БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛЕГОЧНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/28 A61K35/48 C12N5/08 A61P9/12 

Изобретение касается получения культуры генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток и метода лечения легочной гипертензии (ЛГ).

Легочная гипертензия - это патологический синдром, вызванный увеличением среднего АД в легочной артерии более 20 мм рт.ст. в покое и более 30 мм рт.ст. при нагрузке. Легочная гипертензия по частоте занимает третье место среди сердечно-сосудистой патологии у лиц старше 50 лет (после ИБС и артериальной гипертензии).

Легочная гипертензия может быть как приобретенной (вторичной), так и врожденной (первичной).

Причинами повышения давления в легочной артерии могут быть заболевания сердца (врожденные и приобретенные пороки, сердечная недостаточность), хронические заболевания легких (ХОБЛ, бронхиальная астма, интерстициальный фиброз легких, саркоидоз, асбестоз, силикоз, туберкулез), васкулиты, пребывание в высокогорной местности, ТЭЛА, воздействие ЛС.

Когда причину легочной гипертензии выявить не удается, говорят о первичной легочной гипертензии.

При клапанных пороках возникает пассивная легочная гипертензия в результате передачи давления из левого предсердия на легочные вены, а затем на систему легочной артерии. При стенозе митрального отверстия в ряде случаев возникает рефлекторный спазм артериол легких из-за повышения давления в устьях легочных вен и в левом предсердии (рефлекс Эйлера-Лилиестрандта). При длительно существующей легочной гипертензии формируются необратимые органические склеротические изменения атериол с их облитерацией.

При врожденных пороках сердца легочная гипертензия возникает в результате увеличения кровотока в системе легочной артерии и увеличения сопротивления кровотоку в легочных сосудах. При ИБС, дилятационной кардиомиопатии, гипертонической болезни возникающая левожелудочковая недостаточность также приводит к легочной гипертензии в результате повышения давления в левом предсердии и легочных венах.

При хронических заболеваниях органов дыхания легочная гипертензия длительное время носит компенсаторный характер, так как гипоксическая легочная вазоконстрикция (рефлекс Эйлера-Лилиестрандта) выключает из перфузии невентилируемые участки легких, чем устраняет шунтирование в них крови, уменьшает гипоксемию. При прогрессировании заболевания легких легочная гипертензия в условиях гипоксемии (гипоксии миокарда) становится фактором патогенеза формирования хронического легочного сердца.

Лечение ЛГ должно быть этиотропным и комплексным. В первую очередь необходима коррекция основного заболевания, приведшего к развитию ЛГ. Так, при ХОЗЛ применяют антибиотики, бронходилататоры (сальбутамол, фенотерол, ипратропиум и др.), иногда глюкокортикостероиды. При митральных пороках необходима вальвулопластика или протезирование клапана. У больных с врожденными пороками сердца с увеличенным легочным кровотоком, особенно при дефекте межжелудочковой перегородки (мембранозной части), открытом артериальном протоке для предотвращения развития необратимых изменений в сосудах легких должна проводиться хирургическая коррекция в раннем возрасте (до года). При хронической ТЭЛА необходима ликвидация источника тромбов, своевременная операция по установке кава-фильтра.

Медикаментозное лечение ЛГ, в т.ч. первичной, направлено на основные патофизиологические механизмы ее формирования - вазоконстрикцию, пролиферацию интимы и нарушение свертывания крови.

В настоящее время из всех вазодилататоров наиболее эффективными и обоснованными считаются антагонисты кальция.

Мощным вазодилатирующим действием обладают простагландины (E₁ и простациклин).

В клинической практике применяются также аналоги простациклина - эпопростенол и илопростенол. Первый назначается внутривенно, второй - ингаляционно в виде аэрозоля. Опыт лечения ЛГ этими препаратами невелик, стоимость очень высока.

В комплексной терапии ЛГ широко применяют антикоагулянты и антиагреганты.

Альтернативой непрямым антикоагулянтам являются низкомолекулярные гепарины (фраксипарин, клексан, фрагмин).

Известно, что основным сосудорасширяющим веществом в организме является вырабатываемый эндотелием оксид азота (NO). В настоящее время ведутся активные исследования возможности ингаляционного применения NO для лечения ЛГ. Препарат используют при остром респираторном дистресс-синдроме, эмболии ЛА, первичной и вторичной ЛГ.

Ингаляции NO используют как для оценки реактивности сосудов легких в острой пробе, так и для длительного лечения ЛГ. Значительный опыт пока не накоплен. Рассматривается возможность амбулаторного применения ингаляций NO.

Делаются попытки применения для лечения ЛГ антагонистов рецепторов эндотелина (босентан, ситаксентан), т.к. известно, что эндотелин вызывает легочную и системную вазоконстрикцию с развитием ЛГ и гипертрофии правого желудочка сердца. Об их положительном действии при ЛГ имеются единичные сообщения.

При выраженных признаках сердечной недостаточности кроме вазодилататоров используют диуретики. Эффективность сердечных гликозидов при лечении ЛГ не доказана.

Хирургическое лечение при симптоматической ЛГ показано у больных с приобретенными пороками сердца. Для профилактики развития необратимых изменений в сосудах легких при врожденных пороках (дефект межжелудочковой перегородки и открытый артериальный проток) коррекция должна быть проведена в первый год жизни. При постэмболической ЛГ проводят эмболэктомию и эндартерэктомию, которые позволяют увеличить выживаемость и улучшить качество жизни больных. В случае неэффективности медикаментозного лечения у больных с высокой ЛГ и необратимыми изменениями в легких (ПЛГ, врожденные пороки в фазе синдрома Эйзенменгера) проводят трансплантацию комплекса "сердце-легкие" или трансплантацию одного или обоих легких. Эти методы хирургического лечения ЛГ не получили широкого распространения из-за ограниченного числа доноров, а также недостатка хирургических стационаров, где возможны также операции. Не обеспечивается в должной мере последующее наблюдение этих больных. С середины 90-х годов XX столетия изучается возможность проведения у больных ПЛГ предсердной септостомии при помощи эндоваскулярной балонной технологии в тех случаях, когда больные резистентны к терапии вазодилататорами [Коноплева Л.Ф., 2001].

Прогноз при ЛГ зависит от характера и стадии основного заболевания, степени повышения давления в ЛА, обратимости изменений сосудов малого круга. Наиболее тяжелый прогноз для больных с сосудистыми формами ЛГ (ПЛГ, синдром Эйзенменгера). Ухудшение прогноза наблюдается при повышении давления в правом предсердии, снижении сердечного выброса. Пятилетняя смертность больных с хроническими заболеваниями легких при среднем давлении в легочной артерии 25 мм рт.ст. составляет 10-15%, а при 30-45 мм рт.ст. - 60%. При первичной легочной гипертензии пятилетняя выживаемость больных составляет 22-38% [Мухин Н.А. et al., 2003].

Таким образом, отсутствие возможности терапевтической коррекции большинства заболеваний, вызывающих легочную гипертензию, невозможность в ряде случаев проводить хирургическое лечение, дефицит донорских органов, высокая смертность заставляют искать альтернативные способы лечения легочной гипертензии.

Возможность использования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для лечения ЛГ обусловлена, в первую очередь, возможностью МСК трансдифференцироваться в альвеолярный эпителий. Являясь уникальной "фабрикой" цитокинов и факторов роста, донорские МСК обеспечивают активизацию собственных резервов организма. Способность МСК стимулировать неоангиогенез, а также их антифибротическое действие являются основным звеном патогенетического лечения легочной гипертензии.

Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев, может являться критической для ряда пациентов; клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей, обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.

В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ:

фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;

пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез;

фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию;

культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.

Задачами настоящего изобретения являются получение биотрансплантата для комплексного, патогенетического метода лечения легочной гипертензии, содержащего гомогенную, не менее 80%, популяцию плюрипотентных МСК, что позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Предложен биотрансплантат для лечения легочной гипертензии, представляющий собой гомогенную, не менее 80%, популяцию плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученную из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

В качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Биотрансплантат предназначен для внутривенного введения.

Предложен также способ лечения легочной гипертензии, заключающийся в том, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат в количестве от 50 до 500 млн мезенхимальных стволовых клеток в 50-100 мл физиологического раствора со скоростью 10 мл/мин.

МСК выделяют из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей или аутологичного материала (костный мозг, жировая ткань). Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например, тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы. Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного материала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток;

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур;

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте репаративного действия мезенхимальных стволовых клеток.

Трансплантацию осуществляют в условиях терапевтического или любого профильного отделения в присутствии врача-терапевта. Перед началом трансплантации осуществляют биологическая пробу. Раствор мезенхимальных стволовых клеток подключают к пациенту, струйно переливается 0,5 мл, после чего систему перекрывают. У реципиента выясняют жалобы на состояние, болевые ощущения, измеряют артериальное давление и подсчитывают пульс. Признаками биологической несовместимости являются: появление болей - в поясничной, эпигастральной областях, головных, загрудинных болей, чувства страха, наличие пота и отечности лица, снижение артериального давления, учащение пульса. Пробу повторяют три раза. При отрицательном результате приступают к трансплантации.

Культура мезенхимальных стволовых клеток разводится в 50 мл физиологического раствора, тщательно перемешивается, вводится внутривенно капельно со скоростью 10 мл/мин.

В течение 24 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение в терапевтическом отделении.

Изобретение относится к медицине и биофармакологии. Биотрансплантат для лечения легочной гипертензии содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Способ лечения легочной гипертензии заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн в 50-100 мл физиологического раствора. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения без нежелательных эффектов. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения легочной гипертензии, характеризующийся тем, что он представляет собой гомогенную не менее 80% популяцию плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученную из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферрин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.2. Биотрансплантат по п.1, в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.3. Биотрансплантат по п.1, в качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.4. Биотрансплантат по п.1, в качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.5. Биотрансплантат по п.1 предназначен для внутривенного введения.6. Способ лечения легочной гипертензии, характеризующийся тем, что пациенту внутривенно капельно вводят биотрансплантат по п.1 в количестве от 50 до 500 млн. мезенхимальных стволовых клеток в 50-100 мл физиологического раствора со скоростью 10 мл/мин.