ШТАММ БАКТЕРИЙ MORAXELLA BOVIS "Г97-ВНИВИ", ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K39/95 G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии и касается выделения, идентификации и селекции штамма Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" - основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота (ИКК), впервые установленного в РФ и странах СНГ, который может быть использован для изготовления диагностикумов и вакцин против данной болезни.

Из источников научно-технической литеарутры известно, что в нашей стране первые сообщения об эпизоотических вспышках ИКК, имевшие место в хозяйствах Гомельской области и Северо-Западной зоне РСФСР, появились лишь в 70-80-е годы (Бобырь В.К. "Инфекционные кератоконъюнктивиты крупного рогатого скота в хозяйствах Гомельской области." //Болезни с.-х. животных и птиц, их профилактика и лечение. //Сборник работ ЛВИ, выпуск 39. - Л., 1974, с. 167 - 179; Андриасян В.Б. "Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота в Северо-Западной зоне РСФСР. " //Инфекционные болезни с.-х. животных. //Сборник научных трудов ЛВИ. - Л., 1988, с. 6 - 11), в которых описаны только лишь клинико-эпизоотологические особенности болезни и отсутствуют данные по выделению, идентификации и получению штаммов возбудителя, его этиологической роли в возникновении болезни и результаты изучения его биологических свойств.

Нерасшифрованность этиологии болезни в нашей стране, отсутствие методов и средств диагностики и специфической профилактики ИКК крупного рогатого скота привели к появлению стационарно-неблагополучных по инфекционному кератоконъюнктивиту очагов и сохранению тенденции дальнейшего распространения болезни, наносящей значительный экономический ущерб вследствие снижения удоев и прироста массы животных из-за частичной или полной потери зрения.

Целью изобретения является выделение, идентификация и получение штамма "Г97-ВНИВИ" бактерий Moraxella bovis - основного возбудителя данной формы патологии, полученного впервые и до настоящего времени неизвестного в РФ и странах СНГ, циркулирующего у крупного рогатого скота и вызывающего инфекционный кератоконъюнктивит.

Штамм "Г97-ВНИВИ" выделен из пробы смыва глаз больного теленка (с признаками острого конъюнктивита) Учхоза Казанской государственной академии ветеринарной медицины Республики Татарстан путем 50-кратного пассажа на кровяном агаре и постоянной селекции культур после каждого пересева по S-форме колоний и по способности вызывать гемолиз эритроцитов в кровяной агаровой среде, характеризующей их вирулентность. Этот штамм депонирован в коллекции микроорганизмов спецлаборатории (банк) Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института. Регистрационный номер, присвоенный штамму 08.06.1998 г. N 1.

Штамм Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. Штамм представляет собой короткие толстые палочки длиной 1,5 - 2,0 и в диаметре 0,5 - 1,0 мкм с округленными концами, обычно наблюдается парами или в виде коротких цепочек. Старые культуры прогрессивно становятся плеоморфными; штамм микроорганизма неподвижный, не образует спор; окрашивается грамотрицательно.

Культуральные свойства. На кровяном агаре при pH от 7,2 до 7,6 штамм Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" после 24-часовой инкубации при 37^oC образует колонии диаметром от 1,0 до 3,0 мм в диаметре с зоной бета-гемолиза шириной 0,5 - 1,0 мм. Колонии круглые, выпуклые в центре, блестящие, полупрозрачные, серовато-белые, слегка вросшие в среду.

После 48-часовой инкубации колонии становятся в диаметре 3-4 мм и бывают с гладкими краями. Зона гемолиза двукратно увеличивается при ее инкубации в течение 24 часов при 37^oC и дополнительно в течение 24 часов при 25^oC.

На триптозо-соевом бульоне через 48 - 72 ч инкубации при 37^oC наблюдается скудный рост, который по мере старения слегка мутноватый, но образуется осадок, который при взбалтывании разрушается на грубые частицы.

При инкубации в условиях реактора бульон становится мутнее через 24 часа с образованием небольшого количества осадка. Рост в дальнейшем усиливается при добавлении в 5%-ном объеме кроличьей или телячьей сыворотки. Штамм стойко сохраняет S-форму и не диссоциирует при многократных пересевах на питательных средах.

Ферментативные свойства. Штамм "Г97-ВНИВИ" - факультативный аэроб, не ферментирует сахаров, не восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индола; разжижает желатину, т.е. обладает протеолитической активностью; проба на оксидазу дает положительный результат, что является характерным признаком для микроорганизмов семейства Neisseriaceae, рода Moraxella.

При 24-часовой инкубации селекционированный штамм M. bovis в ламусовом молоке образует темную синюю полосу в верхней части пробирки, а при дальнейшей инкубации среда прогрессивно становится более щелочной. В течение 6 дней появляется отчетливо выраженные 3 зоны: в верхней части - темно-синяя жидкость, средняя зона - лилового цвета, творожистая по консистенции, а нижний слой - коагулированный казеин бледно-лилового цвета.

Продолжение инкубации приводит к полной пептонизации лакмусового молока однородного ярко-розового цвета.

Антигенные свойства. Штамм характеризуется полным набором антигенов, типичных для Moraxella bovis.

Вирулентные свойства. Штамм имеет стабильную высокую вирулентность для белых мышей массой 12 - 16 г: вызывает быструю смертность их (от 1 до 3 часов) после интраперитонального введения свежей живой культуры в дозе 0,5 мл.

Штамм активно образует эндотоксин, переходящий в анатоксин под действием тепла и формалина. Продуцируемый токсин обладает гемолитическим и некротическим действиями и является смертельным для мышей и кроликов.

Телята 1 - 2-месячного возраста сравнительно легко заражаются путем введения в конъюнктивальный мешок 24-часовой культуры в дозе 0,5 мл, содержащей не менее 3 • 10⁶ микробных клеток при наличии естественного или искусственного ультрафиолетового их облучения.

Иммуногенная активность селекционированного штамма "Г97-ВНИВИ" в 2,1 - 2,5 раза выше по сравнению со смесью полевых культур Moraxella bovis, выделяемых от естественно больных животных, что обусловлено полноценностью антигенной структуры и более высокой его биологической активностью.

Хранение штамма. Полученный штамм выращивают при 37^oC на мясопептонном кровяном агаре в течение 24 часов, смывают стерильным физиологическим раствором. Суспензию M. bovis в концентрации 50 млрд. микробных клеток в 1 мл смешивают защитной средой (5% сахарозы, 1,5% желатины) в соотношении 1:1, расфасовывают в ампулы по 1 мл, высушивают методом сублимации, запаивают ампулы под вакуумом и хранят при 2 - 8^oC.

Пример 1. Штамм M. bovis "Г97-ВНИВИ" используют для идентификации культур, выделяемых от больных животных с признаками кератоконъюнктивита, в реакции преципитации в агаровом геле (РДП).

Гипериммунную сыворотку получают на кроликах с живой массой 3,0 - 3,5 кг путем 5-кратного подкожного введения инактивированной культуры M. bovis с интервалом 7 дней. Инактивация штамма достигается путем выдерживания суспензии культуры в водяной бане при температуре 56^oC в течение одного часа.

Антиген для РДП изготовляют из штамма "Г97-ВНИВИ", выращенного на кровяном мясопептонном агаре при температуре 37^oC в течение 24 часов. Снимают выращенные колонии, переносят в холодную дистиллированную воду и ресуспендируют. Концентрация клеток микроорганизма должна быть не меньше от 5,1 • 10⁶ до 7,5 • 10⁸. Полученную суспензию трехкратно замораживают при 60^oC и оттаивают при 25^oC, центрифугируют для осаждения грубых частиц и надосадочную жидкость используют в качестве антигена в РДП.

Реакцию ставят по общепринятой методике. Для идентификации антигена в центральную лунку заливают специфическую сыворотку, а периферические - испытуемые антигены и антиген, приготовленный из селекционированного штамма "Г97-ВНИВИ" M. bovis.

Пример 2. Штамм M. bovis "Г97-ВНИВИ" используют при изготовлении антигена для диагностики инфекционного кератоконъюнктивита методом иммуноферментного анализа (ИФА). Растворимый антиген получают из M. bovis путем озвучивания на ультразвуковом дезинтеграторе. После дезинтеграции суспензию M. bovis центрифугируют при 6 тыс. об./мин. Надосадочную жидкость отсасывают в пробирку и туда добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ) до конечной концентрации 5%.

Препарат центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок дважды промывают в 5%-ном растворе ТХУ, затем осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и диализируют против водопроводной воды в течение 18 часов, затем лиофилизируют.

Гипериммунную сыворотку получают на телятах 2-3-месячного возраста путем 5-кратного подкожного введения инактивированной культуры M. bovis с интервалом 7 дней. Инактивация штамма достигается путем выдерживания суспензии культуры в водяной бане при температуре 56^oC в течение одного часа.

Постановка ИФА осуществляется по общепринятой методике. Коньюгатом служат антитела диагностические против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой. Учет реакции проводят спектрофотометрически при длине волны 492 нм. За положительный результат принимается коэффициент чувствительности (отношение оптической плотности контрольной реакции с отрицательной сывороткой), равный или больше 2,0.

Сравнительные данные исследований сывороток крови телят методом ИФА представлены в таблице.

Из таблицы видно, что штамм M. bovis "Г97-ВНИВИ" пригоден для изготовления диагностических препаратов методом ИФА. У больных кератоконъюнктивитом телят выявляются титры антител к M. bovis в ИФА в титрах 1:640 - 1:1280.

Пример 3. Штамм M. bovis "Г97-ВНИВИ" используют при изготовлении инактивированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита. С этой целью штамм выращивают на кровяном мясопептонном агаре в чашках Петри в течение 24 часов, смывают физиологическим раствором, устанавливают концентрацию 6 млрд. /см³ микробных клеток и инактивируют путем добавления формалина до конечной концентрации 0,5%. После установления стерильности к инактивированной культуре добавляют гидроокись алюминия до 1%-ной концентрации. Вакцину расфасовывают по 100 см³ в стерильные флаконы.

Вакцина, изготовленная из штамма M. bovis "Г97-ВНИВИ", защищает при двукратном введении от гибели 90 - 100% белых мышей и кроликов, зараженных живыми клетками полевых культур M. bovis (при гибели 80 - 100% невакцинированных животных) при введении 0,5 - 2,0 млрд. микробных тел. Вакцина при двукратном подкожном введении с интервалом 30 дней в дозе 5 см³ индуцирует у телят формирование специфических антител в сыворотке крови к M. bovis в титрах 1:400 - 1:1600 в ИФА.

Таким образом, результаты проверки показали, что диагностическая сыворотка к штамму Moraxella bovis обладает более высокой активностью по сравнению с сывороткой к полевым культурам бактерий Moraxella bovis рода Moraxella, а перечисленные данные указывают на возможность использования заявленного штамма Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" в качестве вакцинного против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.

Изобретение предназначено для диагностики и профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота. Новый штамм Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ" депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИВИ. Штамм стойко сохраняет S-форму и не диссоциирует при многократных пересевах. Характеризуется полным набором антигенов, типичных для Moraxella bovis. Изобретение позволит предотвратить распространение инфекционного кератоконъюнктивита, наносящего значительный экономический ущерб. 1 табл.

Штамм бактерий Moraxella bovis "Г97-ВНИВИ", используемый для изготовления диагностикумов и вакцин против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.