Штамм Moraxella bovoculi "ВК-2", используемый для изготовления диагностикумов и средств специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии и касается выделения, идентификации и селекции штамма Moraxella bovoculi «ВК-2» - основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, который может быть использован для изготовления диагностикумов и средств специфической профилактики против данной болезни. Новый штамм Moraxella bovoculi «ВК-2» депонирован в Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Согласно определителю бактерий Берджи 1984 г. род Moraxella, предложенный Lwoff (1939), относился к семейству Neisseriaceae. Однако с современных позиций таксономии, на основе изучения 16S рРНК и анализа рРНК-ДНК гибридизации, в настоящее время род Moraxella отнесен к семейству Moraxellaceae. Известно 20 представителей этого рода, большинство которых связаны с болезнями человека. Относительно недавно признанный новый вид - Moraxella bovoculi, который был выделен при ИКК у молочных коров калифорнийскими учеными [1].

Вероятно, бактерии Moraxella bovoculi существовали в популяции крупного рогатого скота в течение долгого времени. Все грамотрицательные кокки, выделяемые ранее от крупного рогатого скота при ИКК, которых определяли как «Moraxella ovis», фактически являлись Moraxella bovoculi. Благодаря современным методам молекулярного анализа удалось различить Moraxella ovis и Moraxella bovoculi.

Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) или «pink еуе» (розовый глаз) - острое контагиозное заболевание, характеризующееся слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения пораженного глаза животного [2].

Болезнь поражает крупный рогатый скот всех возрастов и пород, по некоторым данным лошадей, овец, свиней и собак, имевших контакт с больными животными, но у них болезнь проявляется спорадически. Заболевание имеет тенденцию к широкому распространению в крупных животноводческих комплексах с высокой концентрацией и плотностью поголовья животных и причиняет таким хозяйствам большой экономический ущерб за счет выбраковки животных, из-за потерь племенной ценности, снижения удоев до 50% и прироста массы тела на 31-37%, иногда падежа, а также высоких затрат на проведение лечебных и оздоровительных мероприятий.

Причиной инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота является сочетание физического фактора и биологического возбудителя. Ведущая роль при его возникновении принадлежит гемолитическим бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi на фоне солнечного ультрафиолетового облучения или других возможных предрасполагающих факторов.

В настоящее время инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в большинстве регионах РФ вызывается бактериями Moraxella bovoculi. Это мы наблюдали в скотоводческих хозяйства Татарстана, Башкортостана, Челябинской, Ленинградской, Новосибирской и Воронежской областей. Клинические признаки болезни, вызванные бактериями Moraxella bovoculi, были сходны с таковыми при поражении с бактериями Moraxella bovis.

Известен штамм бактерий Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 N-ДЕП» используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота (см. патент RU 2 521 651, МПК C12N 1/20, Опубл.: 10.07.2014 Бюл. №19). Недостатком данного штамма является узкая направленность.

Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении заявляемого изобретения, состоит в расширении арсенала штаммов, предназначенных для производства и контроля средств диагностики и специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

Технический результат направлен на расширения арсенала штаммов, предназначенных для производства и контроля средств диагностики и специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

Целью изобретения является выделение, идентификация и получение штамма «ВК-2» бактерии Moraxella bovoculi - одного из возбудителей инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, выделенного впервые и до настоящего времени не известного в РФ, циркулирующего у крупного рогатого скота и вызывающего инфекционный кератоконъюнктивит.

Новый эпизоотический штамм Моrахеllа bovoculi «ВК-2» депонирован в Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», под номером 89 (420075, Россия, РТ, г. Казань, Научный городок - 2, ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»). Дата депонирования 15.05.2024.

Штамм «ВК-2» Moraxella bovoculi характеризуется следующими свойствами:

Родовое и видовое название штамма (на латинском языке):

семейство Moraxellaceae, род Moraxella, вид Moraxella bovoculi, происхождение (источник выделения, родословная):

Штамм Moraxella bovoculi «ВК-2» выделен в 2022 году из слезной жидкости больного инфекционным кератоконъюнктивитом теленка, принадлежащего ООО «Восток» Кукморского района Республики Татарстан.

Генно- и хемотаксономическая характеристика.

Образец No._4_16S-8F_E04 (FP)

Образец No._4_16S-1492R_F04 (RP)

Морфологические признаки. Штамм представляет собой грамотрицательные диплококки с редко встречающими кокками, диаметр клеток составляет от 0,7 мкм до 1,2 мкм, смежные стороны утолщены, спор не образуют.

Культуральные свойства. На кровяном мясопептонном агаре штамм формирует колонии белого цвета диаметром до 1 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, влажной поверхностью с зоной гемолиза вокруг и под колонией. На триптозо-соевом бульоне через 48-72 ч инкубации при температуре от 36,0°С до 37°С наблюдается скудный рост, образуя на дне пробирки осадок, разрушаемый при взбалтывании. Штамм стойко сохраняет S-форму и не диссоцирует при многократных пересевах на питательных средах.

Штамм не ферментирует Сахаров (сахароза, глюкоза, манит, лактоза, сорбит), не образует индол, не разжижает желатину, дает положительную реакцию на оксидазу и отрицательную на пробу с лакмусовым молоком.

Антигенные свойств. Штамм характеризуется полным набором антигенов, типичных для бактерий рода Moraxella. Штамм активно продуцирует эндотоксин, переходящий под действием тепла и формалина в анатоксин. Продуцируемый токсин обладает гемолитическим и некротическим действием.

Иммуногенная активность. Суточная агаровая культура штамма Moraxella bovoculi «ВК-2», инактивированная формалином, при подкожном введении вызывает у телят 4-5-месчного возраста образование специфических антител в сыворотке крови к бактериям Moraxella bovoculi в тирах от 1:1280 до 1:5120 в ИФА, а также формирование специфического иммунитета.

Вирулентность. При внутрибрюшинном заражении 18-20-часовой культурой, выращенной на кровяном мясопептонном агаре, в дозе 500 млн м.к. гибель белых мышей наступает в течение 48 ч после заражения.

Чувствительность к антибиотикам. Чувствителен к бензилпенициллину, стрептомицину, гентамицину, цефтриаксону, ципрофлаксацину, азитромицину, офлоксацину, тилозину, сульфаниламиду.

Хранение штамма. Суточную агаровую культуру в концентрации 50 м.к. в 1 см³ смешивают защитной средой (1,5% желатины, 5% сахарозы, рН среды 7,0-7,2) в соотношении 1:1, расфасовывают в ампулы по 1 см³, высушивают методом сублимации, запаивают ампулы под вакуумом и хранят при температуре от 2°С до 4°С.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамма Moraxella bovoculi «ВК-2» используется при изготовления диагностикума - иммуноферментной тест-системы (ИФА тест-система) для определения специфических антител к антигену бактерий Moraxella bovoculi в сыворотке крови больных инфекционным кератоконъюнктивитом животных, а также у вакцинированных против этой болезни.

Для постановки реакции ИФА необходимо иметь антиген, контрольные отрицательную и положительную к антигену бактерий Moraxella bovoculi сыворотки. Положительную сыворотку получают на телятах от 6 мес до 10 мес возраста путем гипериммунизации их суточной агаровой культурой штамма Moraxella bovoculi «ВК-2», инактивированной формалином. Антиген животным вводят подкожно четырехкратно с интервалом 14 сут в нарастающих дозах. Отбор крови от животных для получения положительной сыворотки осуществляют на 21 сут после заключительного введения антигена. Контрольную отрицательную сыворотку получают от клинически здоровых телят до 12 мес возраста из благополучного по инфекционному кератоконъюнктивиту хозяйства.

Специфический антиген, необходимый для сенсибилизация полистироловых планшет, получают из суточной агаровой культуры Moraxella bovoculi «ВК-2». Для этого суспензию бактерий Moraxella bovoculi с концентрацией 20 млрд. м.к. в 1 см³ озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе с частотой 20 мГц в течение от 10 мин до 15 минут при 4°С до полного разрушения клеток. Затем эндотоксин осаждают сульфатом аммония при 40% насыщении рН 7,0 и очищают антиген дифференцированным растворением преципитата в 0,02 М фосфатном буфере рН 6,8 с последующим диализом против водопроводной воды.

Реакцию ИФА ставят по общепринятой методике. Учет реакции проводят по показаниям оптической плотности субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность субстратно-индикаторной смеси в лунках, в которых предварительно инкубировали положительную специфическую сыворотку и исследуемые сыворотки, в 2 и более раза превышает оптическую плотность в лунках, в которых предварительно инкубировали отрицательную контрольную сыворотку.

Сравнительные данные исследований сывороток крови телят методом ИФА представлены в таблице 1. Из таблицы видно, иммуноферментная тест-система позволяет обнаруживать специфические антитела к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови больных и вакцинированных против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в титрах от 1:1280 до 1:5120, тогда как сыворотки крови от здоровых не вакцинированных животных дают отрицательную реакцию в ИФА. Следовательно, штамм Moraxella bovoculi «ВК-2» пригоден для изготовления диагностических препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови животных. ИФА тест-система, изготовленная на основе антигена штамма Moraxella bovoculi «ВК-2», позволяет диагностировать инфекционный кератоконъюнктивит у больных животных и определить напряженность поствакцинального иммунитета у вакцинированных животных путем определения в сыворотке крови титров специфических антител.

Пример 2. Штамм Moraxella bovoculi «ВК-2» используется при изготовлении инактивированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. С целью получения бактериальной массы производственного штамма, его выращивают на кровяном МПА в условиях термостата при температуре от 36,0°С до 37°С в течение 24 ч. Выросшие колонии смывают физиологическим раствором, доводят концентрацию бактерий до 10 млрд м.к. в 1 см³ и добавляют формалин с целью инактивации до 0,5% конечной концентрации. Выдерживают 3 сут в условиях термостата при температуре от 36,0°С до 37°С в течение 72 ч. Затем к бактериальной суспензии добавляют 6% гель гидроокиси алюминия (10% к объему) в качеств адъюванта и расфасовывают во флаконы по 100 см³ или 200 см³. Готовую вакцину проверяют на стерильность, безвредность, антигенную активность. Безвредность вакцины проверяют на белых мышах путем подкожного введения им вакцины в дозе 0,5 см³. Антигенную активность изучают на кроликах массой от 2,5 кг до 3,5 кг и телятах от 2 мес до 3 мес возраста путем подкожного введения вакцины кроликам в дозе 2 см³, телятам - 5 см³. Инактивированная вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита, изготовленная на основе антигена штамма бактерий Moraxella bovoculi «ВК-2», индуцирует у животных образование специфических антител к бактериям Moraxella bovoculi в сыворотке крови от 1:1280 до 1:5120.

Таким образом, производственный штамм Moraxella bovoculi «ВК-2» обладает всеми культурально-морфологическими свойствами, характерными для этого вида бактерий и пригоден для изготовления средств диагностики и специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызванного бактериями Moraxella bovoculi.

Список использованной литературы

1. Angelos J.A. Differentiation of Moraxella bovoculi sp.nov. from other coccoid Moraxellae by the use of polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis of amplified DNA / J.A. Angelos, L. M. Ball // J. Vet. Diagn. Invest. - 2007a. - V. 19. P. 532 - 534; Angelos J. A. Moraxella bovoculi sp.nov., isolated from calves with infectious bovine keratoconjunctivitis / J.A. Angelos, P.Q. Spinks, L.M. Ball, L.W. George // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2007c. - V. 57. P. 789-795.

2. Карайченцев B.H. Диагностика инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого Moraxella bovis / B.H. Карайченцев // Матер, межд. науч.- практ. конф. "Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе". - Санкт - Петербург.- 2004. - С.48-49; Спиридонов Г.Н. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных. - Труды межд. научн.-производ. конф., посвященной 50-летию ВНИИВВиМ. - том 2. - Покров. - 2008. - С.195-197.

Штамм Moraxella Bovoculi «ВК-2», используемый для изготовления диагностикумов и средств специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной микробиологии. Штамм Moraxella bovoculi «ВК-2» - возбудитель инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, депонирован в Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» под регистрационным номером 89. Изобретение обеспечивает расширения арсенала средств, предназначенных для изготовления диагностикумов и средств специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. 1 табл., 2 пр.

Штамм Moraxella bovoculi «ВК-2», депонированный в Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» под регистрационным номером 89, для изготовления диагностикумов и средств специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.