СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ SALMONELLA TYPHIMURIUM ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ВАКЦИН Российский патент 2005 года по МПК A61K39/112 C12N1/00 C12N1/00 C12R1/42 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к методам инактивации микроорганизмов при изготовлении вакцин.

Исторически более ранними из всех вакцин являются живые вакцины. Сравнительно более поздними наблюдениями было установлено, что иммуногенными свойствами обладают не только живые, но и убитые микроорганизмы [1], [2].

Убитые вакцины получают нагреванием или используя другие методы физического и химического воздействия на микроорганизмы. Поэтому различают гретые, феноловые, формалиновые, спиртовые, ацетоновые вакцины. Могут быть применены ультрафиолетовое облучение, ультразвук и другие средства [1], [2].

Цель изобретения: разработка нового метода инактивации микроорганизмов при изготовлении вакцин, в частности, для специфической профилактики сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.

Предлагаемый метод отличается от известных методов химического воздействия на микроорганизмы для получения убитых вакцин тем, что культуру сальмонелл обрабатывают 10%-ным водным раствором аммиака до конечной концентрации 1% в течение 5 часов с последующей отмывкой стерильным 0,9% раствором NaCl, pH 7,0 для удаления аммиака.

Щелочная среда и NH₃ ^- ионы, создаваемые раствором аммиака, приводят к нарушению метаболических процессов и разрыхлению клеточной стенки сальмонелл, что приводит к их гибели.

Способ инактивации Salmonella typhimurium при изготовлении вакцин выполняют следующим образом:

- культуру Salmonella typhimurium выращивают на МПА с использованием посевной дозы 3 млрд микробных клеток в течение 2-х суток при +37°С с последующей отмывкой стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0) и доведением концентрации до 100 млрд микробных клеток/мл;

- к полученной смеси сальмонелл добавляют 10% водный раствор аммиака до конечной концентрации 1%;

- смесь инкубируют в течение 5 часов в условиях термостата при +37°С;

- после экспозиции проводят центрифугирование суспензии сальмонелл при 5000 g в течение 15 минут;

- надосадочную жидкость сливают;

- осадок ресуспензируют стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0) с доведением концентрации сальмонелл до 4-100 млрд микробных клеток/мл.

Для контроля качества инактивации проводили высевы полученной суспензии сальмонелл на МПА в чашках Петри методом серийного разведения в 10^-5, 10^-3 и 10^-1 степени (по 2 чашки на каждое разведение).

Чашки Петри выдерживали в условиях термостата при 37°С в течение 8 суток. При этом рост сальмонелл на чашках Петри отсутствовал во всех испытуемых контрольных образцах (n=10)

Полученную микробную взвесь сальмонелл использовали в качестве средства для специфической профилактики сальмонеллеза па лабораторных животных. В качестве модели использовали белых мышей.

Белых мышей, отобранных по принципу аналогов, в количестве 15 голов в возрасте 5 недель живой массой 16-18 грамм (n=3) иммунизировали суспензией культуры сальмонелл Salmonella typhimurium, инактивированных 1% раствором аммиака. Вакцину вводили подкожно в дозе по 0,3 мл с содержанием 4 млрд микробных клеток сальмонелл в 1 мл двукратно с интервалом 7 дней.

У 5 вакцинированных белых мышей (n=3) через 14 дней после иммунизации брали кровь для проведения серологических исследований в реакции агглютинации (РА). В качестве антигена использовали суспензию бактерий из штамма Salmonella typhimurium согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных [2]. Титры антител в РА у опытных мышей были в пределах 1:160-1:320 (++++), что свидетельствует о выработке поствакцинальных специфических антител.

Через 14 дней после вакцинации опытных мышей заражали вирулентной культурой сальмонелл Salmonella typhimurium внутрибрюшинно в дозе 200 LD₅₀ в объеме 0,3 мл с содержанием 3 млн микробных клеток/мл.

Параллельно заражали вирулентной культурой сальмонелл Salmonella typhimurium контрольную (интактную) группу белых мышей в количестве 10 голов внутрибрюшинно в дозе 0,3 мл с содержанием 3 млн микробных клеток/мл (200 LD₅₀).

При этом наблюдали гибель белых мышей контрольной группы на 3-5 день после заражения. Все мыши опытной группы, которым вводили подкожно суспензию культуры сальмонелл Salmonella typhimurium, инактивированной 1% раствором аммиака, выжили.

Полученные данные дают основания считать, что предлагаемый способ инактивации Salmonella typhimurium при изготовлении вакцин пригоден для изготовления вакцинных препаратов с целью специфической профилактики сальмонеллезов сельскохозяйственных животных.

Источники информации

1. Аркадьева З.А., Безбородов A.M., Блохина И.Н. и др. Промышленная микробиология: учеб. пособие для вузов. - М.: Высшая школа, 1989. - С.571.

2. Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды (методические указания). - М.: ВО "Агропромиздат", 1990.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Предложен способ инактивации Salmonella typhimurium. Способ включает выращивание культуры Salmonella typhimurium, отмывку стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0), обработку 10% водным раствором аммиака до конечной концентрации 1% и инкубирование смеси 5 часов, далее проводят центрифугирование суспензии сальмонелл, сливают надосадочную жидкость и ресуспензируют осадок стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0). Предложенный способ позволяет получать инактивированную культуру Salmonella typhimurium, которая при введении подкожно мышам не вызывает их гибели.

Способ инактивации Salmonella typhimurium при изготовлении вакцин, характеризующийся выращиванием культуры Salmonella typhimurium с последующей отмывкой стерильным 0,9%-ным раствором NaCl (pH 7,0), далее обрабатывают 10%-ным водным раствором аммиака до конечной концентрации 1% и инкубируют смесь в течение 5 ч, затем проводят центрифугирование суспензии сальмонелл, сливают надосадочную жидкость и ресуспензируют осадок стерильным 0,9%-ным раствором NaCl (pH 7,0).