Способ получения иммуносорбента Советский патент 1984 года по МПК G01N33/50 

Ivd

сд ел

4

CD . Изобретение отнсхится к биохимии и иммунологии, а именно к способам получения иммобилизованных антител, используемых при афинном разделении белков, и касается получения иммуносорбентов, применяемых в аналитических -биохимических исследованиях и медицинской диагностике для выделения и количественного определения мальж количеств белков, например иммуноглобулинов различных классов, синтезируемых в культуре лимфоцитов человека, Известен способ получения иммуносорбента, основанный на иммобилизации белка А, вьзделенного из золотистого стафилококка, на Сефарозе 4 В lj Однако способ сложен, так как включает стадии выделения белка из микроорганизмов, активации сефарозы бромцианом и иммобилизации белка. Метод многостадиен, а иммобилизованный белок А не используется непосред ственно дпя очистки антител. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммуносорбента, включающий прибавление к нерастворимому носителю (Сефароза 4 В, активированная бромцианом) антисыворотки, 24-часовую инкубацию нерастворимого носителя с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нераст воримого носителя (1М глицина), послед.ующую инкубацию в течение 4 ч и отмывку продукта в физиологическом растворе 2 . Недостатками известного способа являются длительность (свыше 28 ч) и сложность, обусловленная многостадийностью процесса. Кроме того используемая в качестве носителя Сефароза 4В является дефицитным и дорогим соединением, а её активация требует работы с крайне ядовитым соединением - бромцианом. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса получения иммуно сорбента. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения имму.носорбента, включающему прибавление к нерастворимому носителю антисыворо ки, инкубацию нерастворимого носителя с антисывороткой, введение агента блокирующего свободные группы нераст воримого носителя, последующую инкубацию, и отмывку продукта в физиологическом растворе, в качестве нерастворимого носителя используют 4-6%-ную суспензию фиксированных формалином и убитых нагреванием микроорганизмов золотистого стафилококка, несущих на поверхности белок А, а в качестве агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носители, используют неиммунную сыворотку. Сущность способа заключается в использовании в качестве нерастворимого носителя 4-6%-ной суспензии убитых стафилококковых микроорганизмов, что позволяет значительно сократить длительность инкубации как с антисывороткой (до 30 мин), так и с блокирующим агентом (тоже до 30 мин), поскольку реакции присоединения антител, содержап хся в антисыворотке, и блокирующих агентов (белков),содержащихся в неимунной сыворотке, носят не химический характер и протекают исключительно быстро. Эти реакции хорошо протекают при физиологических рН при комнатной температуре, т.е. осуществление технологического процесса протекает в одном температурном режиме (20 С) и с использованием одного буферного раствора с рН 7,6. Упрощение способа связано также с исключением потребности в специальном оборудовании (холодильной камере, электрическом встряхивателе и др.). Кроме того, стафилококковые микроорганизмы, применяемые в качестве исходного сырья, имеют низкую стоимость и способны без какихлибо дополнительных затрат сами быстР° увеличивать свою массу. Необходимость активации нерастворимого носителя бромидом циана отпадает, так как антитела, содержащиеся в антисыворотке, прочно присоединяются к стафилококковым микроорганизмам спонтанно. Пример 1. Получение иммуносорбента. Взвесь фиксированных формалином и убитых прогреванием Шкpoopгaнизмов золотистого стафилококка Кован 1 готовят по методу Кесслера. Микроорганизмы инкубируют в мясопептонном бульоне при в течение 24 ч при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Образовавшуюся микробную массу,отмывают два раза в физиологическом растворе, содержащем О,02 М фосфатный буфер с рН 7,6 и 0,05% мертиолата, центрифугированием

31

при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге ЦЛС-3. Затем М1кроорга низмы встряхивают 1,5 ч в указанном буферном растворе, содержащем 1,5% формалина, и после отмывки прогревают при ЗСгС в течение 5 мин. После дополнительной отмывки концентрацию микроорганизмов доводят до 5%. Суспензия может храниться не менее 4 мес. в физиологическом растворе, содержащем 0,02 М фосфатный буфер с рН 7,6 и 0,05% мертиолата. В центрифужные пробирки, содержащие по 0,05 мл 5%-ной суспензии фиксированных формалином и убитых прогреванием микроорганизмов золотистого стафилококка Кован 1, прибавляют по 0,05 мл кроличьей антисыворотки против -или jU-цепной иммуноглобулинов человека и инкубируют 30 мин при комнатной (20 С) температуре. Затем в пробирки прибавляют по 6 МП неиммунной сыворотки периферической крови кролика и инкубируют еще 30 мин при комнатной температуре, после чего микроорганизмы три раза отмывают физиологическим раствором, содержащем 0,02 М фосфатный буфер с рН 7,6, центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин.

Эффективность полученных иммуносорбентов иллюстрируется следующими примерами.

Пример 2. Получение иммуносорбентов проводят по примеру 1, но используют 1, 4, 5 и 6%-ные концентрации взвеси клеток. Иммуносорбенты с концентрацией взвеси 4, 5 и 6% сорбируют иммуноглобулины G и М с практически одинаковой эффективностью (специфичность иммуносорбента зависит от типа используемых для его полу 1ения антител) . Эффективность сорбции для иммуносорбента, полученного на основе 1%-ной взвеси клеток, снижается в отношении иммуноглобулинов G и М соответственно в 5-6 и 8-8,5 раз. Таким образом, эффективность последнего сорбента невысока. Использование концентрадаи взвеси выше 6% нецелесообразно из-за перерасхода исходного материала.

Пример 3. Определение содержания меченых углеродом-14 иммуноглобулинов G и иммуноглобулинов М в смеси меченых белков.

Отмытые иммуносорбенты (0,05 мл) суспендируют в 1 мл исследуемого об255494

разца, представляющего собой смесь меченых углеродом-14 белков с неизвестным содержанием радиоактивных иммуноглобулинов G и иммуноглобули5 нов М. Пробирки инкубируют 40 мин при комнатной температзфе. Регистрируемой количественной характеристикой исследуемых иммуноглобулинов G и иммуноглобулинов М, присоединяю10 щихся в результате инкубации к иммуносорбентам, несущим антитела против |И-цепей иммуноглобулинов человека соответственир, является величина их радиоактивности, прямо пропорцио15 Нр1льная количеству иммуноглобулинов. Специфичность анти-иммуноглобулиновых иммуносорбентов проверяют путем блокирования их присоединяющей способности нерадиоактивными стандарт0 ными иммуноглобулинами высокой чистоты. Для этого часть иммуносорбентов перед инкубацией с исследуемым образцом инкубируют 40 мин при комнатной .температуре с избытком нера5 диоактивного иммуноглобулина G (из расчета 25 мкг на 0,06 мп 5%-ной взвеси иммуносорбента) или М (из расчета 100 мкг на 0,05 мл 5%-ной взвеси иммуносорбента) и трижды отмывают.

0 Итоговую радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновым иммуносорбентам, определяют с помощью, бета-спектрометра после их отмьшания в физиологическом растворе,

, содержащем 0,02 М фосфатный буфер с рН 7,6, и перенесения во флаконы, содержащие cцинт лляциoннyте жидкость. Брэя. Степень специфичности присоединения иммуноглобулинов к анти-иммуQ ноглобулиновым иммуносорбентам выражают коэффициентом (К) специфичности, который вычисляют согласно формулам

.

СО А

8. А

W

k-r ,

где А - радиоактивность белков, присоединившихся к незаблокированному анти-иммуноглобулиновому иммуносорбенту;

Б - радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновому иммуносорбенту, блокированном Нерадиоактивным иммуноглобулином соответствующего класса; В - радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулино вому иммуносорбенту, обработанному нерадиоактивным иммуноглобулином про тивоположного класса. Наибольшей специфичностью обладают анти иммуноглобулиновые иммуносор бенты, характеризуемые коэффициентом специфичности присоединения, равным В таблице приведено определение содержания меченных углеродом-14 и D4yнoглoбyлинoв и иммуноглобулинов М в смеси меченых белков. (В опытах 1 и 2 использовались два различных образца смеси меченых белков. Как видно из таблицы, получаемые согласно предлагаемому способу иммуносорбенты, несущие антитела против У-И U -цепей иммуноглобулинов челове ка, пригодны для высокоспецифичного определения содержания иммуноглобули нов Си иммуноглобулинов М в смеси белков. Получаемые согласно предлагаемому способу ймм носорбенты пригодны для использования в качестве диагностического средства при оценке функционального состояния: системы гуморального иммунитета у пациентов, в частности для определения гуморального иммунного ответа изучаемых лимфоцитов на митогенную стимуляцию. Таким образом, использование изобретения позволяет значительно упростить (за счет уменьшения числа стадий и их сложности) и ускорить (сокращение времени процесса до 1-2 ч вместо 28 ч согласно известному способу) процесс получения иммуносорбента. При этом также происходит экономия малодоступного сьфья и исключение из технологического процесса ядоBfiToro реактива (бромциана) . Указанные преимущества позволяют применять предлагаемый способ для рутинного изготовления иммуносорбентов в широком круге научно-исследовательских и медицинско-диагностических лабораторий.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА, включающий прибавление к нерастворимому носителю антисыворотки, инкубацию нерастворимого носителя с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, последующую инкубацию и отмывку продукта в физиологическом растворе, отличающи йс я тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве нерастворимого носителя используют 4-6%-ную суспензию фиксированных формалином и убитых нагреванием микроорганизмов золотистого стафилококка, несущих на поверхности белок А, а в качестве агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, исполь(Л зуют неиммунную сыворотку.

Анти-иммуногло- Не использовался булин G

Не использовался Иммуноглобулин G Иммуноглобулин М Иммуноглобулин М Иммуноглобулин G

96741287 38461130

61t1 1 641

9753186 3788146

1125549

U Продолжение таблицы