывания AHG раствор шариков центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин, и супернатант отбрасывают. Шарики промывают 4,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора, и данный раствор центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин. Супернатант отбрасывают, и избыток активных групп блокируют добавлением 3 мл 1 M этаноламина перед перемешиванием в течение 45 мин при комнатной температуре. Раствор шариков со связанным AHG центрифугируют при 2500 g в течение 5 мин перед промывкой 4,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора.

10 мл антител к RH1 и к FY1 (клоны НМ16 и F655 от Diagast соответственно) добавляют на шарики, связанные с AHG. Полученный раствор перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре перед центрифугированием и промывкой. Наконец осадок шариков ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе, дополненном консервантами, с получением 50%-ного раствора связанных шариков.

3.2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Устройство, представленное на Фиг. 6 (А, В и С), представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 2,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фильтрованная вода, дополненная 1% Triton Х-100) и сушат в течение ночи при 37°С. Затем наносят в виде пятен 20 мкл шариков со связанным антителом в концентрации 50%. Данному устройству дают постоять 30 мин при комнатной температуре перед применением.

Фиг. 6А: методика выявления инициируется введением в каждую лунку 7 мкл эритроцитов, разведенных до концентрации 25% в 0,25%-ном растворе гексадиметрина бромида. Реакционную зону промывают 20 мкл плюс 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,01% Tween-20.

Фиг. 6В: методика выявления инициируется введением в каждую лунку 5 мкл эритроцитов, разведенных до концентрации 25% в 0,3%-ном растворе гексадиметрина бромида. Реакционную зону промывают 20 мкл плюс 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,01% Tween-20.

Фиг. 6С: методика выявления инициируется введением в каждую лунку 5 мкл эритроцитов, разведенных до концентрации 25% в 0,4%-ном растворе гексадиметрина бромида. Реакционную зону промывают 20 мкл плюс 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,01% Tween-20.

Устройство, представленное на Фиг. 6D, представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Lydall UHMWPE толщиной 105 мкм и с пористостью 12 мкм (Solupor 70М01А), дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 2 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фильтрованная вода, дополненная 1% Triton Х-100) и сушат в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Затем наносят в виде пятен 20 мкл шариков со связанным антителом в концентрации 50%. Данному устройству дают постоять 30 мин при комнатной температуре перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 7 мкл эритроцитов, разведенных до концентрации 25% в 0,25%-ном растворе гексадиметрина бромида. Реакционную зону промывают 30 мкл плюс 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,01% Tween-20, и дополнительными 20 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,1% Tween-20 и 0,007% Triton Х-100.

3.3. Результаты

На Фиг. 6 из полученного в результате изображения наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию (выявление антигена RH1 или FY1), тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

ПРИМЕР 4: концентрация шариков

Целью данного опыта является анализ разных концентраций шариков, подлежащих нанесению на пористую мембрану.

1. Связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.) добавляют 100 мкл 20× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 2 мл аффинно очищенного антитела против АВО02 (клон Diagast 96 21 А8). Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе шариков с антителом 150 мкл 1 M этаноламина и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 1% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 10 мкл шариков со связанным антителом в концентрации от 1 до 5%. Данное устройство сушат в течение 15 мин при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл эритроцитов, разведенных в концентрации 0,15% в Chromasolcoombs, дополненном 0,0625% Tween-20. Реакционную зону промывают один или два раза 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20.

3. Результаты

На Фиг. 7 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию (эритроциты группы АВО02), тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию. Специфичность и чувствительность соблюдаются для концентрации шариков, варьирующей от 1 до 5%, после одной или двух промывок. Смешанные полевые клетки крови выявляются посредством уменьшения интенсивности по сравнению с сигналом на 100% позитивной популяции.

ПРИМЕР 5: толщина пористой гидрофобной мембраны

1. Связывание антител

1.1. Связывание анти-АВО01

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermofisher, 4% масс./об.), добавляют 100 мкл 20× фосфатного буфера, и растворяют 2 мл аффинно очищенного антитела против АВО01 (клон Diagast 25 21 В8). Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе шариков с антителом 150 мкл 1 M этаноламина и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 M сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

1.2. Связывание анти-RH2, анти-RHS и анти-KEL1

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков добавляют 200 мкл 20× PBS, и растворяют 250 мкл 6D4 (антитело против человеческого IgM) для анти-RH2 и анти-RH5 (соответственно клоны Diagast Р3х255 13 G8 и P3GD С512) в концентрации 1 мг/мл или 100 мкл С5-1 (антитело против человеческого IgG) для анти-KEL1 (клон Diagast 601) в концентрации 3,5 мг/мл. Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе шариков с антителом 150 мкл 1 М этаноламина и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные с AHG шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Осадок шариков ресуспендируют с 2 мл концентрированного антитела плюс 2 мл фосфатного буфера. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем дважды промывают 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 М сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

1.3. Получение реакционного устройства и методика выявления

Устройство, показанное на Фиг. 8а, представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 1,5 мм и с пористостью от 7 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 3% Triton Х-100, 0,26 М сахарозы и 1% зеленого красителя). Данное устройство сушат первый раз в течение 1 часа при 37°С, 10%-ной влажности. Затем наносят в виде пятен 5 мкл шариков со связанным антителом в концентрации от 0,125 до 4%. Данное устройство сушат второй раз в течение 1 часа при 37°С, 10%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 10 мкл эритроцитов, разведенных в концентрации 5% в физиологическом растворе. Реакционную зону промывают 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,1% Tween-20 и 0,007% Triton Х-100.

Устройство, показанное на Фиг. 8b, представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (NA7300PES от Subrenat) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0.5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% Triton Х-100, 0,13 М сахарозы и 0,5% зеленого красителя). Данное устройство сушат первый раз в течение 1 часа при 37°С, 10%-ной влажности. Затем наносят в виде пятен 5 мкл шариков со связанным антителом в концентрации 4%. Данное устройство сушат второй раз в течение 1 часа при 37°С, 10%-ной влажности перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 10 мкл эритроцитов, разведенных в концентрации 5% в физиологическом растворе. Реакционную зону промывают 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,1% Tween-20 и 0,007% Triton Х-100.

1.4. Результаты

Присутствие темно-серого пятна (красного пятна) на Фиг. 8а указывает на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию. Чувствительность соблюдаются для концентрации шариков, варьирующей от 4 до 0,125%, со снижением интенсивности.

Присутствие темно-серого пятна (красного пятна) на Фиг. 8b указывает на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

ПРИМЕР 6: тип и концентрация поверхностно-активного вещества, используемого для обеспечения гидрофильности пористой мембраны

1. Связывание анти-АВО01

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.), добавляют 100 мкл 20× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 1 мл аффинно очищенного антитела к АВО01 (клон Diagast 25 21 В8). Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 М сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества, перечисленного ниже:

а. 1,5% Triton Х-100

b. 10% полиоксиэтилен

c. 50 мМ нонил-β-D-глюкозид

Затем наносят в виде пятен 10 мкл шариков, связанных с антителом, в концентрации 3%. Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл эритроцитов, разведенных в концентрации 1,5% в фосфатно-солевом буферном растворе, дополненном 0,00625% Tween-20. Реакционную зону промывают 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20.

3. Результаты

На Фиг. 9 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию. Специфичность соблюдается, какое бы поверхностно-активное вещество ни использовалось.

ПРИМЕР 7: абсорбирующий и дренажный материал, используемый в устройстве по изобретению

1. Абсорбирующий материал

1.1. Связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков добавляют 200 мкл 20× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 250 мкл 6D4 (антитело против человеческого IgM, клон от Diagast). Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе шариков с антителом 150 мкл 1 M этаноламина и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные с AHG шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Осадок шариков ресуспендируют с 2 мл концентрированного антитела против RH2 (клон Diagast Р3Х255 13 G8) плюс 2 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

1.2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (NA7150 PES от Subrenat) и абсорбирующий слой (ссылки от Мс Arlaid ниже).

Используемым адсорбирующим материалом являются следующие:

Т-499 или SCP-300 TCF (Фиг. 10а)

Т-099 или Т-499 (Фиг. 10b)

Т-499 или Т-183-5 (Фиг. 10с)

Т-499 или SCP-200-TCF (Фиг. 10d)

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% Triton Х-100; 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 10 мкл шариков со связанным антителом или негативным контролем в концентрации 1%, и данное устройство сушат в течение 15 мин при 37°С, 20%-ной влажности перед немедленным применением или длительной консервацией.

Анализ инициируется посредством разведения эритроцитов в концентрации 2,5% в chromasolcoombs (препарат Diagast), и 50 мкл вводят в каждую лунку, с последующими двумя 30 мкл промывками буфером (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,2% Tween 20).

1.3. Результаты

Из Фиг. 10а, b, с и d очевидно, что любой из проанализированных абсорбирующих слоев мог гарантировать выявление РН2-позитивного эритроцита (присутствие красного пятна, видимого как темно-серые пятна). Специфичность соблюдается; неокрашенное пятно отражает РН2-негативный эритроцит.

2. Дренажные материалы

2.1 Связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков растворяют 1 мл концентрированного антитела против АВ (клон 152 D12 от Diagast). Объем доводят вплоть до 4 мл фосфатно-солевым буферным раствором. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

2.2. Получение реакционного устройства и методика выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (ссылки ниже) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Дренажным материалом являются следующие:

вата (от Alan &со), показанная на Фиг. 11а

NT 9750 HY(от Subrenat), показанный на Фиг. 11b,

NT 9610 HY (от Subrenat), показанный на Фиг. 11с

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 1% Triton Х-100; 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 10 мкл шариков со связанным с антителом или негативным контролем в концентрации 1%, и данное устройство сушат в течение 15 мин при 37°С, 10%-ной влажности перед немедленным применением или длительной консервацией.

Анализ инициируется посредством разведения эритроцитов в концентрации 2,5% в chromasolcoombs (препарат Diagast), и 50 мкл вводят в каждую лунку, с последующими двумя 30 мкл промывками (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,2% Tween 20).

2.3. Результаты

На Фиг. 11 показано то, что любой из высушивающих слоев мог гарантировать выявление В-позитивного эритроцита (присутствие красного пятна, видимого на данной Фиг. как темно-серое пятно). Специфичность соблюдается; неокрашенное пятно получается с эритроцитами О.

ПРИМЕР 8: определение группы и выявление смешанной полевой популяции с использованием устройства по изобретению

1. Связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.), добавляют 100 мкл 20× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 2 мл антитела против АВО01 (клон Diagast 91 13 D10). Объем доводят вплоть до 4 мл деминерализованной водой. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе шариков с антителом 150 мкл 1 М этаноламина и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (вата от Alan&co) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 1% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 10 мкл шариков со связанным антителом в концентрации 3%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл эритроцитов, разведенных в концетрации 0,15% в Chromasolcoombs, дополненном 0,00625% Tween 20.

Смешанные полевые популяции А и В получали смешиванием, соответственно, эритроцитов А и О или В и О, предварительно разведенных в концентрации 0,15% в Chromasolcoombs в желательных концентрациях (30% эритроцитов О с 70% А или В, или 50% эритроцитов О с 50% А или В).

Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем дважды промывают 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после каждой промывки.

3. Результаты

Как показано на Фиг. 12а и с, перед промывками все пятна оказываются темно-серыми (или красными). Специфичность достигается после второй промывки: присутствие красного пятна (видимого как темно-серое пятно) указывает на образование иммунного комплекса и, следовательно, на позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

На Фиг. 12b и d показано то, что различение между природными и смешанными полевыми популяциями удовлетворяется после интерпретации интенсивности полученных изображений (сигнал до и после двух промывок вычитается).

ПРИМЕР 9: выявление слабых антигенов RH1 и расширенное фенотипирование с непрямым связыванием антител к эритроцитам с шариками посредством аффинных белков к антителам

1. Связывание белка AGL

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков добавляют 50 мкг белка AGL, растворенного в 3 мл 1× PBS. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,25 М сахарозы) для получения массы введенного раствора шариков.

2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества с шариками, связанными с AGL (1,5% Triton Х-100; фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина; 0,25 М сахароза и 5,1% шариков). Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Методика выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл реактива (слабый RH1 или расширенное фенотипирование); добавляют 50 мкл эритроцитов, разведенных в концетрации 1,5% в 1× PBS, дополненном 0,00625% Tween 20.

Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после промывки.

3 Результаты

На Фиг. 13а показано полученное в результате изображение слабого RH1, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, на позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

На Фиг. 13b показано полученное в результате изображение расширенного фенотипирования, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красному пятну на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, на позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

ПРИМЕР 10: обратное определение групп крови посредством антитела 6D4, связанного с шариками

1. Обратное определение групп крови

1.1. Связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.), добавляют 3 мл 1× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 100 мкг антитела CP6D4. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Избыток активных групп блокируют суспендированием в растворе шариков с антителом 150 мкл 1 М этаноламина и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 3 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

1.2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (Subrenat 9610 HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 1,5% Triton Х-100; 0,5% зеленого красителя). 5 мкл шариков со связанным антителом наносят в виде пятен в концентрации 1%, и данное устройство сушат 15 минут при 37°С, 10%-ной влажности перед немедленным применением или длительной консервацией.

Анализ инициируется инкубированием 30 мкл плазмы и 20 мкл эритроцитов (А1; В; А2; О) на протяжении 5 мин. 25 мкл вводят в каждую лунку, с последующим введением 30 мкл промывочного буфера (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,2% Tween 20).

1.3. Результаты

На Фиг. 14 показано присутствие темно-серых пятен (соответствующих красным пятнам), которые указывают на захват сенсибилизированных IgM эритроцитов и, следовательно, на позитивную реакцию обратного определения групп крови, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию (несенсибилизированные эритроциты).

ПРИМЕР 11: анализ DAT (прямая проба Кумбса) с использованием устройства по изобретению

1. Эритроциты, предварительно сенсибилизированные антителами

1.1. Связывание антител

На 3 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.) растворяют 3 мл раствора антитела против человеческого глобулина. Исследуемый AHG представляет собой SA6532 (поликлональные кроличьи антитела, направленные против человеческих IgG), С5-1 (клон Diagast, мышиный IgG, направленный против человеческих IgG) и 188 33 (клон Diagast, мышиный IgM, направленный против человеческих IgG). Данный раствор перемешивают переворачиванием один час для обеспечения связывания.

Суспензию шариков центрифугируют 5 мин при 2500 g. Избыток активных групп блокируют ресуспендированием осадка шариков в 6 мл 50 мМ раствора этаноламина с последующим 30 мин перемешиванием. Связанные шарики затем обильно промывают 2 раза 9 мл консервирующего буфера (центрифугирование 5 мин при 2500 g до и после промывок). Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

1.2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (Subrenat 9610 HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 1,5% Triton Х-100; 0,5% зеленого красителя). 5 мкл шариков со связанным антителом наносят в виде пятен в концентрации 3%, и данное устройство сушат 15 минут при 37°С, 10%-ной влажности перед немедленным применением или длительной консервацией.

Эритроциты предварительно сенсибилизируются in vitro антителами IgG против FY, KEL1KEL1 или RH1 для стимуляции эритроцитов, позитивных в прямой пробе Кумбса.

Анализ инициируется разведением эритроцитов (негативных или позитивных в пробе Кумбса) в концентрации 0,25% в chromasolcoombs (препарат Diagast), дополненном 0,00625% Tween 20. В каждую лунку вводят 50 мкл, с последующим введением 30 мкл промывочного буфера (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,2% Tween 20).

2. Прямой антиглобулиновый тест с антителом к IgG и антителом к C3d

2.1. Связывание антител

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков (9 мкм латексные альдегид/сульфатные от Thermo Fisher, 4% масс./об.) добавляют 3 мл 1× фосфатно-солевого буферного раствора, и растворяют 100 мкг антитела SA6532 или С7610. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания. Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере для получения массы введенного раствора шариков.

2.2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (Subrenat 9610 HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 1,5% Triton Х-100; 0,5% зеленого красителя). 5 мкл шариков со связанным антителом наносят в виде пятен в концентрации 4%, и данное устройство сушат 15 минут при 37°С, 10%-ной влажности перед немедленным применением или длительной консервацией.

Анализ инициируется разведением эритроцитов (негативные или позитивные в DAT) в концентрации 1,5% в фосфатно-солевом буферном растворе, дополненном 0,00625% Tween 20. 50 мкл вводят в каждую лунку, с последующим введением 30 мкл промывочного буфера (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,2% Tween 20).

3. DAT посредством аффинных белков в отношении антител

3.1. Связывание белка AGL

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков растворяют 50 мкг белка AGL в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,25М сахарозы) для получения массы введенного раствора шариков.

3.2. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610РН) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 1 мкл раствора поверхностно-активного вещества с шариками со связанным AGL (1,5% Triton Х-100; фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина; 0,25 M сахароза и 5,1% шариков). Данное устройство сушат 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется инкубированием в лунке 20 мкл реактива (DAT); добавляют 50 мкл эритроцитов, разведенных в лунке в концентрации 3% в PBS 1×, дополненном 0,00625% Tween 20; добавляют 20 мкл раствора IAT в буфере. Переносят 120 мкл смеси в лунку картриджа.

Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 40 мкл раствора IAT в буфере. Изображение получают после промывки.

4. Результаты

На Фиг. 15а показано присутствие темно-серых пятен (соответствующих красным пятнам), которые указывают на захват сенсибилизированных IgG эритроцитов, и, следовательно, позитивную прямую реакцию кумбса, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию (несенсибилизированные эритроциты).

На Фиг. 15б показано присутствие темно-серых пятен (соответствующих красным пятнам), которые указывают на захват сенсибилизированных IgG и/или C3D эритроцитов, и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию (несенсибилизированные эритроциты).

На Фиг. 15в показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен (соответствующих красным пятнам на цветном изображении), указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию.

ПРИМЕР 12: выявление антител, специфичных в отношении антигена малярии, с использованием устройства по изобретению

1. Связывание антигена

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков растворяют 100 мкл антигена Mal003 в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 M сахарозой) с получением массы введенного раствора шариков.

2. Связывание антител для выявления

На 1 мл гомогенизированных 4% 1 мкм шариков растворяют 200 мкг антител 6D4 в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 5000 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,25 М сахарозы) для получения массы введенного раствора шариков.

3. Получение реакционного устройства и процедура выявления с HRP

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610РН) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанным антигеном Mal003 в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 100 мкл образца (набор ab178649). Добавляют 100 мкл конъюгата антитела против IgG и/или антитела против IgM с HRP (набор ab178649). Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 30 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Реакционную зону затем промывают 30 мкл выявляющего буфера (субстрат ТМВ (тетраметилбензидин) (набор ab178649)). Изображение получают через 15 мин.

4. Получение реакционного устройства и процедура выявления с шариками

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610РН) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанным антигеном Mal003 в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 100 мкл образца (набор ab178649). Добавляют 30 мкл 1 мкм шариков с антителом 6D4 в концентрации 0,1%. Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 120 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после промывки.

5. Получение реакционного устройства и процедура выявления с наночастицами коллоидного золота

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610РН) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 5 мкл шариков со связанным антигеном Mal003 в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл образца (набор ab178649). Добавляют 10 мкл конъюгата 60 нм золота с антителом против человеческого IgA, IgG, IgM (АС-60-14-10). Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после промывки.

6. Результаты

На Фиг. 16а показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

На Фиг. 16б показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

На Фиг. 16с показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

ПРИМЕР 13: выявление антител, специфичных в отношении антигенов Т. pallidum, с использованием устройства по изобретению с 1 мкм шариками красного цвета в качестве способа выявления

1. Связывание антигена

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков растворяют 100 мкг антигенов р15, р17, р47 Т. pallidum (30-АТ76) в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 M сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

2. Связывание антител для выявления

На 1 мл гомогенизированных 4% 1 мкм шариков растворяют 200 мкг белка AGL в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 5000 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,25 М сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

3. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанными антигенами р15, р17, р47 Т. pallidum в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 10 мкл образца (антитело 20-TR89 против Treponema pallidum). Добавляют 30 мкл 1 мкм шариков с белком AGL в концентрации 0,1%. Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 120 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после промывки.

4. Результаты

На Фиг. 17 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

ПРИМЕР 14: выявление антител, специфичных в отношении антигена вируса гепатита В (HbsAg), с использованием устройства по изобретению со способом выявления с 1 мкм красными шариками

1. Связывание антигена

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков растворяют 100 мкг антигена HBs (30-АН15) в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 M сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

2. Связывание антител для выявления

На 1 мл 4% гомогенизированных 1 мкм шариков растворяют 200 мкг белка AGL в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 5000 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,25 M сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

3. Получение реакционного устройства и процедура выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанным антигеном HBs в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 10 мкл образца (антитело против HBsAg 10-H05G). Добавляют 30 мкл 1 мкм шариков с белком AGL в концентрации 0,1%. Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 120 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после промывки.

4. Результаты

На Фиг. 18 показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

ПРИМЕР 15: выявление антигена вируса гепатита В с использованием устройства по изобретению

1. Связывание антигена

На 1 мл гомогенизированных 4% шариков растворяют 100 мкг антитела против HBs (10-H05G) в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 2500 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,25 M сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

2. Связывание антител для выявления

На 1 мл 4% гомогенизированных 1 мкм шариков растворяют 200 мкг антитела против HBs (10-Н05Н) в 3 мл PBS 1× и добавляют. Данный раствор перемешивают переворачиванием в течение ночи для обеспечения связывания.

Связанные шарики затем центрифугируют 5 мин при 5000 g. Наконец осадок шариков ресуспендируют в консервирующем буфере (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,25 M сахарозой) для получения массы введенного раствора шариков.

3. Получение реакционного устройства и процедура выявления с использованием способа с HRP в качестве способа выявления

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанным антителом против антигена HBs (10-H05G), в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 50 мкл образца (набор 1701-12). Добавляют 50 мкл конъюгата антитело против антигена HBs-HRP (набор 1701-12). Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 100 мкл выявляющего буфера (субстрат ТМВ (набор 1701-12)). Изображение получают через 15 мин.

4. Получение реакционного устройства и процедура выявления с использованием способа с шариками

Данное устройство представляет собой отлитую пластмассовую кассету, в которой собирают гидрофобную мембрану Porex HDPE толщиной 0,6 мм и с пористостью от 9 до 12 мкм, дренажный слой (9610HY) и абсорбирующий слой (Cleanis).

Данную пористую мембрану делают гидрофильной с использованием 0,5 мкл раствора поверхностно-активного вещества (фосфатно-солевой буферный раствор, дополненный 2% Triton Х-100 и 1% зеленого красителя). Затем наносят в виде пятен 2 мкл шариков со связанным антителом против HBs (10-H05G) в концентрации 4%. Данное устройство сушат в течение 15 минут при 37°С, 20%-ной влажности перед применением.

Процедура выявления инициируется введением в каждую лунку 10 мкл образца антигена HBs (набор 1701-12). Добавляют 100 мкл 1 мкм шариков с антителом против HBs (10-Н05Н) в концентрации 0,025%. Получают первое изображение перед промывками. Реакционную зону затем промывают 120 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, дополненного 0,2% Tween-20. Изображение получают после промывки.

5. Результаты

На Фиг. 19а показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

На Фиг. 19б показано полученное в результате изображение, на котором наблюдается присутствие темно-серых пятен, указывающих на образование иммунного комплекса и, следовательно, позитивную реакцию, тогда как присутствие бесцветного пятна отражает негативную реакцию и график с интенсивностью серого цвета.

Изобретение относится к диагностическому устройству in vitro для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологической жидкости, в частности, из образца крови или образца компонентов крови и его применению. Устройство диагностики in vitro для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови содержит подложку и гидрофобную пористую мембрану, расположенную на указанной подложке, содержащую по меньшей мере одну гидрофильную реакционную область, предназначенную для приема указанного образца, причем поверхность данной гидрофильной реакционной области, которая меньше, чем поверхность гидрофобной пористой мембраны, содержит шарики, на поверхности которых фиксированы или адсорбированы по меньшей мере одно антитело или антиген, при этом указанные шарики имеют размер, превосходящий размер пор пористой мембраны, и позволяют избежать абсорбции гидрофобной пористой мембраной фиксированного или адсорбированного по меньшей мере одного антитела или антигена. Техническим результатом является повышение чувствительности и специфичности устройства. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 19 ил., 4 табл.

1. Устройство диагностики in vitro для выявления и/или идентификации антигена и/или антитела из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, содержащее:

- подложку и

- гидрофобную пористую мембрану, расположенную на указанной подложке, содержащую по меньшей мере одну гидрофильную реакционную область, предназначенную для приема указанного образца, причем поверхность данной гидрофильной реакционной области, которая меньше, чем поверхность гидрофобной пористой мембраны, содержит шарики, на поверхности которых фиксированы или адсорбированы по меньшей мере одно антитело или антиген, при этом указанные шарики имеют размер, превосходящий размер пор пористой мембраны, и позволяют избежать абсорбции гидрофобной пористой мембраной фиксированного или адсорбированного по меньшей мере одного антитела или антигена.

2. Устройство диагностики in vitro по п. 1, где антитело выбрано из группы, включающей антитела к эритроцитам, антитела к тромбоцитам, антитела к вирусным антигенам, антитела к бактериальным антигенам и антитела к паразитарным антигенам, предпочтительно из антител к эритроцитам.

3. Устройство диагностики in vitro по п. 1, где антиген выбран из группы, включающей антигены эритроцитов, антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены.

4. Устройство диагностики in vitro по п. 2 или 3, где антитела к вирусным антигенам и вирусные антигены происходят из вируса гепатита В или вируса гепатита С, предпочтительно из вируса гепатита В.

5. Устройство диагностики in vitro по п. 2 или 3, где антитела к бактериальным антигенам и бактериальные антигены происходят из рода Treponema, предпочтительно Treponema pallidum.

6. Устройство диагностики in vitro по п. 2 или 3, где антитела к паразитарным антигенам и паразитарные антигены происходят из рода Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum.

7. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-6, в котором указанное антитело или антиген напрямую или опосредованно фиксируется или адсорбируется на поверхности шарика.

8. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-7, в котором указанное антитело или антиген опосредованно фиксируется на поверхности шарика с помощью другого антитела, предпочтительно с помощью иммуноглобулина IgM или IgG.

9. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-8, в котором указанное антитело опосредованно фиксируется на поверхности шарика с помощью лиганда, выбранного из белков с аффинностью в отношении антител, таких как белок А, белок G или белок L.

10. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-9, в котором указанная поверхность шарика содержит по меньшей мере одну химическую группу, выбранную из альдегидных групп, хлорметильной группы, групп NHS и карбоксильных групп.

11. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-10, в котором средний размер шариков составляет от 1 мкм до 130 мкм, предпочтительно от 5 мкм до 50 мкм и наиболее предпочтительно - 9 мкм.

12. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-11, в котором шарики используются в концентрации, составляющей от 1% до 10%, предпочтительно от 1% до 5%, более предпочтительно от 2% до 6% или от 1% до 3%, еще более предпочтительно 3% раствора, в котором суспендированы указанные шарики, и где внесенный объем указанного раствора составляет от 1 до 100 мкл, предпочтительно от 1 до 50 мкл, более предпочтительно от 5 до 50 мкл и еще более предпочтительно от 1 до 10 мкл или от 5 до 10 мкл.

13. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-12, в котором толщина гидрофобной пористой мембраны составляет от 0,4 мм до 2 мм, предпочтительно от 0,6 мм до 1,5 мм.

14. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-13, в котором гидрофильная реакционная область гидрофобной пористой мембраны приводится в гидрофильное состояние посредством поверхностно-активного вещества, предпочтительно используемого в концентрации, составляющей от 0,01 до 5% масс./об., более предпочтительно от 0,1% до 3% масс./об., еще более предпочтительно от 0,5% до 2% масс./об. раствора, и где на гидрофобную пористую мембрану наносят от 0,1 до 5 мкл, предпочтительно от 0,3 до 3 мкл и более предпочтительно от 0,5 до 2 мкл указанного раствора, содержащего поверхностно-активное вещество.

15. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-14, причем указанное устройство дополнительно содержит по меньшей мере один слой, расположенный под пористой мембраной, который представляет собой абсорбирующий слой.

16. Устройство диагностики in vitro по любому из пп. 1-15, которое дополнительно содержит по меньшей мере еще один слой, расположенный между гидрофобной пористой мембраной и абсорбирующим слоем, причем указанный слой изготовлен из дренажного материала.

17. Применение устройства in vitro по любому из пп. 1-16 для определения и/или идентификации:

- по меньшей мере одного антигена, выбранного из группы, содержащей антигены эритроцитов, антигены тромбоцитов, вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены;

- по меньшей мере одного антитела, выбранного из группы, содержащей антитела к эритроцитам, антитела к тромбоцитам, противовирусные антитела, антибактериальные антитела и антипаразитарные антитела из образца биологических жидкостей, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови.

18. Способ in vitro выявления и/или идентификации антигенов эритроцитов, и/или сенсибилизированных in vivo эритроцитов, и/или антигенов тромбоцитов из образца крови или образца компонентов крови, включающий следующие стадии:

- добавление раствора, содержащего указанный образец, на реакционную область устройства in vitro по любому из пп. 1, 2 и 7-16,

- считывание перед промывкой для контроля загрузки образца;

- нанесение промывочного раствора на реакционную область и

- определение присутствия указанных антигенов или указанных клеток крови посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в данной реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антигенов или указанных клеток крови посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

19. Способ in vitro выявления и/или идентификации антител к эритроцитам из образца крови или образца компонентов крови, включающий следующие стадии:

- инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером и тест-эритроцитами известного фенотипа,

- нанесение данной смеси на реакционную область устройства in vitro по любому из пп. 1, 3 и 7-16,

- нанесение на реакционную область промывочного раствора и

определение присутствия антител к эритроцитам посредством определения присутствия реакции антитело/антиген, если в данной реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия реакции антитело/антиген, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

20. Способ in vitro выявления и/или идентификации антител к тромбоцитам из образца крови или образца компонентов крови, включающий следующие стадии:

- инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером и тест-тромбоцитами известной антигенности или инкубирование плазмы или сыворотки реципиента с тромбоцитами донора,

- нанесение данной смеси на реакционную область устройства in vitro по любому из пп. 1, 3 и 7-16,

- нанесение на реакционную область промывочного раствора и

- определение присутствия антител к тромбоцитам посредством определения присутствия взаимодействия антитело/антиген, если в данной реакционной области появляется красное или розовое пятно, или определение отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия взаимодействия антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

21. Способ in vitro выявления и/или идентификации антигенов, выбранных из группы, содержащей вирусные антигены, бактериальные антигены и паразитарные антигены из образца биологической жидкости, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающий следующие стадии:

- возможно инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером,

- добавление раствора, содержащего указанный образец или смесь образца с буфером, на реакционную область устройства in vitro по любому из пп. 1, 2 и 4-16,

- возможно считывание перед промывкой для контроля загрузки образца;

- возможно нанесение промывочного раствора на реакционную область и

- определение присутствия указанных антигенов посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в данной реакционной области появляется окрашенное пятно, или определение отсутствия указанных антигенов посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.

22. Способ in vitro выявления и/или идентификации антител, выбранных из группы, содержащей противовирусные антитела, антибактериальные антитела иантипаразитарные антитела из биологического образца, предпочтительно из образца крови или образца компонентов крови, включающий следующие стадии:

- возможно инкубирование образца, подлежащего анализу, с буфером,

- добавление раствора, содержащего указанный образец или смесь образца с буфером на реакционную область устройства in vitro по любому из пп. 1, 3-16,

- возможно считывание перед промывкой для контроля загрузки образца,

- возможно нанесение на реакционную область промывочного раствора и

- определение присутствия указанных антител посредством определения присутствия взаимодействия антиген/антитело, если в данной реакционной области появляется окрашенное пятно, или определение отсутствия указанных антител посредством определения отсутствия реакции антиген/антитело, если в реакционной области появляется бесцветное пятно.