ШТАММ БАКТЕРИЙ, Moraxella bovoculi "СХ-Ч6 N-ДЕП" ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 A61K39/00 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и касается выделения, идентификации и селекции штамма Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» - возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота (ИКК), впервые полученного в РФ, который может быть использован для изготовления диагностикумов и вакцин против этой болезни.

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота (ИКК) -острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, светобоязнью, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения пораженного глаза животного. Из литературных источников известно, что заболевание вызывается гемолитическими штаммами бактерий Moraxella bovis (Гаффаров Х.З., Валебная Л.В., Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья и Предуралья / Мат. международ. науч.-практ.конф.: Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. - Воронеж. - 2002. - С.188-191; Карайченцев В.Н., Дунаев Г.В., Русинов А.Ф., Бабенко О.В. Изоляция Moraxella bovis от молодняка крупного рогатого скота при инфекционном кератоконъюнктивите / Ветеринария. - 1992. - №2. - С.26-27; Русинов А.Ф. Инфекционный кератоконъюнктивит у крупного рогатого скота / Информ. бюлл. Укр. акад. аграр. наук. Ин-т эксперим. клинич. вет.медицины, 1995; Arora А.К. Studies on Moraxella bovis isolated from cattle affected with or convalescing from infectious bovine keratoconjunctivitis / Vet. Arhiv. - 1989. - V. 50. - №1. - P. 17-23).

В последние годы установлено, что инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота может быть вызван другими представителями рода Moraxella, в частности бактериями Moraxella bovoculi (Angelos J.A., Spinks P.Q., Ball L.M., George L.W. Moraxella bovoculi sp.nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis // Int J Syst Evol Microbiol - 2007 Apr;57 (Pt 4):789-95; Galvao K.N., Angelos J.A., Ulcerative blepharitis and conjunctivitis in adult dairy cows and association with Moraxella bovoculi // Can Vet J.- 2010 Apr;51(4):400-2; Angelos J.A., Lane V.M., Ball L.M., Hess J.F. Recombinant Moraxella bovoculi cytotoxin-ISCOM matrix adjuvanted vaccine to prevent naturally occurring infectious bovine keratoconjunctivitis. / Vet Res Commun. 2010 Mar; 34 (3); Angelos J. A., Ball L.M. Differentiation of Moraxella bovoculi sp.nov. from other coccoid moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA // J Vet Diagn Invest - 2007 Sep;19 (5):532-(4).

Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызванный бактериями Moraxella bovoculi, мы наблюдали в 4-х хозяйствах Республики Татарстан (в совхоз-техникуме Чистопольского района; ООО «Девятовское», ООО «Хаерби» Лаишевского района и СХГПС «Енали» Апастовского района).

Целью изобретения является выделение, идентификация и получение штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» бактерии Moraxella bovoculi - одного из возбудителей инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, выделенного впервые и до настоящего времени не известного в РФ, циркулирующего у крупного рогатого скота и вызывающего инфекционный кератоконъюнктивит.

Штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» бактерии Moraxella bovoculi выделен из конъюнктивального мешка глаза больного с признаками острого кератоконъюнктивита теленка 7-месячного возраста, принадлежащего совхоз-техникуму Чистопольского района Республики Татарстан, путем посева на кровяной мясопептонный агар. Штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» депонирован в ФГБУ «ВГНКИ».

Дата депонирования: 20 марта 2013 г.

Регистрационный номер: штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ»).

Штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi характеризуется следующими свойствами:

Морфологические признаки. Штамм представляет собой грамотрицательные диплококки с редко встречающимися кокками: диаметр клеток составляет 0,7-1,3 мкм, смежные стороны клеток утолщены, спор не образует.

Культуральные свойства. На кровяном мясопептонном агаре при рН от 7,2 до 7,6 штамм формирует колонии белого цвета диаметром <1 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, влажной поверхностью, имеют зону 3-гемолиза вокруг или под (когда отбирают колонии) каждой колонией. На триптозо-соевом бульоне через 48-72 ч инкубации при 37°С наблюдается скудный рост, который по мере инкубации становится слегка мутноватым, образуется осадок, который при взбалтывании разрушается на грубые частицы. Штамм стойко сохраняет S-форму и не диссоциирует при многократных пересевах на питательных средах.

При определении ферментативных и протеолитических свойств установлено, что штамм не ферментирует сахаров (сахароза, глюкоза, манит, лактоза, сорбит), не образует индол; не разжижает желатину; дает положительную реакцию на оксидазу и отрицательную на пробу с лакмусовым молоком.

Антигенные свойства. Штамм характеризуется полным набором антигенов, типичных для Moraxella. Штамм активно образует эндотоксин, переходящий в анатоксин под действием тепла и формалина. Продуцируемый токсин обладает гемолитическим и некротическим действиями.

Вирулентные свойства. ЛД₅₀ штамма бактерий «СХ-Ч6 №-ДЕП» для белых мышей составляет 5,0×10⁸ микробных клеток/см³. Телята 1-2 - месячного возраста в полевых условиях сравнительно легко заражаются путем введения в конъюнктивальный мешок 24-часовой культуры в дозе 1,0 см³, содержащей не менее 1,0×10⁹ микробных клеток, при наличии естественного или искусственного ультрафиолетового их облучения.

Иммуногенная активность. Инактивированная формалином культура штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi при подкожном введении индуцирует у телят 2-4-месячного возраста образование специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови в титрах 1:1280 -1:5120, а также формирование специфического иммунитета.

Хранение штамма. Полученный штамм выращивают при 37°С на мясопептонном кровяном агаре в течение 24 ч, смывают стерильным физиологическим раствором. Суспензию Moraxella bovoculi в концентрации 50 млрд микробных клеток в 1 см³ смешивают защитной средой (5% сахарозы, 1,5% желатины) в соотношении 1:1, расфасовывают в ампулы по 1 см³, высушивают методом сублимации, запаивают ампулы под вакуумом и хранят при 2-4°C.

Пример 1. Штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi используют для идентификации культур, выделяемых от больных животных с признаками кератоконъюнктивита, в реакции преципитации в агаровом геле (РДП).

Гипериммунную сыворотку к бактериям Moraxella bovoculi получают на кроликах с живой массой 3,0-3,5 кг путем 4-кратного подкожного введения инактивированной культуры штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi с интервалом 7 дней. Инактивация штамма достигается путем выдерживания суспензии культуры в водяной бане при температуре 56°C в течение одного часа. Антиген для РДП изготовляют из штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi, выращенного на кровяном мясопептонном агаре при температуре 37°C в течение 24 ч. Снимают выращенные колонии, переносят в холодную дистиллированную воду и ресуспендируют. Концентрация бактерий должна быть в пределах от 6,0×10⁷ до 7,5×10⁸. Полученную суспензию трехкратно замораживают при 60°C и оттаивают при 25°C, центрифугируют для осаждения грубых частиц и надосадочную жидкость используют в качестве антигена в РДП. Реакцию ставят по общепринятой методике. Для идентификации антигена в центральную лунку заливают специфическую сыворотку, а в периферические - испытуемые антигены и антиген, приготовленный из штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» бактерии Moraxella bovoculi.

Пример 2. Штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» бактерий Moraxella bovoculi используется для изготовления антигена, предназначенного для определения специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi, - методом иммуноферментного анализа (ИФА). С этой целью растворимый антиген получают путем озвучивания суточной культуры бактерий Moraxella bovoculi на ультразвуковом дезинтеграторе. После дезинтеграции суспензию Moraxella bovoculi центрифугируют при 6 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в пробирку и туда добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ) до конечной концентрации 5%. Смесь центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок дважды промывают в 5%-ном растворе ТХУ, затем осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и диализируют против водопроводной воды в течение 18 ч, затем лиофилизируют.

Гипериммунную сыворотку получают на телятах 6 - 7-месячного возраста путем 4-кратного подкожного введения инактивированной культуры Moraxella bovoculi с интервалом 7 дней в нарастающих дозах. Постановка ИФА осуществляется по общепринятой методике. При этом в качестве конъюгата используются антитела диагностические против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой. Учет реакции проводят по показаниям оптической плотности субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность субстратно-индикаторной смеси в лунках, в которых предварительно инкубировали положительную специфическую сыворотку и исследуемые сыворотки, в 2 и более раза превышает оптическую плотность в лунках, в которых предварительно инкубировали отрицательную (контрольную) сыворотку.

Сравнительные данные исследований сывороток крови телят методом ИФА представлены в таблице. Из таблицы видно, что штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi пригоден для изготовления диагностических препаратов методом ИФА. У больных кератоконъюнктивитом телят выявляются титры антител к Moraxella bovoculi в ИФА в титрах 1:1280 -1:5120.

Пример 3. Штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» бактерии Moraxella bovoculi используется при изготовлении инактивированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита. С этой целью штамм выращивают на кровяном мясопептонном агаре в течение 24 ч, выросшие колонии смывают физиологическим раствором, устанавливают концентрацию бактерий 10 млрд м.к. в 1 см³, инактивируют суспензию путем добавления формалина до 0,5%-ной конечной концентрации. Затем к инактивированной суспензии бактерий добавляют гель гидроокиси алюминия до 0,6%-ной концентрации. Вакцину расфасовывают по 100 см³ в стерильные флаконы. Вакцина, изготовленная из штамма «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi, при двукратном подкожном введении с интервалом 14 дней в дозе 5 см³ индуцирует у телят образование специфических антител в сыворотке крови к Moraxella bovoculi в титрах 1:1280 - 1:2560 в ИФА и формирование напряженного иммунитета продолжительностью до 12 месяцев.

Таким образом, результаты исследований показали, что штамм «СХ-Ч6 №-ДЕП» Moraxella bovoculi можно использовать при изготовлении набора препаратов для диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота методом ИФА (специфический антиген и гипериммунная сыворотка), а также в качестве вакцинного штамма при изготовлении вакцины против этой болезни.

Таблица №№   Титр Кэффиц. проб Состояние теленка антител чувствительности 1 больной кератоконъюнктивитом 1:2560 2,43 2 больной кератоконъюнктивитом 1:1280 2,58 3 больной кератоконъюнктивитом 1: 1280 2,48 4 больной кератоконъюнктивитом 1:5120 2,25 5 больной кератоконъюнктивитом 1:2560 2,21 6 здоровый - - 7 здоровый - - 8 здоровый - - 9 здоровый - - 10 здоровый - -

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм Moraxella bovoculi обладает антигенными, вирулентными свойствами и иммуногенной активностью. Депонирован под номером «СХ-Ч6 №-ДЕП» во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ». Штамм может найти применение для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. Изобретение позволяет изготовлять диагностикумы и вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. 1 табл., 3 пр.

Штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 №-ДЕП», используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, депонированный во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ».