БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА Российский патент 2005 года по МПК A61K35/32 A61K35/48 A61P1/02 

Изобретение касается приготовления культуры генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток и способа лечения заболеваний пародонта.

Заболевания пародонта продолжают оставаться одной из самых актуальных проблем стоматологии. По данным разных авторов, к 25-30 годам до 50% населения имеют ту или иную форму поражения тканей пародонта. Одной из наиболее распространенных форм является пародонтит, который начинается с инициального поражения краевой части десны, с последующим вовлечением в патологический процесс всех структур пародонта. Хронический пародонтит характеризуется прогрессирующим течением с резорбцией костной ткани альвеолярного отростка, гибелью удерживающего аппарата зуба и выпадением (удалением) последнего. Существующие методы местной противовоспалительной терапии не всегда эффективны и не способствуют восстановлению костной ткани альвеолярных отростков. Следовательно, необходим поиск новых средств для лечения хронического пародонтита, направленных на активную репарацию воспалительно-деструктивных повреждений.

Современные методы лечения пародонтита заключаются не только в устранении периодонтальной инфекции, но и в проведении репаративного остеосинтеза с использованием разнообразных остеопластических материалов. Эти методы достаточно широко используются на современном пародонтологическом приеме, для того чтобы добиться эффективной регенерации тканей пародонта, так как существует возможность восстановление цемента корня зуба, пародонтальной связки и альвеолярной кости. К сожалению, добиться полной регенерации тканей пародонта до настоящего времени еще не представлялось возможным.

В последнее время в стоматологической практике, наряду с такими остеопластическими препаратами как гидроксиапатит и коллаген, получает широкое распространение использование клеток-предшественников остеоцитов - мезенхимальных стволовых и хондропрогенеторных клеток в качестве заместительной клеточной терапии, для стимуляции направленной регенерации переодонтальных тканей.

Лечение различных форм пародонтоза включает в себя консервативные и хирургические методы терапии. Консервативное лечение пародонтоза предусматривает ликвидацию местных патогенных факторов, удаление зубного камня, зубов с подвижностью III-IV степени, замену некачественного наложения пломб, коронок, мостовидных протезов. Для лечения воспаленных тканей десен используются средства, направленные на подавление смешанной патогенной микрофлоры десневых карманов. Значительное место в комплексной терапии пародонтоза отводится хирургическому лечению: кюретажу, гингивотимнии, гингивоэктомии и др. Из существующих в настоящее время методов лечения пародонтита хирургический тактика считается самой эффективной, так как радикально решает проблему, связанную с деструктивными изменениями костной ткани. Такие изменения - результат резорбции из кости солей кальция и следствие воспалительного процесса в пародонтальных карманах. В итоге дефекты костной ткани заполняются патологическими тканями - грануляциями, наличие которых, в свою очередь, приводит к еще более быстрому рассасыванию кости. Ситуация усугубляется тем, что при неблагоприятных условиях грануляции способны перерождаться в пародонтальные кисты. Во время хирургической операции нездоровая ткань удаляется, а костные дефекты заполняются различными остеопластическими материалами. Эти вещества стимулируют костеобразование, значительно улучшают восстановительные процессы в поврежденных тканях, способствуют быстрому заживлению и восстановлению костной структуры, а также обладают противовоспалительным действием.

В настоящие время для регенерации костной ткани широко используются различные биологические и синтетические материалы, в том числе с применением ауто- и аллогенных фибробластов, клеточных элементов костного мозга и др., с целью направленной остеорегенерации (Ashton et al., 1980. Aston et al., 1986. Brittberg et al., 1994). Как показано рядом авторов, используемые биологические и синтетические материалы не вызывают достаточной стимуляции репаративных процессов для восстановления структуры и функции костной ткани пародонта (Coletty et al., 1972. Furukawa et al., 1980).

Известные способы получения хондропрогениторных клеток человека из фетальной хрящевой ткани, полученной на разных сроках гестации, включают в себя последовательную механическую и ферментативную дезагрегацию исходной хрящевой ткани с использованием различных ферментных растворов и их комбинации (коллагеназа, проназа, гиалуронидаза, деоксирибонуклеаза и др.) в различных концентрациях. В зависимости от способов дезагрегации можно получать различное количество клеток с необходимым фенотипом и различное количество жизнеспособных клеток от 50 до 80%. Для культивирования хондропрогениторных клеток используются как не покрытые носителями чашки Петри, культуральные флаконы, так и на различных неселективных подложках из коллагена, агарозы и др. (Brittberg et al., 1994. Fuchs et al., 2002). Перечисленные способы культивирования клеток в монослое не позволяют осуществлять более 2-3 пассажей без потери фенотипа хондропрогениторных клеток, которые дедифференцируются в фибробластоподобные клетки. Известны способы культивирование хондропрогениторных клеток в суспензии с использованием различных трехмерных носителей (альгинат, полигликолид, полилактат, ателоколлаген), что позволяет вести культуру более длительное время без потери фенотипа клеток (Kimura et al., 1984. Matsusaki et al., 1998).

Хондропрогениторные клетки, получаемые из фетальной хрящевой ткани путем последовательной дезагрегации и культивирования в селективных средах при трансплантации с высокой эффективностью, пролиферируют, мигрируют, встраиваются в очаг повреждения, дифференцируются в остеоциты, в зависимости от микроокружения, синтезируют внеклеточный матрикс, стимулируют ангиогенез (Патент RU 2160112, 12.10.2000).

Регенерация костной ткани при повреждении и системной резорбции происходит за счет мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые являются предшественниками остеобластов и способствуют формированию ремоделирующих единиц. В настоящее время использование МСК для системной и местной регенерации костной ткани находит все большее применение. Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми (S.J.Forbes et al., 2002). Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Задачей настоящего изобретения является получение гомогенных культуры мезенхимальных стволовых и хондропрогенеторных клеток для имплантации с целью направленной остеорегенерации при заболеваниях пародонта с целью повышения эффективности лечения.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Предложен биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта, представляющий собой суспензию хондропрогениторных клеток человека, включающую культуру генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека, содержащую аггрекон и коллаген II экспрессирующих клеток не менее 80%, полученную из гиалиновой хрящевой ткани эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности и селективно размноженную в условиях культивирования.

Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру.

Биотрансплантат может содержать клеточную культуру криоконсервированную, с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксид.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта, заключающийся в том, что хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, измельчают и ферментативно дезагрегируют в течение 40-90 минут, полученную суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×10⁶ кл/мл и культивируют на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В и факторы роста, при достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина, при этом плотность посева не менее 10×10⁵ кл/мл, а культивирование ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Дезагрегацию ткани проводят путем инкубирования ее ферментом в растворе, содержащем 0,01-0,15% раствор коллагеназы и 0,05-0,1% раствор проназы Е в соотношении 1:1.

Пассируют культуру не более 2-х раз.

Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток культивируют на непокрытых носителями чашках Петри.

Предложен также биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, или донорского материала, или из собственных тканей рецепиента, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

Для получения аутологичных МСК используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта, заключающийся в том, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂, по достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина, и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.

Предложен способ лечения заболеваний пародонта, заключающийся в том, что используют суспензию мезенхимальных стволовых или хондропрогениторных клеток или их комбинацию в соотношении 1:1, содержащей 1-50 млн кл/мл, вводят итралигаментарно с латеральной и медиальной сторон каждого зуба и поднадкостнично в пародонтальные участки верхней и нижней челюстей.

Один из объектов - культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека. Культура получена из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2 триместра беременности и содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80% и не более 20% примесных клеток. Второй объект - способ получения хондропрогениторных клеток. Хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течении 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,05-0,1% раствор проназы Е. Суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×10⁶ кл/мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением ростовых добавок и факторов роста.

Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 1×10⁶ кл/мл.

Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Пассируют культуру не более двух раз.

Способ осуществляется следующим образом.

Для приготовления биотрансплантата используется фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов хрящевая ткань тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяются все мягкие ткани (кожа, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костная ткань. Полученную хрящевую ткань измельчают до кусочков не менее 1 мм³. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.

Способ дезагрегации заключается в использовании 0,1% раствора коллагеназы II типа (Sigma), 0,05% раствора проназы Е (Sigma), в одномоментном инкубировании кусочков хрящевой ткани в течении 40-90 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе, последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 оборотов в минуту. Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток, полученных из фетальной хрящевой ткани, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12 (1:1, Gibco BRL), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит. НПП ПанЭко), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (Sigma) и/или 0,1-10 нг/мл TGFβ₁ (Sigma). Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует пассирование с использованием 0,05% раствора трипсина для дезагрегации монослоя, той же культуральной среды, при плотности посева не менее 10×10⁵ кл/мл. Возможно проведение не более двух пассажей вследствие дедифференцировки и изменении фенотипа (снижение количества аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток) получаемых клеток.

Для приготовления биотрансплантата используются культуры мезенхимальная стволовых клеток. МСК с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань), донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) или аутологичных (косный мозг, жировая ткань) тканей. Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов.

Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%.

Система отбора источников получения МСК позволяет получить культуры клеток с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервировации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.

Предложенный способ лечения заключается в проведении трансплантации. В качестве биотрансплантата используются различные объемы суспензий клеток, содержащие 1-50 млн. ХПК в 1 мл, 1-50 млн. МСК в 1 мл, возможно использование комбинации биотрансплантатов, содержащих ХПК и МСК в соотношении 1:1.

Непосредственно перед началом трансплантации осуществляется биологическая проба. Раствор, содержащий в 1 мл 1-50 млн. хондропрогениторных или мезенхимальных стволовых клеток, вводится в количестве 0,1 мл в мягкие ткани десны. У реципиента выясняют жалобы на состояние, болевые ощущения, измеряют артериальное давление и подсчитывают пульс. Признаками биологической несовместимости являются: появление болей - в поясничной, эпигастральной областях, головных, загрудинных болей, чувства страха, наличие пота и отечности лица, снижение артериального давления, учащение пульса. Пробу повторяют три раза. При отрицательном результате приступают к трансплантации.

Осуществляется премедикация седатитвными препаратами по стандартной схеме. С помощью инсулинового шприца несколькими инъекциями суспензию клеток вводят интралигаментарно с латеральной и медиальной сторон каждого зуба верхней и нижней челюсти. Поднадкостнично, в пародонтальные участки верхней и нижних челюстей осуществляется несколько инъекций суспензии клеток, содержащей 1-50 млн. ХПК, МСК или их комбинации.

В течение 2-4 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение терапевта.

Эффективность предложенного способа заключается в увеличении плотности костной ткани, направленной остеорегенерации альвеолярных отростков верхней и нижней челюстей.

В группу наблюдения вошли 18 пациентов, обратившихся в клинику с жалобами на подвижность зубов, кровоточивость десен, неприятный запах изо рта, невозможность полноценно пережевывать пищу. При клиническом и рентгенологическом исследовании всем поставлен диагноз пародонтит тяжелой формы, сопровождающийся атрофией более 1/2 альвеолярного отростка и подвижностью зубов 2-3 степени. Все больные обследованы следующим образом: общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, иммунологический статус, гормональный статус (Т3, Т4, ТТГ, АТ-ТГ, АТ-ТПО, ФСГ, ЛГ, эстроген, прогестерон, пролактин, тестостерон, инсулин, IGF-I,II), вирусологическое исследование, ПЦР крови и соскоба слизистой полости рта (CMV, Ch.spp, Myc.spp, HPV 16/18, Tox.spp, Herpes 1,2), исследование на наличие ряда распространенных онкомаркеров (ХГТ, СА-125, СА-15.3, СА-19.9, PSA, AFP, СЕА). Всем пациентам проведено УЗИ органов брюшной полости, малого таза, щитовидной железы, рентгенологическое исследование органов грудной клетки с целью исключения острых патологий, онкологических заболеваний, способных осложнить предстоящее вмешательство. Произведена коррекция терапии ряда хронических заболеваний сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, мочевыводящей системы.

У большинства пациентов при помощи ПЦР в слизистой полости рта обнаружены Bacteriodes spp., у многих определялись CMV, Mic.spp., EBV, Chl.spp. Производилось соответствующее лечение препаратами, подобранными в соответствии с тропностью к типированному при помощи RT-PCR возбудителю.

Таким образом, на момент осуществления имплантации стволовых клеток у пациентов отсутствовали онкологические заболевания, аллергические заболевания и реакции, другие хронические заболевания в стадии декомпенсации/обострения, острые воспалительные процессы, исключались наркомании, острые отравления.

После местного традиционного лечения пародонтита пациентам имплантировались хондропрогениторные клетки поднадкостнично в пародонтальные участки альвеолярных отростков верхней и нижней челюстей.

Пациент И., 52 года, обратился в клинику с жалобами на подвижность зубов (по данным осмотра - 2-3 степень), кровоточивость десен, неприятный запах изо рта, невозможность полноценно пережевывать пищу.

На основании клинико-рентгенологического обследования поставлен диагноз: пародонтит тяжелой формы с атрофией более 1 альвеолярного отростка, подвижностью зубов 2-3 степени. Сопутствующие соматические заболевания: язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, состояние после холецистэктомии, гипертоническая болезнь начальной склеротической стадии.

При клинико-лабораторном обследовании выявлено: лейкоцитоз, гиперхолестеринемия, повышенные фракции триглицеридов, нарушения липидного обмена, нарушение толерантности к глюкозе, гипергликемия. Иммунологический статус - повышение уровня активированных Т-лимфоцитов. Гормональный статус в пределах возрастной нормы.

Пациенту проведено: профессиональная гигиена полости рта; зубы верхней и нижней челюсти шинированы по блокам "Glaspen", избирательно проведен глубокий кюретаж патологических карманов. Произведена художественная реставрация зубов обеих челюстей.

После проведения вышеуказанной терапии на основании добровольного информированного согласия пациента (законодательная база - ст.43 ФЗ "Основы законодательства об охране здоровья граждан РФ") проведена заместительная клеточная терапия - после премедикации поднадкостнично введена культура хондропрогениторных клеток человека для использования в заместительной клеточной терапии (паспорт серия АСН №15-2-150, заключение о соответствии условий изготовления GMP: ГипроНИИМедПром, ЦГСЭН ЮАО г.Москвы 55/3.10 от 13 мая 2002 г.).

На следующие сутки после имплантации препарата стволовых клеток пациент отметил исчезновение болей и кровоточивости десен. При локальном осмотре слизистая полости рта бледно-розового цвета, умеренно увлажнена, плотно прилежит к зубам. Общее состояние удовлетворительное. На пятые сутки данных, указывающих на патологические изменения, нет.

Пациент отмечает: повышение работоспособности, повышение активности, уменьшение времени сна, повышение потенции и либидо.

Контрольное клинико-лабораторное обследование через 15 сутки: отсутствие лейкоцитоза, нормализация показателей липидного обмена, уменьшение активности Т-лимфоцитов. Общее состояние пациента удовлетворительное, жалоб на челюстно-лицевую область не предъявляет. При локальном осмотре - отмечается положительная динамика, слизистая бледно-розового цвета, плотно прилежит к зубам, кровоточивости десен при зондировании нет. Через шесть месяцев общее состояние пациента удовлетворительное. Клиническая картина локально - без изменений. На ортопантомограмме определяется увеличение оптической плотности кости альвеолярных отростков (по сравнению со снимками до имплантации у всех пациентов в среднем на 49±3%, р=0,05), достоверное увеличение высоты их по осям биомеханической нагрузки.

Таким образом, исследование показало, что имплантация ХПК приводит к осуществлению направленной физиологической регенерации костной ткани альвеолярных отростков во взрослом организме при наличии деструктивно-воспалительных заболеваний тканей пародонта и может являться эффективным способом терапии пародонтита.

Изобретение относится к биофармакологии и медицине и касается приготовления культуры генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток и способа лечения заболеваний пародонта. Биотрансплантаты, способы их получения и способ лечения заболеваний пародонта, заключающийся в введении суспензии мезенхимальных стволовых и хондропрогениторных клеток или их комбинации, содержащей 1-50 млн. кл/мл, интралигаментарно с латеральной и медиальной сторон каждого зуба и поднадкостнично, в пародонтальные участки верхней и нижних челюстей. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения. 5 н. и 13 з.п.ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию хондропрогениторных клеток человека, включающую культуру генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека, содержащую аггрекан и коллаген II экспрессирующих клеток не менее 80%, полученную из гиалиновой хрящевой ткани эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности и селективно размноженную в условиях культивирования.2. Биотрансплантат по п.1, содержит свежеприготовленную культуру.3. Биотрансплантат по п.1, содержит клеточную культуру криоконсервированную, с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида.4. Способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта, характеризующийся тем, что хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, измельчают и ферментативно дезагрегируют в течение 40-90 мин, полученную суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1·10⁶ кл/мл и культивируют на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В и факторы роста, при достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина, при этом плотность посева не менее 10·10⁵ кл/мл, а культивирование ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% CO₂.5. Способ по п.4, где дезагрегацию ткани проводят путем инкубирования ее ферментом в растворе, содержащем 0,01-0,15%-ный раствор коллагеназы и 0,05-0,1%-ный раствор проназы Е в соотношении 1:1.6. Способ по п.4, где пассируют культуру не более 2 раз.7. Способ по п.4, суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток культивируют на непокрытых носителями чашках Петри.8. Биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.9. Биотрансплантат по п.8, в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.10. Биотрансплантат по п.8, в качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.11. Биотрансплантат по п.9, в качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.12. Способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта, характеризующийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материалов, ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂, по достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 г мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.18. Способ лечения заболеваний пародонта, характеризующийся тем, что используют биотрансплантат по п.1 и/или п.4, где суспензию мезенхимальных стволовых или хондропрогениторных клеток или их комбинацию в соотношении 1:1, содержащей 1-50 млн. кл/мл, вводят интралигаментарно с латеральной и медиальной сторон каждого зуба и поднадкостнично в пародонтальные участки верхней и нижней челюстей.