СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ КАНДИДОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2006 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области инфекционной патологии и может быть использовано в научных исследованиях для изучения влияния внутриутробной кандидозной инфекции на здоровье плода и рожденного потомства, а также при оценке эффективности лечения внутриутробной кандидозной инфекции и вызванных ею осложнений.

При беременности, осложненной наличием кандидозной инфекции в организме женщины, к родам колонизация Candida albicans возрастает до 30-50% (1, 2). Основными путями инфицирования считаются восходящий (через околоплодные воды) или трансплацентарный (через гемохориальные пространства из крови матери) (3). Внутриутробный кандидоз относят к генерализованным формам кандидоза, характеризующимся поражением головного мозга и внутренних органов. Частота внутриутробного кандидоза составляет, по данным ряда авторов, 0,1-1% клинических и секционных наблюдений (2-5). В результате кандидозной инфекции у беременных женщин в 1,5 раза увеличивается угроза прерывания беременности, в 2,4 раза - инфицирование плода и новорожденного, отмечаются случаи мертворождений, а также и рождения детей (плодов) с низкой массой тела (2-4,6). В связи с этим, для научных целей приобретает чрезвычайно важное значение разработка экспериментальных моделей внутриутробной кандидозной инфекции.

Известен способ моделирования кандидозной инфекции у мышей путем внутривенного введения 10⁷ клеток грибковых штаммов Candida albicans (7). Недостатком известного способа является низкий процент инфицирования плода, т.к. возбудитель грибковой инфекции редко преодолевает гематоплацентарный барьер, и требуется большое количество животных для достижения желаемого результата.

Известен также способ моделирования кандидозной инфекции у мышей, включающий последовательное введение самке мыши эстрогена внутривенно, введение внутрь влагалища 10⁷ клеток грибковых штаммов Candida albicans (7), оценку уровня инфицированности животного. Недостатком известного способа является его неэффективность для достижения инфицирования плода при введении возбудителя беременным самкам, т.к. плод изолирован в полости матки до момента раскрытия шейки матки и разрыва плодного пузыря в период родов.

Известен также способ моделирования кандидозной инфекции у мышей путем введения во влагалище 5×10⁵ клеток Candida albicans в 20 мл стерильного фосфатного буфера из стационарной культуральной среды, повторения процедуры инфицирования через 4 недели при содержании в буфере 5×10⁴ клеток Candida albicans и одновременное введение эстрогена внутривенно, при этом наличие инфекции проверяют по содержанию возбудителя в сыворотке крови и смывах влагалища мыши (8). Известный способ позволяет достичь более высокий уровень инфицирования организма мыши в течение 5 недель, но обеспечивает лишь единичные случаи инфицирования плода при введении возбудителя беременным самкам. Это, в свою очередь, снижает вероятность развития внутриутробной инфекции, важность изучения которой описана выше.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение эффективности внутриутробного кандидозного инфицирования. Решение поставленной задачи достигается тем, что беременным самкам вводят наркотическое вещество, применяемое при внутриполостных операциях, делают разрез брюшной стенки в области матки, вводят через маточные трубы в плаценту каждого плода не менее 0,5×10⁶ клеток возбудителя кандидозной инфекции в физиологическом растворе, затем зашивают брюшную стенку, наличие внутриутробной кандидозной инфекции определяют по присутствию возбудителя в тканях последа (плацента, околоплодные оболочки) и плода по окончании беременности.

Описание изобретения

Способ моделирования кандидозной инфекции у экспериментальных животных включает введение беременным самкам наркотического вещества, применяемого при внутриполостных операциях, выполнение разреза брюшной стенки в области матки, введение через маточные трубы в плаценту каждого плода физиологического раствора, содержащего не менее 0,5×10⁶ клеток возбудителя кандидозной инфекции, зашивание брюшной стенки, определение по окончании беременности наличия внутриутробной кандидозной инфекции по присутствию возбудителя в тканях последа (плацента, околоплодные оболочки) и плода. В качестве возбудителя кандидозной инфекции наиболее эффективно использование самого распространенного штамма - Candida albicans.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Беременным самкам мышей линии С57В1/6 (количество животных - 85) давали с помощью нембутала наркоз (1,8 мг на 1 животного в 0,2 мл дистиллированной воды внутрибрюшинно) (9). После наступления действия наркотического препарата (отсутствие болевых рефлексов у животного) по средней линии брюшной стенки делали разрез. Аккуратно выводили в область разреза одну из маточных труб с плодами. В область плаценты каждого плода через одну из маточных труб параллельно ее стенке с помощью туберкулинового шприца под контролем стереометрического микроскопа вводили 0,04 мл раствора с суточной культурой Candida albicans из расчета 2,5×10⁶ микробных тел в 0,2 мл 0,9% изотонического раствора NaCl (физиологического раствора), т.е. 0,5×10⁶ микробных тел на плаценту каждого плода. При удалении иглы место прокола тампонировали стерильным ватным шариком. После этого маточную трубу возвращали в брюшную полость. Затем такую же процедуру проделывали со второй маточной трубой, содержащей плоды. По завершении этой процедуры брюшную стенку ушивали послойно. Для введения раствора с возбудителем можно использовать любой микрошприц, в частности туберкулиновый.

Внутриутробное кандидозное инфицирование определяли по окончании беременности (выкидыша или родов) по наличию возбудителя в тканях последа (плацента, околоплодные оболочки) и плода. Для этого проводили микробиологическое исследование ткани последа (плаценты и оболочек), а также ткани печени плода путем посева на питательные среды на агаре Saboraud с глюкозой (10). Установили наличие кандидозной инфекции в тканях последа у 100% животных, в ткани печени плода - у 75% животных. При гистологическом исследовании инфицированной печени плода методом специальной окраски на грибы по Шабадашу (см. чертеж) в просвете центральной вены печени обнаружили грибы (псевдомицелий) Candida albicans.

Пример 2. Способ моделирования кандидозной инфекции осуществили на 36 беременных самках мышей линии СВА согласно описанию в примере 1, при этом в область плаценты каждого плода вводили 0,06 мл указанного физиологического раствора с культурой Candida albicans, т.е. 0,75×10⁶ микробных тел на плаценту каждого плода. При проведении микробиологического анализа путем посева установили наличие кандидозной инфекции в тканях последа у 100% животных, в ткани печени плода - у 78% животных.

В результате осуществления заявленного способа установили высокий процент гибели плодов при внутриутробной кандидозной инфекции (таблица 1). Это согласуется с литературными данными об исходах беременностей у женщин, имеющих в течение беременности кандидозную инфекцию (5, 11). Для того чтобы разделить эффект внутриутробной кандидозной инфекции и оперативного вмешательства в плаценту на развитие плода и новорожденного, при реализации заявленного способа сравнили массу новорожденных и 1-2-месячных мышей линии СВА и С 57 В 1/6 в контрольной группе неоперированных и неинфицированных животных (контроль), в группе оперированных, но неинфицированных животных (ложно-оперированная группа) и в группе инфицированных животных по заявленному способу (таблица 2). Как следует из таблицы 2, масса новорожденных мышей у ложно-оперированных и инфицированных по заявленному способу животных существенно не различаются, хотя достигают несколько меньших величин, чем у потомства интактных животных (контроль), однако в возрасте 2 месяцев потомство от ложно-оперированных животных догоняет группу контроля, а потомство от инфицированных животных заметно отстает по своему развитию (массе тела) от потомства обеих контрольных групп животных. Полученные результаты позволяют использовать заявленную модель для изучения влияния внутриутробной кандидозной инфекции на здоровье потомства.

На чертеже даны результаты гистологического исследования инфицированной печени плода методом специальной окраски на грибы по Шабадашу. В просвете центральной вены печени видны грибы (псевдомицелий) Candida albicans.

Список использованных источников:

1. Фризе К., Кахель В. Инфекционные заболевания беременных и новорожденных: пер. с нем. - М.: Медицина, 2003. - 424 с.

2. Черствой Е.Д., Клецкий С.К., Летковская Т.А. Патоморфология и некоторые вопросы патогенеза кандидоза у детей в современных условиях. // Здравоохранение Белоруссии. - 1988. - №10. - С.66-68.

3. Хмельницкий O.K., Аравийский Р.А., Экземпляров О.Н. Кандидоз (патологическая анатомия, химиотерапия, лечебный патоморфоз). - Л.: Медицина, 1983. - 199 с.

4. Бульвахтер Л.А., Писарева О.В. Кандида-инфекция и беременность. Формирование факторов риска внутриутробного кандидоза // Тезисы докладов 9-го Всесоюзного съезда дерматовенерологов. - Алма-Ата, 1991. - С.154.

5. Самсыгина Г.А., Буслаева Г.Н., Корнюшин М.А. Кандидоз новорожденных и детей раннего возраста. Дифлюкан в лечении и профилактике кандидоза. // Приложение к журналу «Педиатрия имени Г.Н. Сперанского». - М., 1996. - 30 с.

6. Байрамова Г.Р., Прилепская В.Н. Кандидозная инфекция в акушерстве и гинекологии // Consilium provisorum. - 2001. - T.1. - №3.

7. Luciano Polonelli, Walter Magliani, Stefania Conti, Luisa Bracci, Luisa Lozzi, Paolo Neri, Daniela Adriani, Flavia De Bernardis, and Antonio Cassone Therapeutic Activity of an Engineered Synthetic Killer Antiidiotypic Antibody Fragment against Experimental Mucosal and Systemic Candidiasis // American Society for Microbiology Infect. Immun. - 2003. - Vol.71. - №11. - P.6205-6212.

8. Karen L. Wozniak, Floyd L., Wormley, Jr., and Paul L. Fidel, Jr.Candida-Specific Antibodies during Experimental Vaginal Candidiasis in Mice Microbiology Infect. Immun. - 2002. - Vol.70. - №10. - P.5790-5799.

9. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993. - Ч.1. - 736 с.

10. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение. - М.: «Триада-Х», 2001. - 472 с.

11. Шабалов Н.П. Неонатология в 2 т. - СПб.: Специальная литература, 1996. - Т.2. - С.28.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к моделированию кандидозной инфекции у экспериментальных животных. Для этого беременным самкам вводят наркотическое вещество, применяемое при внутриполостных операциях, делают разрез брюшной стенки в области матки, вводят в плаценту каждого плода не менее 0,5×10⁶ клеток возбудителя кандидозной инфекции в изотоническом растворе, затем зашивают брюшную стенку. Способ обеспечивает повышение эффективности внутриутробного кандидозного инфицирования. 2 табл., 1 ил.

Способ моделирования кандидозной инфекции у экспериментальных животных, включающий введение животному клеток возбудителя кандидозной инфекции в растворе, отличающийся тем, что беременным самкам вводят наркотическое вещество, применяемое при внутриполостных операциях, делают разрез брюшной стенки в области матки, вводят в плаценту каждого плода не менее 0,5·10⁶ клеток возбудителя кандидозной инфекции в изотоническом растворе, затем зашивают брюшную стенку.