Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к производству вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. Установлено, что основными этиологическими возбудителями заболевания являются гемолитические формы бактерий Moraxlla bovis на фоне интенсивного солнечного УФ-излучения. Инфекционный кератоконънктивит широко распространен во всех странах мира. Частота его проявления в РФ наиболее высока среди молодняка крупного рогатого скота на откормочных площадках с высокой плотностью поголовья и интенсивность развития эпизоотического процесса зависит от степени облучения животных в летние месяцы экстремальным потоком солнечных УФ-лучей и при этом заболевание охватывает от 25 до 90% поголовья.
Наряду с этим, доказано, что вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (герпесвирус типа 1) также может вызвать острый конъюнктивит у этого вида животных. Однако воспалительный процесс при этом не прогрессирует до помутнения роговицы и ее изъязвления, как это имеет место при инфекционном кератоконъюнктивите (Дженсен Р., Маккей Д. Болезни крупного рогатого скота при промышленном откорме. М.: Колос, 1977, - с.127-129; Abinanti F.R., Plumer G.J.: The isolation of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus from Cattle Affected with Conjunctivitis-Observations on the Experimental Infection. // Am. J.Vet Res., 1961, 22, - p.13-17; Hughes J.P. et al. Keratoconjunctivitis Associated with Infectious Bovine Rhinotracheitis. // Am. J. Vet. Med. Ass., 1964, 45, - p.32-42; George W. et al. Bovine Infectious Keratoconjunctivitis: Interaction of Moraxella bovis and Infectious Rhinotrachitis Virus. // Am. J. Vet. Res., 1970, 31, №4 - p.653-662).
Результаты исследований, проведенные в 80-е годы по проблеме инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, показали, что вирус инфекционного ринотрахеита является одним из возбудителей, который вместе с бактериями Moraxella bovis вызывает эту болезнь (Штрауб О.Х. Инфекции крупного рогатого скота, вызываемые вирусом герпеса. - М.: Колос, 1981, - с.33-35).
Другие литературные источники также указывают на то, что вирус инфекционного ринотрахеита может быть первичным возбудителем конъюнктивита, но не кератоконъюнктивита (Rebnun W. et al. Anoutbreak of the conjunctivitis form of infectious bovine rhinotraheitis. // Cornell. Veter., 1978, 68, 3, - p.297-307). В ряде работ высказывается мнение, что вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота создает особо благоприятную среду для патогенного действия основного возбудителя кератоконъюнктивита - бактерий Moraxella bovis.
Позднее было доказано, что менее выраженную этиологическую роль при инфекционном кератоконъюнктивите крупного рогатого скота могут играть также хламидии (Wehr I. et al. Untersuchungen zur Bedeutung der Chlamidien bei der infektiosen Keratokonjunctivitis des Rindes. // Wissensch. Humbold. Univ. Berlin, 1980, 29, 1, - p.61-65), Mycoplasma bovoculi (Langford E.V. Characterization of mycoplasma isolated from infectionus bovine keratoconjunctivitis: M. bovoculi sp. nov. // Can. J. Microbiol., 1973, 19, - p.1435-1444), риккетсии и условно-патогенные бактерии, участвуя преимущественно в формировании смешанных инфекций.
Нерасшифрованность этиологии инфекционного кератоконъюнктивита в нашей стране, отсутствие каких-либо нормативных документов по его диагностике и мерам борьбы, завоз племенного поголовья из стран Западной Европы - скрытых носителей возбудителя, привели к появлению стационарно неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту обширных очагов и сохранению тенденции дальнейшего распространения болезни, наносящей значительный экономический ущерб вследствие снижения удоев и прироста живой массы животных из-за частичной или полной потери зрения (Бобырь В.К. Инфекционные кератоконъюнктивиты крупного рогатого скота в хозяйствах Гомелевской области. // Болезни с.-х. животных и птиц, их профилактика и лечение./УСборник работ ЛВИ, выпуск 39. - Л., 1974, - с.167-179; Андрисян В.Б. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в Северо-Западной зоне РСФСР // Сборник научных трудов ЛВИ. - Л., 1988, - с.6-11; Какоулин Т.Е. Инфекционный кератоконъюнктивит телят в Иркутской области. // И книге: Профилактика болезней молодняка с.-х. животных Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1982, - с.73-75; Гаффаров Х.З. соавт. Эпизоотологические аспекты инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. // Материалы Международной научной конференции, посвященной 125-летию КГАВМ. Казань, 1998, - с.29-31; Гаффаров Х.З., Спиридонов Г.Н., Валебная Л.В. Штамм бактерий Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ", используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. // Патент на изобретение РФ №2145353, приоритет от 15.09.1998 г.; Гаффаров Х.З., Валебная Л.В., Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья и Предуралья. // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы международной научно-практической конференции 23-25 сентября 2002 г., Воронеж, - с.188-191).
Осуществленный эпизоотологический мониторинг в отношении ИКК в 48 хозяйствах 12 районов Республики Татарстан и 29 хозяйствах 8 районов Республики Башкортостан и Удмуртской Республики показал, что заболеваемость телят 1-5 месячного возраста составляет 50-85%, у телят более старшего возраста - 20-25% и среди дойного стада она колеблется в пределах 12-15% (Гаффаров Х.З., Валебная Л.В., Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья и Предуралья. // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы международной научно-практической конференции 23-25 сентября 2002 г., Воронеж, - с.188-191).
Учитывая, что инфекционный кератоконъюнктивит имеет широкое распространение и поражает всех возрастных групп животных, особенно молодняк, вакцинация рассматривается как весьма эффективный метод борьбы с ним. Следует отметить, что проблема специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита во многих странах мира уже решена в 70-90-е годы прошедшего столетия (Hughes D.et. al. Experimenally Induced Bovine Infectious Keratoconjunctivitis: Effectivenes of Intramuscular Vaccination with Viable Moraxella bovis Culture. // Am. J. Vet. Res., 1971, 32, №6, - p.879-886; Pugh G.W. et al. Infectious bovine keratoconjunctivitis in cattle vaccinated and medicated against Moraxella bovis befare parturition. // Am. J. Vet. Res., 1982, 43 №2, - p.320-325; Gwin R. Medicament and method for prodicing immunity the infectious bovine keratoconjunctivitis. // Патент США №4539201 от 3 сентября 1985). Поэтому проблема создания вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в РФ является весьма актуальной. Отечественных аналогов вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, изготовленных на основе гемолитических форм бактерий Moraxella bovis до наших исследований не существует. Наиболее близким аналогом по отношению к предложенной "Ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1" может служить патент США "Moraxella bovis infectious bovine keratoconjunctivitis steam-killed bacterin" 3401219 от 10.1968 г. в котором описывается факт использования иммунизируещего антигена Moraxella bovis, в частности бактерина, который применяется в качестве профилактического средства против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. Бактерии представляют собой инактивированную текучим паром в течение одного часа суспензию бактерий Moraxella bovis. Бактерии способен создать иммунитет против инфекционного кератоконъюнктивита на 6 месяцев. Недостатком данной вакцины является то, что она не защищает животных от кератоконъюнктивита герпесвирусной этиологии.
Задачей изобретения является создание ассоциированной вакцины на основе гемолитических форм бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1, предназначенной для создания специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на территории РФ, и увеличение продолжительности иммунитета до 12 месяцев.
Технический результат изобретения заключается в получении ассоциированной вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью, и расширении ее иммуногенного спектра.
Сущность изобретения заключается в следующем: ассоциированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота содержит антигены гемолитических форм бактерий Moraxella bovis и герпесвируса крупного рогатого скота, депонированные на гидроокиси алюминия, при следующем соотношении компонентов, об.%:
Для изготовления ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 используют запатентованный штамм бактерий Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" (Патент РФ на изобретение №2145353 с приоритетом от 15.09.1998 г.) и новый штамм бактерий Moraxella bovis "Ш3-01", полученный от больного инфекционным кератоконъюнктивитом теленка. Штамм бактерий Moraxella bovis "Ш3-01" характеризуется следующими свойствами: это короткие толстые палочки длиной 1,5-2,0 и в диаметре 0,5-1,0 мкм с округленными концами, расположенные парами или в виде коротких цепочек, спор не образуют, неподвижные, окрашиваются грамотрицательно. На кровяном МПА при рН 7,2-7,6 после 24 часовой инкубации при 37°С образуют колонии диаметром от 1 до 3 мм с зоной β-гемолиза шириной 0,5-2,0 мм. Колонии гладкие, круглые, блестящие, серовато-белые. На МПБ через 24-48 часовой инкубации при 37°С наблюдается помутнение бульона с образованием небольшого осадка. Штамм факультативный аэроб, не ферментирует сахаров, не восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индол, разжижает желатину, т.е. обладает протеолитической активностью, пептонизирует лакмусовое молоко, дает положительную реакцию на оксидазу, которые являются характерными признаками для микроорганизмов семейства Neisseriaceae, рода Moraxella. Штамм вирулентен для белых мышей, вызывает их гибель в течение 24 часов после внутрибрюшинного введения им суточной агаровой культуры в дозе 500 млн. м.к.
Пример 1. Получение матровой расплодки каждого штамма бактерий Moraxella bovis.
Для изготовления вакцины берут ампулы с лиофилизированными культурами производственных штаммов М.bovis; "Г97-ВНИВИ" и "Ш3-01 ", которые растворяют в 0,5-2,0 см3 МПБ и переносят в чашки Петри с 10%-ным кровяным МПА. Выращивание проводят в течение 16-18 часов, затем культуры проверяют на соответствие морфологических, культуральных, ферментативных и вирулентных свойств. Если они соответствуют гемолитическим формам бактерий М.bovis, то их используют для получения бактериальной массы, необходимой для изготовления ассоциированной вакцины.
Штаммы хранят в лиофилизированном виде. Для этого суспензию суточной культуры бактерий Moraxella bovis с концентрацией 50 млрд. м. к. в 1 см3 смешивают защитной средой (снятое молоко с сахарозой 5%, желатиной 1,5%) в соотношении 1:1, расфасовывают в ампулы по 1 см3, высушивают методом сублимации, запаивают ампулы под вакуумом и хранят при температуре +2-8°С.
Пример 2. Выращивание бактериальной массы каждого штамма бактерий Moraxella bovis в отдельности и ее инактивация.
Для получения биомассы культур М. bovis используют МПА, содержащий 10% дефибринированной крови барана. С этой целью указанную среду в стерильных условиях разливают в 1,5 литровые матрасы по 250-300 см, после застывания среды делают посев указанных штаммов путем внесения в каждый матрас по 2 см3 бактериальной суспензии, содержащей по 1 млрд, м. к. в 1 см3. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С. Через 36-48 ч выросшие колонии культур М.bovis смывают 0,02%-ным раствором натрия хлорида, готовят суспензию с концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см3 по бактерийному или оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Культуру проверяют на чистоту, морфологическую и серологическую типичность.
Инактивацию бактериальной взвеси осуществляют формалином. Для этого в микробную взвесь добавляют формалин с содержанием 37-38% активного формальдегида 0,5 см3 на 100 см3 суспензии. Перемешивают и ставят в термостат на 72 ч. Затем берут пробу на полноту инактивации, которую проводят путем посева инактивированных микробных взвесей на кровяной МПА.
Пример 3. Приготовление нативной суспензии герпесвируса крупного рогатого скота и ее инактивация.
Герпесвирус крупного рогатого скота (шт. "ТКА-ВИЭВ-В2") размножают в перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия TR), выращенной в роллерных трехлитровых бутылях на комбинированной ростовой среде, состоящей из среды 199 - 10%, ГЛА - 40%, среды Игла МЭМ - 40% и сыворотки крупного рогатого скота - 10%. Культуру выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации 140-150 тыс. клеток в 1 см3 среды. Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду (среды 199 - 20%, ГЛА - 40% и Игла МЭМ - 40%) в количестве 350-370 см3, в которую предварительно вносят герпесвирус из расчета 10 см3 на 500 см3 среды, 3%-ный раствор глутамина - 5 см3 и антибиотики (стрептомицин - 100 мкг/см3, пенициллин - 100 ЕД./см3). Бутыли инкубируют в роллерной установке при 37-38°С в течение 3-4-х дней. Сбор культуральной жидкости производят путем трехкратного замораживания и размораживания в период выраженного цитопатического эффекта - максимального накопления вируса. Полученные вирусные суспензии объединяют и с целью инактивации вируса добавляют формалин с содержанием активного формальдегида 37-38% из расчета 0,5 см3 на 100 см3 вирусной суспензии, перемешивают и оставляют на 24-36 ч при комнатной температуре, после чего проверяют на бактериальную и грибковую контаминацию. Для приготовления вакцины берут вирусную суспензию без посторонней контаминации. Контроль полноты инактивации герпесвируса крупного рогатого скота проводят путем 3-х последовательных пассажей пробы инактивированной вирусной суспензии, используемой для изготовления ассоциированной вакцины против кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, на перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия TR) с интервалом 5-6 суток. Вирусную суспензию считают инактивированной, если в третьем пассаже не обнаруживается цитопатическое действие вируса.
Пример 4. Приготовление ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1.
Вакцину готовят из антигена герпесвируса крупного рогатого скота с инфекционным титром 107,0-7,5 ТЦД50/мл и производственных штаммов бактерий Moraxella bovis: "Г97-ВНИВИ", "Ш3-01".
Берут герпесвирусную суспензию, к ней добавляют 100-120 млрд.-ную суспензию бактерий Moraxella bovis исходя из расчета 4-5 см3 каждого штамма на 100 см3 вакцинного препарата, а также 6%-ный гель гидроокиси алюминия из расчета 10 см3 на 100 см3 вакцины. Доводят рН вакцины до 7,2-7,4 и расфасовывают при тщательном периодическом перемешивании во флаконы, которые потом закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют. В таблице 1 приведен состав вакцины.
Состав ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1
Пример 5. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и на антигенную активность.
Для проверки на стерильность из 6 флаконов вакцины каждой серии делают посевы по 0,2 см3 на МПБ, МПА, кровяной МПА, МППБ под вазелиновым маслом и агар Сабуро по 2 пробирки на каждый флакон. Посевы со всеми средами выдерживают в термостате при 37°С, а с агаром Сабуро - при 20-22°С в течение 15 суток. Питательные среды должны оставаться стерильными.
Для проверки на безвредность отбирают 10 белых мышей живой массой 17-18 г и вводят им вакцину подкожно в дозе 0,5 см3. Вакцину считают безвредной, если мыши в течение 10 суток после введения вакцины остаются живыми и клинически здоровыми.
Антигенную активность вакцины контролируют на 3-х кроликах живой массой 2,0-2,5 кг, которым вводят препарат подкожно в дозе 2 см3 двукратно с интервалом 14 дней. Через 14 дней после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку с целью установления уровня специфических антител к герпесвирусу типа 1 и антигенам бактерий Moraxella bovis. Титры антител к герпесвирусу крупного рогатого скота должен быть в пределах 1:320-1:640 в ИФА, к штаммам бактерий Moraxella bovis - 1:400-1:1600 в реакции ИФА.
Результаты контроля 24 экспериментальных серий вакцины показали, что все серии биопрепарата были стерильными, безвредными и антигенно-активными. Показатели антигенной активности ассоциированной вакцины представлены в таблице 2.
Производственное испытание экспериментальных серий вакцины было проведено в 8 хозяйствах Республики Татарстан и в одном - Чувашской Республики, неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота, где заболеваемость телят до 6 месячного возраста составляла 24-56%, молодняка до 12 месячного возраста - 19-35% и молодняка старше года и взрослого поголовья 8-22%. Все поголовье крупного рогатого скота в этих хозяйствах вакцинировали ассоциированной вакциной перед выгоном на пастбище двукратно с интервалом 21-30 дней в дозах: телят до 6 месячного возраста - 3 см3, молодняка от 6 до 12 мес. - 5 см3, молодняка старше года и взрослого поголовья - 10 см3. Результаты испытаний вакцины в этих хозяйствах представлены в таблице 4. Из таблицы следует, что ассоциированная вакцина обладает высокой иммуногенной активностью. Применение ее с профилактической целью в 9 стационарно неблагополучных хозяйствах позволило полностью искоренить заболевание в 6 хозяйствах, а в остальных трех - снизить заболевание до единичных случаев.
Пример 6. Назначение, общие сведения и порядок применения ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1.
Вакцина предназначена для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого смешанной инфекцией, обусловленной бактериями Moraxella bovis и вирусом инфекционного ринотрахеита (герпесвирус тип 1) на фоне повышенной солнечной ультрафиолетовой радиации в летние месяцы.
Вакцина представляет собой смесь концентрированных антигенов гемолитических форм бактерий М.bovis и культуральной суспензии герпесвируса типа 1 в оптимальных соотношениях.
По внешнему виду вакцина, депонированная гидроокисью алюминия, непрозрачная жидкость с белым осадком, который при встряхивании флакона легко разбивается, образуя гомогенную взвесь бледно-розового цвета.
Вакцину выпускают в стеклянных флаконах по 100, 200 и 500 см3 с плотно закрытыми резиновыми пробками, обкатанными металлическими колпачками, и этикетируют в соответствии с ТУ.
Вакцина пригодна для применения в течение 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения и транспортировки при температуре 2-10°С.
Вакцину применяют с профилактической целью в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота. Вакцинируют весь нарождающийся молодняк в возрасте 30-35 дней независимо от времени года, а также все поголовье крупного рогатого скота перед выгоном на пастбище. Вакцину вводят подкожно в среднюю треть шеи двукратно с интервалом 21-30 дней в дозах:
- 3 см3 - телятам в возрасте от 1 до 6 мес.;
- 5 см3 - молодняку в возрасте от 6 мес. до года;
- 10 см3- молодняку старше года, коровам и быкам производителям.
Вакцина обеспечивает создание у молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скота иммунитета, который сохраняется в течение года.
За период 1999-2003 гг. изготовлено 814,5 литров ассоциированной вакцины, которая использована в хозяйствах Республики Татарстан, Марий Эл, Башкортостана, Удмуртии и Чувашии, неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота (таблица 3).
Показатели антигенной активности ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 в экспериментальных условиях.
Неблагополучные пункты по инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота, в которых проводилось широкое производственное испытание ассоциированной вакцины.
Показатели эффективности применения ассоциированной вакцины для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, вирусологии и биотехнологии. В качестве антигенов вакцина содержит (об.%): инактивированные суспензии клеток гемолитических штаммов бактерий M.bovis с суммарной концентрацией 100-120 млрд. м.к. в 1 см3: шт. M.bovis "Г97-ВНИВИ" - 4,0-5,0, шт. M.bovis "Ш3-01" - 4,0-5,0, инактивированную культуральную суспензию шт. Herpesvirus bovis типа I "ТКА-ВИЭВ-В2" с инфекционным титром 107,0-107,5 ТЦД50/мл - 78,0-83,0, гель гидроокиси алюминия, 6%-ный раствор - остальное. Вакцина способна повышать уровень накопления специфических защитных антител в сыворотке крови вакцинированных животных и обеспечивать создание иммунитета против инфекционного кератоконъюнктивита, который сохраняется в течение года. 4 табл.
Ассоциированная вакцина для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа I, отличающаяся тем, что в качестве антигенов она содержит инактивированные суспензии клеток гемолитических штаммов бактерий Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" и Moraxella bovis "Ш3-01" с суммарной концентрацией 100-120 млрд м.к. в 1 см3, инактивированную культуральную суспензию герпесвируса типа I шт. "ТКА-ВИЭВ-В2" с инфекционным титром 107,0-7,5 ТЦД50/мл, в качестве адъюванта - 6%-ный раствор геля гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов, об.%:
штаммов бактерий M.bovis с суммарной концентрацией
Инактивированная культуральная суспензия
Herpesvirus bovis типа I "ТКА-ВИЭВ-В2" с
| US 4559201 A, 05.09.1985 | |||
| US 3401219 А, 10.09.1968. |
