СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ МЕХАНИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЕЕ РЕГЕНЕРАЦИИ Российский патент 2005 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации, и может быть использовано для изучения процессов восстановления печени после ее механической травмы.

Известен способ моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации путем помещения механически поврежденного образца печени диаметром 2-3 мм, извлеченного из 16-18 дневных эмбрионов мышей оперативным путем, в искусственно созданную среду жизнеобеспечения № 199, содержащую 10-15% прогретой гомологичной сыворотки, 4 мг глюкозы и по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл среды. В ряде случаев на 100 мл культурной среды добавляли по 20 мг I-глютамина и бета-глицерофосфата натрия. Образцы печени помещали на миллипорные фильтры, которые при помощи пластмассовой подставки с отверстиями поддерживали на разделе 2 фаз - жидкой фазы питательной среды и газообразной, состоящей из насыщенных паров воды, 95% кислорода и 5% углекислого газа. Пластмассовую подставку с 14 круглыми отверстиями диаметром 5-7 мм помещали в чашку Конвея, в которую наливали питательную среду до уровня фильтров, помещенных над отверстиями. Использовали миллипорные фильтры НА (толщина 150 мк, диаметр пор 0,45 мк) и ALLES (толщина 00 мк, диаметр пор 0,6-0,9 мк). Во внутренний цилиндр чашки наливали физиологический раствор для поддержания влажности. После эксплантации кусочков печени чашку продували газовой смесью и притирали крышку к бортам чашки Конвея, предварительно смазанным расплавленной смесью вазелинового масла и воска. Питательную среду и газообразную фазу меняли через 72 часа [1].

Описанный способ имеет ряд недостатков. Самым существенным из них является то, что помещенные в искусственные условия культуры ткани образцы печени плодов животного лишаются коррелятивных связей и с организмом матери, и с организмом самого плода. В связи с этим регенераторные потенции печени не могут реализоваться в полной степени.

Наиболее близким аналогом к заявляемому является способ моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации, заключающийся в механическом повреждении образца печени, плодов беременных самок крыс, а механическое повреждение осуществляют путем прокола стальной иглой плодного пузыря, а затем плода, и прокол осуществляют в правом подреберье в месте расположения печени, после чего образец оставляют внутри плода до разрешения беременности [2].

Задачей изобретения является повышение эффективности моделирования регенерации печени в способе, максимально приближенном к естественным условиям организма.

Техническим результатом является повышение эффективности способа путем увеличения точности попадания иглы в печень при моделировании механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации у плода.

Технический результат достигается тем, что способ моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации, включающий послойное вскрытие брюшной полости беременной самки крысы, вывод в операционную рану матки с находящимися в ней плодами, поворот плода в удобное для оперативного вмешательства положение, фиксацию плода, прокол стальной иглой вначале оболочки плодного пузыря, а затем плода, в правом подреберье в месте проекции печени, сохранение плода до разрешения беременности, перед проколом на матке делают разрез длиной 0,8-1,0 см, поворот плода осуществляют после выбухания в разрез плодного пузыря, а прокол плода производят глубиной 0,5-0,7 см, а после прокола выбухающую часть плодного пузыря увязывают кетгутом.

Способ моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации осуществлялся следующим образом: по средней линии живота, отступая 3-4 см от нижнего края грудины, делали послойный разрез (длиной 2,5-3 см) кожи, мышц передней брюшной стенки и брюшины. В операционную рану выводили матку с находившимися там плодами. Для предупреждения охлаждения плодов операцию производили под ламповым рефлектором, благодаря чему температура в области операционной раны равнялась 36-38°С. Матку покрывали стерильной салфеткой, смоченной теплым физиологическим раствором. По верхнему полюсу матки над одним из плодов делали разрез стенки матки длиной 0,8-1,0 см, в результате чего плодный пузырь с находившимся там плодом начинал выбухать в разрез (полностью из матки плодный пузырь не извлекали). При этом плод в плодном пузыре становился хорошо видимым. Плод в плодном пузыре осторожно поворачивали приблизительно на 180°С - брюшной стенкой кверху и в этом положении его фиксировали пальцами. Стальной иглой с ограничителем делали прокол вначале плодного пузыря, а затем плода в правом подреберье, в месте проекции печени. Как правило, после извлечения иглы из плода выполняли повторный, контрольный, прокол плода в месте расположения печени. При проколе игла проникала в печень плода и вызывала ее механическое повреждение. После извлечения иглы плодный пузырь увязывали кетгутом (как завязывают мешок), на матку накладывали однорядный шов. Аналогичные манипуляции осуществляли над каждым из имевшихся в матке плодов, после чего матку вправляли в брюшную полость, в которую вводили 25000-50000 ЕД пенициллина и ушивали послойно. В зависимости от количества плодов в матке операция длилась от 1,5 до 2,5 часов. Используя данную методику, было выполнено 36 операций, из которых 20/55,5% закончились нормальными родами здоровыми жизнеспособными крысятами. В 16 случаях (44,5%) операция закончилась выкидышами или родами мертвыми, нежизнеспособными, крысятами. Обычно выкидыши происходили через 1-2 дня после операции.

Повреждение печени выполняли стальной иглой длиной 8 см, диаметром 8 мм, конусовидно суживающейся книзу, к ее острому концу. На расстоянии 0,7 см от конца игла имеет ограничитель, мешающий более глубокому, бесконтрольному проникновению иглы в плод. Глубина прокола 0,5-0,7 см достаточна для изучения процессов восстановления печени после ее механической травмы.

Отличие предлагаемого способа моделирования регенерации печени в эксперименте заключается в том, что перед проколом плодного пузыря и плода осуществляют разрез на матке, в который происходит частичное выбухание плодного пузыря. При этом передняя поверхность плода, находящегося в плодном пузыре, становиться более обозримой и появляется эффективность попадания иглы в печень при моделировании механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации.

Контроль за ходом регенераторного процесса осуществляется путем забоя животных в определенные сроки с последующим изучением гистологических препаратов, изготовленных из печени животных. Метод разработан на беременных самках крыс весом 235-270 грамм. Оперативные вмешательства производили в стерильных условиях при сроках беременности 16-18 дней под эфирным масочным наркозом.

Для этого в различные сроки повреждения (1, 3, 5, 7, 9, 12, 15 и 20 сутки после операции) родившихся крысят забивали эфирным наркозом, из них извлекали печень, которую фиксировали в 10% нейтральном формалине, и делали гистотопографические срезы. Полученные срезы толщиной 4-6 микрон окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону. Факт механической травмы печени подтверждался в 88% случаев по произведенному морфометрическому изучению изменений в печени. Было подсчитано число митозов и количество двуядерных гепатоцитов на 5000 клеток. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась по правилам вариационной статистики. В качестве контроля были взяты 12 плодов и крысят того же возраста, что и опытные животные.

Динамика микроскопических изменений в печени после ее механической травмы была следующей: В первые сутки после операции в печени обнаруживались щелевидные дефекты органа с большим содержанием в них и в окружности эритроцитов. По периферии повреждений прослеживались группы некротизированных гематоцитов с гомогенной цитоплазмой без ядер. Классической воспалительной клеточной реакции в окружности от очага повреждения ни в первые сутки, ни в дальнейшем не отмечалось; здесь появлялось небольшое количество мононуклеаров. Начиная с 2-х суток после операции, в печеночной ткани возникала выраженная пролиферация гепатоцитов. Так, на 2-е сутки после операции митотический индекс резко возрастал по сравнению с контрольными животными (соответственно 29,3% и 8,27%). Высокая митотическая активность гепатоцитов сохранялась до 9 суток после операции, когда она составила 28,55%, после чего она снижалась и к 15 суткам достигала уровня, характерного для контрольных животных (2,21% и 1,27% соответственно). С 1-х суток после операции в печени появлялось большое количество гепатоцитов с гиперхромными ядрами, с базофилией цитоплазмы. Резко увеличивалось количество 2-х ядерных гепатоцитов; особенно увеличение 2-х ядерных гепатоцитов происходило на 9-15 сутки после операции, по мере уменьшения количества митозов (на 2-е сутки количество двуядерных гепатоцитов у опытных крысят было 39,66%, в контроле - 50,41%; на 9 сутки - 64,73%, в контроле - 44,4%; на 15 сутки 72,55%, в контроле - 38,64%).

На 3-5 сутки очаг повреждения постепенно уменьшился в размерах за счет заполнения его пролиферирующими гепатоцитами. На 9-15 сутки очаг повреждения полностью заполняли гистологически полноценными гепатоцитами. Здесь же обнаруживалось небольшое количество нежных коллагеновых волокон, что отсутствовало в других, неповрежденных, участках печени.

Способ механического повреждения печени у плодов крыс, описанный выше, безопасен для здоровья самки. Смертельных исходов в результате оперативного вмешательства было 4; причиной смерти крыс явился разлитой гнойный перитонит. Оперированные самки в случае благоприятного исхода вставали после операции в среднем через 20-30 минут и начинали пить и принимать пищу. Оперированные самки через некоторое время (0,5-1 месяц после операции) случались повторно. Беременность и роды у них протекали нормально, они рожали жизнеспособных крысят.

Таким образом, в предложенном способе моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации восстановление печени происходит не в искусственных условиях, а в организме плода, что приближает модель к естественным условиям организма.

Источники информации.

1. Лурия Е.А., Бакиров Р.Д., Абелев Г.И., Фриденштейн А.Я. Органные культуры эмбриональной печени, синтезирующие белки сыворотки. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1969, №3, С.95-99.

2. Малышев И.И. и др. Механическое повреждение печени плодов крыс в эксперименте. Медицинский журнал Чувашии. 1995, №1-2, стр.116-117.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации. Послойно вскрывают брюшную полость беременной самки крысы, выводят в операционную рану матки с находящимися в ней плодами, поворачивают плод в удобное для оперативного вмешательства положение, фиксируют плод, прокалывают стальной иглой оболочки плодного пузыря и затем плода в правом подреберье в месте проекции печени, сохраняют плод до разрешения беременности, при этом перед проколом на матке делают разрез длиной 0,8-1,0 см, поворот плода осуществляют после выбухания в разрез плодного пузыря, а прокол плода производят глубиной 0,5-0,7 см, после прокола выбухающую часть плодного пузыря увязывают кетгутом. Данное изобретение позволяет воспроизвести повреждение печени, максимально приближенное к естественным условиям организма.

Способ моделирования механического повреждения печени у лабораторных животных для последующего исследования ее регенерации, включающий послойное вскрытие брюшной полости беременной самки крысы, вывод в операционную рану матки с находящимися в ней плодами, поворот плода в удобное для оперативного вмешательства положение, фиксацию плода, прокол стальной иглой вначале оболочки плодного пузыря, а затем плода в правом подреберье в месте проекции печени, сохранение плода до разрешения беременности, отличающийся тем, что перед проколом на матке делают разрез длиной 0,8-1,0 см, поворот плода осуществляют после выбухания в разрез плодного пузыря, а прокол плода производят глубиной 0,5-0,7 см, и после прокола выбухающую часть плодного пузыря увязывают кетгутом.