БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА I И II ТИПА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК A61K35/28 A61K35/48 A61P3/10 

Изобретение касается получения культур генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток, фетальных миобластов и способа лечения сахарного диабета I и II типов.

Сахарный диабет распространен во всех странах мира и по данным ВОЗ в мире насчитывается более 150 млн. больных диабетом. В промышленно развитых странах Америки и Европы распространенность сахарного диабета составляет 5-6% и имеет тенденцию к дальнейшему повышению, особенно в возрастных группах старше 40 лет.

Сахарный диабет - клинический синдром хронической гипергликемии (повышение уровня глюкозы в крови) и глюкозурии (появление глюкозы в моче), обусловленный абсолютной или относительной инсулиновой недостаточностью, приводящий к нарушению обмена веществ, поражению сосудов (различные ангиопатии), нейропатии и патологическим изменениям в различных органах и тканях. Исходя из современной классификации, различают: инсулинзависимый диабет (диабет I типа); инсулиннезависимый диабет (диабет II типа); сахарный диабет, связанный с недостаточностью питания; вторичный или симптоматический сахарный диабет; диабет беременных.

Лечение диабета является не менее сложной задачей, чем терапия других эндокринных заболеваний или нарушений обмена веществ. Выбор тактики лечения зависит от типа диабета, клинического течения, стадии развития болезни и др. Благодаря правильной терапии диабета не только продлевается жизнь, но и задерживаются или предупреждаются развитие осложнений этого заболевания, к которым относятся нейропатия, нефропатия и ретинопатия.

Среди методов лечения сахарного диабета на сегодняшний день используются:

Инсулинотерапия.

Общая иммуносупрессия. С этой целью применяются глюкокортикоиды, антилимфоцитарный глобулин, азатиоприн, циклоспорин А, современный цитостатик-FK-506 и облучение поджелудочной железы. По мнению большинства исследователей, это направление в лечении сахарного диабета не имеет перспективы, т.к. перечисленные препараты воздействуют лишь на конечную фазу иммунного ответа, а не на первичные патогенетические механизмы, приводящие к повреждению b-клеток поджелудочной железы.

Лечение пероральными сахароснижающими препаратами

Трасплантация b-клеток островков поджелудочной железы. Более или менее удовлетворительные результаты получены при трансплантации этих клеток в печень, при введении суспензии культуры b-клеток в воротную (портальную) вену. Подобная процедура позволяет значительно снизить (на 30%) дозу экзогенного инсулина. Однако положительный эффект от трансплантации b-клеток кратковременен (3-4 мес.) и требует иммуносупрессии [Соколов Е.И., 2001].

В настоящее время внимание многих исследователей обращает возможность применения заместительной клеточной терапии при сахарном диабете. В работах описано использование мезенхимальных стволовых клеток и миобластов для терапии сахарного диабета [Serup P., et al, 2001].

Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев - может являться критической для ряда пациентов;

клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей, обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.

В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ:

фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;

пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез;

фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию;

культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.

Задачами настоящего изобретения являются получение клеточного биотрансплантата для патогенетического метода лечения сахарного диабета I и II типов, эффективность которого подтверждается достоверным снижением уровня гликемии, уменьшением или исчезновением глюкозурии, уменьшением уровня гликозилированного гемоглобина, нормализацией уровня С-пептида, улучшением общего состояния больного.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения сахарного диабета I и II типов, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, или из собственных тканей рецепиента, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировую ткань.

Для получения аутологичных МСК используют ткани: костный мозг, жировую ткань.

Биотрансплантат предназначен для внутривенного введения. Способ лечения сахарного диабета I и II типов, заключающийся в том, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат, включающий от 50 до 500 млн. мезенхимальных стволовых клеток.

Предложен биотрансплантат для лечения сахарного диабета I и II типов, содержащий культуру фетальных миобластов, полученную из скелетных фетусов человека 1-2 триместра беременности, и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).

Биотрансплантат предназначен для внутримышечного введения.

Предложен также способ лечения сахарного диабета I и II типов, заключающийся в том, что пациенту внутримышечно вводят биотрансплантат, включающий фетальные миобласты из расчета 100 млн. клеток на 10 кг веса тела пациента.

Возможность использования метода заместительной клеточной терапии при сахарном диабете обусловлена способностью мезенхимальных стволовых клеток накапливаться в протоках и островках железы и стимулировать пролиферацию и регенерацию собственных β-клеток. Однако наиболее важным является возможность МСК непосредственно трансдифференцироваться в β-клетки островков поджелудочной железы. Иммуномодулирующее действие МСК особое значение имеет при лечении сахарного диабета I типа, исходя из патогенеза заболевания.

Мезенхимальные стволовые клетки в основном получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых является стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и таким образом терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Мезенхимальные стволовые клетки выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей. Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы. Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного материала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток;

режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур;

режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Учитывая важность в лечении сахарного диабета - преодоление механизмов инсулинорезистентности, нами предложено использование миобластов, способных восполнить необходимое количество периферических инсулиновых рецепторов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Культура получена из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности и содержит не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1) и не более 20% примесных клеток (фибробластов и эндотелиальных клеток).

Способ получения культуры скелетных миобластов характеризуется тем, что мышечную ткань фетусов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течение 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,25% раствор трипсина. Суспензию первичных диссоциированных клеток засевают с плотностью не менее 1×10 клеток/мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит, НПП «ПанЭко») и фактора роста эпидермиса EGF (5-10 нг/мл).

Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 5×10³ кл/мл.

Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% углекислого газа.

Трансплантация осуществляется в условиях терапевтического или любого профильного отделения в присутствии врача-терапевта. Перед началом трансплантации осуществляется биологическая проба. Раствор мезенхимальных стволовых клеток подключают к пациенту, струйно переливается 0,5 мл, после чего систему перекрывают. У реципиента выясняют жалобы на состояние, болевые ощущения, измеряют артериальное давление и подсчитывают пульс. Признаками биологической несовместимости являются: появление болей в поясничной, эпигастральной областях, головных, загрудинных болей, чувства страха, наличие пота и отечности лица, снижение артериального давления, учащение пульса. Пробу повторяют три раза. При отрицательном результате приступают к трансплантации.

Культура мезенхимальных стволовых клеток разводится в 50 мл физиологического раствора, тщательно перемешивается, вводится внутривенно капельно со скоростью 10 мл/мин.

Культура фетальных миобластов вводится из расчета 100 млн. клеток на 10 кг; суммарный объем трансплантируемого материала распределяется на 6 шприцев, производится 6 внутримышечных инъекций в ягодичные, дельтовидные и четырехглавые мышцы бедра.

В течение 24 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение в терапевтическом отделении.

Продолжительность клинического исследования составляла 4 месяца: 1 месяц - скрининг, 3 месяца - период наблюдения.

I группа (9 человек)- больные сахарным диабетом II типа, которым проводится трансплантация МСК и миобластов. В группу включаются пациенты среднего возраста 45-65 лет, компенсированные по сопутствующим заболеваниям (см. противопоказания), с впервые установленным диагнозом и не получавшие лечения сахароснижающими препаратами.

II группа (9 человек)- больные сахарным диабетом II типа, которым проводится лечение традиционными методами (любые пероральные сахароснижающие препараты). В группу включают пациентов среднего возраста 45-65 лет, компенсированных по сопутствующим заболеваниям (см. противопоказания).

В каждой группе выделяются подгруппы (по 3 человека): пациенты с нормальным весом (ИМТ - 24-26), с избыточным весом (ИМТ - 27-30), с ожирением (ИМТ>30).

Критерии исключения:

Острые инфекционные и неинфекционные заболевания.

Больные с некомпенсированными хроническими заболеваниями других органов и систем.

Больные с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, т.ч. в анамнезе.

Больные с поливалентной аллергией.

Беременные и женщины в период лактации.

Больные, которым в силу каких-либо причин не удастся провести динамическое обследование.

В случае возникновения показаний к радикальному изменению консервативной терапии и к проведению оперативных вмешательств пациенты исключаются из исследования.

Больные наблюдались амбулаторно, частота визитов 1 раз в 2 недели. В исследование включались больные сахарным диабетом II типа в возрасте 45-67 лет, принимающие пероральные сахароснижающие препараты (диабетон, глюренорм) в терапевтической дозе от 1 до 3 таблеток в сутки.

Всего в исследование было включено 9 больных сахарным диабетом II типа (4 женщин и 5 мужчин), у 3 пациентов сахарный диабет был обнаружен впервые. Продолжительность болезни у остальных была от 1 года до 15 лет и в среднем составила 5,6+/-0,99 лет. Предшествующая терапия сахарного диабета проводилась препаратами гликлазид, гликвидон в дозе 1-3 таблетки.

Всем пациентам измеряли рост, массу тела и рассчитывали ИМТ. Фиксировался уровень АД, частота пульса сидя после 5 минут отдыха, определение концентраций гликированного гемоглобина (HbAl), общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой и низкой плотности, триглицеридов и расчет индекса атерогенности проводились в начале исследования и при его завершении. Кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с применением методов вариационной статистики. Достоверность различий количественных показателей определяли по парному критерию Стьюдента.

Исходный уровень гликемии натощак среди всех пациентов в среднем составил 8,2±0,5 ммоль/л, концентрация HbAl - 9,95+0,6%. Эти данные свидетельствовали о недостаточной компенсации заболевания. После проведения трансплантации по предложенному способу лечения, обучения больных (в школе больного сахарным диабетом или в виде индивидуальных занятий) уровень гликемии через 1 неделю снизился в среднем на 1,2 ммоль/л (р<0,01). При повторных визитах через 1, 2 и 3 месяца концентрация глюкозы натощак продолжала снижаться и была равна соответственно -6,7±0,2, 6,3+0,2 и 6,1 ±0,2 ммоль/л. Наиболее значимым методом для оценки компенсации сахарного диабета является определение концентрации гликированного гемоглобина. Нормальное значение для фракции А1 гликированного гемоглобина составляет 6-8%. Повторный анализ через 3 месяца показал достоверно (р<0,01) более низкий уровень HbAl- 8,23±0,3%

Наилучших результатов достигли пациенты (n=4, средний возраст 50,0+3,0 лет) с впервые выявленным сахарным диабетом: за 3 месяца гликемия снизилась с 10,8±1,2 до 5,4±0,5 ммоль/л (р<0,05), концентрация гликированного гемоглобина также существенно уменьшилась (14,4±1,5; 8,03+0,31;р<0,05).

Значительное улучшение компенсации сахарного диабета привело к уменьшению концентрации общего холестерина, холестерина липопротеидов низкой плотности.

Таким образом, на третьи-пятые сутки отмечается улучшение состояния пациента, которое заключается в субъективном улучшении (повышение фона настроения, повышении толерантности к физической нагрузке), снижении уровня гликемии, глюкозурии, уменьшении уровня гликозилированного гемоглобина.

Через 1,5 месяца у больных наблюдалась новая фаза улучшения состояния в виде нормализации уровня гликемии, исчезновении глюкозурии, нормализации уровня С-пептида, уменьшении проявлений нефропатии и других осложнений. Улучшение состояния больных позволяет уменьшить дозы противодиабетических препаратов.

Изобретение относится к медицине и биофармакологии и касается биотрансплантата для лечения сахарного диабета I и II типов, в качестве активного компонента содержит культуру генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученных из фетального, донорского или аутологичного материала, и культуру генетически немодифицированных фетальных миобластов. Способ лечения сахарного диабета I и II типов заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора. Культура фетальных миобластов вводится из расчета 100 млн. клеток на 10 кг. Введение фетальных миобластов осуществляется внутримышечно. Изобретение обеспечивает быстрое восстановление нарушенной инкреторной функции поджелудочной железы и снижение инсулинорезистентности, что проявляется в виде нормализации уровня гликемии, исчезновении глюкозурии, нормализации уровня гликозилированного гемоглобина, С-пептида, уменьшении проявлений нефропатии и других осложнений. Улучшение состояния больных позволяет уменьшить дозы противодиабетических препаратов. 4 н. и 5 з.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения сахарного диабета I и II типов, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.2. Биотрансплантат по п.1, в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.3. Биотрансплантат по п.1, в качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.4. Биотрансплантат по п.1, в качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.5. Биотрансплантат по п.1 предназначен для внутривенного введения.6. Биотрансплантат для лечения сахарного диабета I и II типов, характеризующийся тем, что в качестве активного компонента содержит культуру фетальных миобластов, полученную из скелетных фетусов человека 1-2 триместра беременности с последующим культивированием на среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 20%-ой эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит, НПП "ПанЭко"), фактора роста эпидермиса EGF (5-10 нг\мл), и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).7. Биотрансплантат по п.6 предназначен для внутримышечного введения.8. Способ лечения сахарного диабета I и II типов, характеризующийся тем, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат по п.1, включающий от 50 до 500 млн. мезенхимальных стволовых клеток.9. Способ лечения сахарного диабета I и II типов, характеризующийся тем, что пациенту внутримышечно вводят биотрансплантат по п.6, включающий фетальные миобласты из расчета 100 млн. клеток на 10 кг веса.