БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТИЧЕСКИХ И АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2007 года по МПК A61K35/48 A61P37/00 

Изобретение относится к области медицины и касается приготовления генетически немодифицированной культуры мезенхимальных стволовых клеток человека и способа лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний.

Аутоиммунные заболевания (АИЗ) включают большое количество нозологических форм с различной клинической картиной, но с общими механизмами патогенеза и принципами лечения, основой которых является иммуносупрессивная терапия [Hematology: Basic Principles and Practice. - 3-d Ed. Hoff-man. - New York, 2000.]. Ключевыми событиями в патогенезе АИЗ являются нарушения в иммунной системе, приводящие к развитию поликлонального иммунного ответа на собственные антигены (в этом ответе участвуют В- и Т-лимфоциты, макрофаги). В связи с тем, что все клетки иммунной системы происходят из единой стволовой клетки, существует гипотеза о развитии АИЗ вследствие дефектов стволовых клеток или их ближайших потомков [Шевченко Ю.Л., Бойцов С.А., Вестник РАМН, 2004]. Это предположение подтверждается экспериментальными и клиническими данными.

Как известно, в патогенезе ревматических заболеваний важную роль играют два фактора: воспаление и нарушение иммунитета. Повреждающий агент вызывает острую фазу воспаления, которая включает в себя многочисленные компоненты:

- сосудистый (нарушение микроциркуляции с начальным развитием спазма и последующей вазодилатацией, стазом и повышенной проницаемостью сосудов вследствие повреждения клеточных и субклеточных мембран и межклеточного вещества);

- гематологической (нарушение свертываемости крови, тромбоз, миграция лейкоцитов и очаг повреждения в начальной стадии, агрегация и разрушение тромбоцитов и лейкоцитов, высвобождение и активация медиаторов воспаления: гистамина, серотонина, кининов, простагландинов);

- тканевой (высвобождение цитоплазматических и лизосомальных ферментов и резкое нарушение обменных процессов, которое сопровождается ацидозом, гиперосмией и расплавлением тканей с последующей пролиферацией мезенхимальных клеток, синтезом коллагена и неколлагеновых белков).

В репаративной фазе развиваются процессы в соединительной ткани: клеточная пролиферация, стимуляция образования мукополисахаридов (сначала гиалуроновой кислоты, а затем сульфатированных гликозаминогликанов и, наконец, коллагена с формированием фиброза). Взаимоотношения острой экссудативно-сосудистой фазы воспаления и репаративной фазы регулируются пептидами, влияющими на энергетику метаболизма в соединительной ткани и активность гиалуроновой кислоты.

Одновременно с местным процессом развивается целый ряд генерализованных реакций, обусловленных вовлечением нервной и эндокринной систем: повышение температуры тела, усиленный обмен веществ, лейкоцитоз с появлением незрелых форм клеток, диспротеинемия, активирование системы мононуклеарных фагоцитов, увеличение СОЭ, иммунологические сдвиги. Аутоиммунизация развивается двумя основными путями: 1) как следствие появления запретных клонов иммунокомпетентных клеток, способных вырабатывать антитела к неизмененным антигенам собственного организма, или 2) в результате денатурации собственных белков (антигенов), которые для иммунокомпетентных клеток становятся "чужеродными", однако образующиеся к этим антигенам антитела взаимодействуют и с неизмененными антителами. Иммунологическая специфичность белков организма может изменяться под влиянием физических, химических, бактериальных и других факторов.

В 1995 г. в Сиэтле состоялась 1-я Согласительная конференция по ТКМ при АИЗ, на которой были определены методы получения стволовых кроветворных клеток (СКК) и режимы кондиционирования. В 2002 г. в мире выполнено более 450 миелотрансплантации по поводу различных АИЗ [Saccardi R., Mancardi G., Bacigalupo A. et al. // Bone Marrow Transplant. - 2002. - Vol.29, Suppl. 2. - P.13.; Zhao X., Fu Y., Peng X. // Bone Marrow Transplant. - 2002. - Vol.29, Suppl. 2. - P.15.] К перспективным направлениям относят применение трансплантации стволовых клеток при аутоиммунных гематологических (аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунная тромбоцитопения, аутоиммунная нейтропения), ревматических (системная красная волчанка, системная склеродермия, ревматоидный артрит, системный васкулит) и неврологических (рассеянный склероз, миастения и др.) заболеваниях [Новик А.А. Ц Вести. Рос. воен.-мед. акад. - 2002. - Т.7, №1. - С.98-102.].

Известно, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), взаимодействуя с различными иммунокомпетентными клетками, подавляют или снижают выраженность воспалительной реакции, препятствуя развитию иммунного ответа, и способствуют установлению состояния иммунологической толерантности [Aggarwal S., Pittenger MF. "Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses." Blood. 2005 Feb 15; 105 (4): 1815-22]. МСК нарушают реактивность иммунной системы за счет следующих механизмов:

МСК угнетают функциональную активность и нарушают пролиферацию дендритных клеток I класса, снижая тем самым пролиферацию и дифференцировку Т-хелперов I класса.

МСК, взаимодействуя с незрелыми эффекторными Т-клетками напрямую, подавляют их дифференцировку в реактивные Т-хелперы I класса. Кроме того, действуя непосредственно на зрелые Т-хелперы I класса, МСК выражено снижают их функциональную активность.

МСК стимулируют функциональную активность и, возможно, активируют пролиферацию и дифференцировку дендритных клеток II класса, обладающих иммуносупрессорной активностью и стимулирующих пролиферацию толерогенных Т-хелперов II класса, снижающих пролиферацию и эффекторные функции цитотоксических Т-клеток.

МСК, взаимодействуя с незрелыми эффекторными Т-клетками напрямую, стимулируют их пролиферацию в реактивные Т-хелперы II класса. Кроме того, не исключено, что, действуя непосредственно на зрелые Т-хелперы II класса, МСК повышают их функциональную активность.

За счет того, что МСК нарушают нормальное созревание антигенпрезентующих клеток, возникают аберрантные АПК, оказывающие некоторое стимулирующее действие на пролиферацию клонов супрессорных Т-клеток, которые, в свою очередь, стимулируют пролиферацию Т-хелперов II класса и блокируют пролиферацию Т-хелперов I класса и цитотоксических лимфоцитов.

Взаимодействуя с НК-клетками напрямую, МСК угнетают их пролиферацию, цитотоксическую активность и продукцию провоспалительных цитокинов, например, IFN-gamma.

Стоит отметить, что все эти направления тесно между собой взаимосвязаны. Связь эта, прежде всего, осуществляется за счет выработки иммунокомпетентными клетками различных цитокинов. Таким образом, изменяя активность и секреторной профиль какого-то одного типа иммунокомпетентных клеток, МСК влияют на работу всей иммунной системы. Все это приводит к изменению ее реактивных свойств, выражающемся в снижении выраженности воспалительной реакции или развитии иммунологической толерантности.

Задачами настоящего изобретения являются получение биотрансплантата для комплексного, патогенетического метода лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний, эффективность которого подтверждается достоверным улучшением клинической картины заболевания и изменения иммунологического статуса, характерного для ремиссии.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК) от 50 до 500 млн, полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

В качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Биотрансплантат предназначен для внутривенного введения.

Предложен также способ лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний, заключающийся в том, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат по п.1, включающий от 50 до 500 млн мезенхимальных стволовых клеток.

МСК выделяют из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань), или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей, или аутологичного материала (костный мозг, жировая ткань). Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например, тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500 х g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F 12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37° С в атмосфере 5% CO₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы. Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного материала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте иммунокоррегирующего действия мезенхимальных стволовых клеток.

Трансплантацию осуществляют в условиях терапевтического или любого профильного отделения в присутствии врача-терапевта. Перед началом трансплантации осуществляют биологическая проба. Раствор мезенхимальных стволовых клеток подключают к пациенту, струйно переливают 0,5 мл, после чего систему перекрывают. У реципиента выясняют жалобы на состояние, болевые ощущения, измеряют артериальное давление и подсчитывают пульс. Признаками биологической несовместимости являются: появление болей - в поясничной, эпигастральной областях, головных, загрудинных болей, чувства страха, наличие пота и отечности лица, снижение артериального давления, учащение пульса. Пробу повторяют три раза. При отрицательном результате приступают к трансплантации.

Культура мезенхимальных стволовых клеток в концентрации 50-500 млн разводят в 50-500 мл физиологического раствора или инфукола, тщательно перемешивают, вводится внутривенно капельно со скоростью 10 мл/мин.

В течение 24 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение в терапевтическом отделении.

Нами обследовано и пролечено по предложенному способу 15 пациентов с ревматоидным и псориатическим артритом. Показана эффективность предложенного способа лечения. Всем пациентам была отменена цитостатическая терапия, поддерживающая доза глюкокортикостероидов была сохранена.

Иммунный статус пациентов после применения стволовых клеток по поводу ревматоидного артрита (наблюдение в течение трех месяцев).

Исходно большинство показателей было близко к норме, однако относительное и абсолютное содержание в крови CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов оставалось на нижней границе или несколько ниже нормы (возможно - результат ранее проведенной иммунодепрессивнои терапии).

Характерным результатом (через месяц или даже два месяца применения С.К.) явилось повышение названных показателей или некоторых из них. Иногда уровень показателя возрастал в полтора раза или более. Иначе говоря, наблюдалась нормализация поступления различных типов Т-лимфоцитов в кровообращение.

Вторым важным результатом явилось транзиторное (через месяц) снижение процентного содержания В-лимфоцитов (CD72+) и активированных В-лимфоцитов (CD38+) с восстановлением показателей через 2 месяца (функциональное подавление клонообразования).

Третий результат - транзиторное снижение уровня маркера апоптоза (CD95%), которое также свидетельствует о снижении темпа обновления популяции лимфоидных клеток.

Таким образом, стволовые клетки оказали достаточно длительное иммунорегуляторное воздействие, которое способствовало улучшению состояния при ревматоидном артрите.

Конкретный клинический пример.

Пациентка Б. 1949 г.р.

Больна с 1997 г., когда стали появляться боли в плюснефаланговых суставах стоп, припухлость данных суставов, купировались приемом бутадиона. В VII-1999 г. обследована в пол-ке УдПрРФ. Отмечалась резкая болезненность при пальпации II, III плюснефаланговых суставов обеих стоп, в ан. крови СОЭ - 22 мм/ч., Hb - 130 г/л, L - 7,8, РФ по латекс-тесту 1:160.

На Rg. - кистей - кистевидные просветления в шиловидных отростках обеих локтевых костей.

На Rg. - стоп - резкое сужение суставной щели в III плюснефаланговом суставе левой стопы, кистевидные просветления в головке III плюсневой кости левой стопы.

Был поставлен диагноз: Ревматоидный артрит, серо (+), активность - II, стадия - I, ФН - 1. Больной назначен метотрексат в дозе 5 мг/нед. с (+) динамикой и достижением ремиссии в суставном статусе. В XI-2000 г. метотрексат отменен в связи с повышением трансаминаз, сохранялась ремиссия РА, периодический прием НПВП. С IV-02 признаки активности РА: повышение температуры тела до 38°С, появились боли в плечевых, лучезапястных суставах, ограничение движений в них. В анализе крови: СРБ - 24 мг/л, РФ по латекс-тесту - 192 ме/мл, РФ по Ваале-Роузе - 1:160, ЦИК - 167 ед. оп. пл.

Был назначен азатиоприн в дозе 50 мг/сутки, однако из-за отсутствия клинического эффекта и плохой переносимости (слабость, сонливость, подташнивание) препарат был отменен.

На Rg - кисти от 28/Х - 02 по сравнению с Rg от 3/VI - 99, 23/Х-00 - отрицательная динамика в виде увеличения количества кистевидных просветлении в шиловидных отростках обеих локтевых костей, появления кистевидных просветлении в шиловидных отростках лучевых костей, в костях левого запястья.

На Rg - стоп от 28/Х - 02 нарастание кистевидных просветлении в головках плюсневых костей, подвывих в III плюснефаланговом суставе левой стопы.

На Rg - костей таза от 27/11 - 01 крестцово-подвздошные сочленения не сужены, склерозированы. Тазобедренные суставы не изменены. Эрозии седалищных бугров с обеих сторон.

С XII-02 - генерализованные боли в крупных суставах, артриты пястно-фаланговых суставов кистей, боли и скованность в шейном отделе позвоночника, повышение СОЭ до 62 мм/ч. С I - 03 переведена на прием лейкерана 2 мг/сутки + метипред 4 мг/сутки. На приеме лейкерана - головные боли, боли в эпигастрии, в связи с чем препарат отменен. На однократном введении тауредона - 10 мг в/м - озноб, повышение температуры до 40°С, дерматит кожи рук. С II-03 больная стала получать сульфасалазин в начальной дозе 500 мг/сутки, с увеличением до 1500 мг/сутки, продолжала прием метипреда 4 мг/сутки. К IV-03 температура тела нормализовалась, артриты купировались, сохранялись артралгии мелких суставов стоп, СОЭ снизилось до 47 мм/ч. Несмотря на достигнутую относительную ремиссию в суставном статусе у больной отмечалось низкое качество жизни: не могла выполнять несложную домашнюю работу, беспокоила выраженная скованность в суставах, тугоподвижность в них, сохранялась отечность коленных, голеностопных суставов.

В III-04 больной отменен сульфасалазин с целью подготовки к введению МСК, оставлен метипред в дозе 2 мг/сутки.

Исходные данные до введения МСК.

общий счет болезненных суставов (всего 53 сустава) - 20

суставной индекс Ричи (53 сустава) - 29

общий счет припухших суставов (44 сустава) - 10

оценка общей активности заболевания (5-бальная шкала)

врачом - 4

пациентом - 4

оценка боли пациентом (10-бальная шкала), ВАШ - 7

опросник состояния здоровья (HAQ) (обслуживание себя и выполнение домашней работы

счет группы - 21

Общий ан. крови от 13/IV - 04

СОЭ - 40 мм/ч

Hb - 127 г/л

ЭР - 4,2

L - 10,0

П - 7

Сег - 59

Э - 10

Б - 0

М - 8

Лм - 16

Биохимия крови от 14/IV - 04

Общ. Белок - 83 г/л

Мочевая кислота - 0,380 ммоль/л

Билирубин общ. - 9 мкмоль/л

Сыв. Fe - 9,6 мкмоль/л

Аст - 25 ме

Алт - 30 ме

Щелочная фосфатаза - 356 ме

Серомукоид - 0,211 у.е.

В иммунологическом ан. крови от 14/IV-04

СРБ - 96 мг/л

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 20 ме/мл

по Ваалер-Роузе - 1:80

ЦИК - 19 ед.оп.пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-А - 3,27 г/л

Ig-М - 2,39 г/л

Ig-G - 15,2 г/л

Rg - кистей от 13/IV - 04 сужение суставных щелей в дистальных и проксимальных м/ф суставах, пястно-фаланговых суставах, эрозия в основании средней фаланги III пальца левой кисти. Кистевидные просветления в шиловидных отростках с обеих сторон. Множественные кистевидные просветления в костях запястий, признаки анкилоза в обоих запястьях.

Rg - стоп от 13/IV - 04 двусторонний hallus valgus, грубо выраженный остеоартроз в I плюснефаланговых суставах стоп. Остеопороз плюснефаланговых суставов. Множественные кистевидные просветления в сочленяющихся отделах плюснефаланговых суставов, эрозии по медиальным поверхностям I плюснефалангового сустава справа.

23/IV - 04 больной проведено I введение МСК в дозе 100 млн в/в струйно. Введение прошло без осложнений. На третий день отмечена реакция в виде повышения температуры тела до 39°С (длительностью два дня), озноба, усиление болей в суставах, скованности в них. Далее в течение трех недель периоды самопроизвольного улучшения состояния сменялись эпизодами обострения суставного синдрома. Также отмечался подъем показателей активности воспаления. В анализе крови от 6/V - 04 СОЭ - до 47 мм/ч, L - до 14,1, СРБ - до 384 мг/л. Но с 18/V - 04 после увеличения дозы метипреда до 4 мг/сутки (от исходной дозы 2 мг/сутки) отмечена четкая положительная динамика в статусе: купировались отеки кистей, уменьшились боли в коленных, голеностопных суставах, нормализовалась температура тела. К середине VI - 04 (2 месяца от введения) у больной наступила относительная стабилизация состояния, что может быть не столь четко отразилось в динамике суставных индексов и ан. крови.

1. общий счет болезненных суставов (всего 53 сустава) - 19 (?)

2. суставной индекс Ричи (53 сустава) - 28 (?)

3. общий счет припухших суставов (44 сустава) - 3 (?)

4. оценка общей активности заболевания (5-бальная шкала)

врачом - 3 (?)

пациентом - 3 (?)

5. оценка боли пациентом (10-бальная шкала), ВАШ - 6 (?)

6. опросник состояния здоровья (HAQ) (обслуживание себя и выполнение домашней работы

счет группы - 26 (-)

7. Общий ан. крови от 8/VI - 04

СОЭ - 39 мм/ч

Hb - 137 г/л

ЭР - 5,1

L - 7,7 (?)

П - 1

Сег - 51

Э - 4

Б - 1

М - 6,9

Лм - 36

ТР - 230

8. Биохимия крови от 8/VI - 04

Общ. Белок - 80 г/л

Мочевая кислота - 0,290 ммоль/л

Билирубин общ. - 6,8 мкмоль/л

Сыв. Fe - 12,3 мкмоль/л

Аст - 28 ме

Алт - 40 ме

Щелочная фосфатаза - 313 ме

Серомукоид - 0,226 у.е.

9. В иммунологическом ан. крови от 8/VI-04

СРБ - 12 мг/л (?)

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 20 ме/мл

по Ваалер-Роузе - 1:80

ЦИК - 37 ед. оп. пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-A - 4,1 г/л

Ig-М - 3,95 г/л

Ig-G - 22,7 г/л

В течение лета 2004 г. у больной сохранялась достигнутая положительная динамика, она стала активнее, расширился объем выполняемой домашней работы, значительно уменьшилась скованность в суставах. Беспокоили умеренные артралгии в правом голеностопном, левом коленных суставах. В IX-04 по данным ан. крови СОЭ - 40 мм/ч, Hb - 152 г/л, сыв. Fe - 8,4 мкмоль/л, серомукоид - 0,150, СРБ - 12 мг/л, РФ по латекс-тесту - 1536 ме/мл, по Ваалер-Роузе - 1:320, ЦИК - 135 ед. оп. пл.

21/Х - 04 проведено II введение МСК. Было решено с целью проверки "дозозависимого" эффекта увеличить дозу однократного введения МСК до 300 млн в/в струйно. На данной дозе при введении у пациентки появились головокружения, слабость, тахикардия. На следующий день также отмечалась реакция обострения суставного синдрома, как и после I введения, сопровождавшаяся субфебрильной температурой тела, но в отличие от первого раза, период обострения длился не 1 мес, а 5 мес.

В контрольном ан. крови от 4/XI - 04

Общий ан. крови от 4/XI - 04

СОЭ - 53 мм/ч (-)

Hb - 148 г/л

ЭР - 5,2

L - 7,6

П - 1

Сег - 55

Э - 2

Б - 1

М - 8

Лм - 31

ТР - 253

Биохимия крови от 4/XI-04

Общ. Белок - 82 г/л

Мочевая кислота - 0,351 ммоль/л (-)

Билирубин общ. - 10,4 мкмоль/л

Сыв. Fe - 9,56 мкмоль/л

Аст - 23 ме

Алт - 24 ме

Щелочная фосфатаза - 314 ме

Серомукоид - 0,178 у.е. (?)

В иммунологическом ан. крови от 4/XI-04

СРБ - 192 мг/л(-)

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 384 ме/мл (?)

по Валер-Роузе - 1:320

ЦИК - 135 ед. оп. пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-А - 2,5 г/л

Ig-М - 3,43 г/л

Ig-G - 16,3 г/л (?)

Был сделан вывод о том, что повышение дозы МСК не приводит к более быстрой ремиссии заболевания и более тяжело переносится пациентом.

Больная продолжала получать метипред - 4 мг/сутки. К IV-05 (через 5 мес после введения) достигнута устойчивая нормализация температуры тела, уменьшилась припухлость суставов, исчезла скованность суставов по утрам, т.е., со слов больной: "вернулась к уровню комфорта" VI-04 (2 мес после I введения).

Суставные индексы в динамике от 28/VI-05 отразили хотя и незначительное, но снижение уровня болевого и воспалительного показателей.

1. общий счет болезненных суставов (всего 53 сустава) - 12 (?)

2. суставной индекс Ричи (53 сустава) - 30 (-)

3. общий счет припухших суставов (44 сустава) - 8 (-)

4. оценка общей активности заболевания (5-бальная шкала) врачом - 3

пациентом - 3

5. оценка боли пациентом (10-бальная шкала), ВАШ - 4 (?)

6. опросник состояния здоровья (HAQ) (обслуживание себя и выполнение домашней работы

счет группы - 23 (?)

7. Общий ан. крови от 28/VI-05

СОЭ - 42 мм/ч

Hb - 130 г/л

ЭР - 4,7

L - 7,4

П - 1

Сег - 56

Э - 4

Б - 1

М - 8

Лм - 30

ТР - 266

8. Биохимия крови от 28/VI-05

Общ. Белок - 78,3 г/л

Мочевая кислота - 0,343 ммоль/л

Билирубин общ. - 10,1 мкмоль/л

Сыв. Fe - 15,3 мкмоль/л

Аст - 30 ме

Алт - 31 ме

Щелочная фосфатаза - 380 ме

Серомукоид - 0,102 у.е. (?)

9. В иммунологическом ан. крови от 28/VI-05

СРБ - 96 мг/л (-)

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 384 ме/мл

по Ваалер-Роузе - 1:320

ЦИК - 27 ед. оп. пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-А - 3,0 г/л

Ig-М - 3,77 г/л

Ig-G - 13,25 г/л

10. На Rg-кистей и стоп от 28/VI-05 без отрицательной динамики за прошедший год.

Пациентка С., 1958 г.р.

С 24 лет страдает псориазом. С 1993 г. боли в крупных суставах. С 2001 г. артириты пястно-фаланговых суставов кистей, скованность в суставах кистей. Не обследовалась, не лечилась до II-03, когда при обследовании в пол-ке УдПрРФ выявлено в анализах крови: СРБ - 12 мг/л, серомукуид - 0,230 ед., СОЭ - 27 мм/ч, сыв. Fe 4,4 мкмоль/л, Hb - 111 г/л. на Rg - кистей от 20.III-03. эрозия по наружному краю левой ладьевидной кости, кистевидные просветления в костях запястий, в головках 1-х пястных костей. На Rg-костей стоп от 20.III-03 кистевидные просветления в головках плюсневых костей, в области основания проксимальной фаланги 1-го пальца правой стопы. На Rg-костей таза от II-03 крестцово-подвздошные сочленения не сужены. Тендиноз краев вертлужных впадин, крыльев подвздошных костей, больших вертелов. Сужение суставных щелей в латеральных отделах обоих тазобедренных суставах. Тени флеболитов в малом тазу.

Был поставлен диагноз: Псориатический артрит, активность - II, стадия - II, ФН - II. Был назначен метотрексат в дозе 10 мг/нед. в/м, кетопрофен 100 мг per rectum. Через 4 мес, в связи с отсутствием эффекта назначен лейкеран 2 мг/сутки, затем увеличение дозы до 4 мг/сутки. Сохранялась скованность в суставах, онемение пальцев рук, боли в коленных, голеностопных суставах. Через 3 мес переведена на азатиоприн 50 мг/сутки. К Х-03 г. достигнуто улучшение состояния в виде уменьшения болевого синдрома, уменьшения артритов пястно-фаланговых суставов кистей, снижения СОЭ до 16 мм/ч, увеличения Hb до 122 г/л, снижения серомукоида до 0,171 у.е. сохранялся повышенный СРВ - 48 мг/л. В этом же году впервые диагностирован сахарный диабет II типа, узловой зоб, по поводу чего получает сиофор, тиреокомб.

С XII-03 на терапии азатиоприном в дозе 50 мг/сутки рецидив артритов пястно-фаланговых суставов кистей, боли в коленных суставов, усиление кожных высыпаний в области крестца. Больная переведена на сульфасалазин 500 мг/сутки, далее на дозу 1000 мг/сутки. Достичь ремиссии не удавалось. В ан. Крови СОЭ - 27 мм/ч. L - 13,2, сыв. Fe - 7,7 мкмоль/л. В связи с отсутствием эффекта базисной терапии в III-04 отменены все препараты с целью подготовки к введению мезенхимальных стволовых клеток.

Исходные данные до введения МСК.

обший счет болезненных суставов (всего 53 сустава) - 13

суставной индекс Ричи (53 сустава) - 34

общий счет припухших суставов (44 сустава) - 5

оценка общей активности заболевания (5-бальная шкала)

врачом - 3

пациентом - 4

оценка боли пациентом (10-бальная шкала), ВАШ - 7

опросник состояния здоровья (HAQ) (обслуживание себя и выполнение домашней работы

счет группы - 12

Общий ан. крови от 12/IV-04

СОЭ - 19 мм/ч

Hb - 115 г/л

ЭР - 4,0

L - 6,4

П - 3

Сег - 63

Э - 1

Б - 0

М - 4

Лм - 29

Тр - 240 тыс.

Биохимия крови от 14/IV-04

Общ. Белок - 83 г/л

Мочевая кислота - 0,230 ммоль/л

Билирубин общ. - 6,5 мкмоль/л

Сыв. Fe - 9,3 мкмоль/л

Аст - 13 ме

Алт - 17 ме

Щелочная фосфатаза - 229 ме

Серомукоид - 0,137 у.е.

В иммунологическом ан. крови от 14/IV-04

СРБ - 6 мг/л

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 20 ме/мл

по Ваалер-Роузе - отр.

ЦИК - 4 ед. оп. пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-А - 2,79 г/л

Ig-М - 2,39 г/л

Ig-G - 9,05 г/л

Rg - кистей, стоп, костей таза см. описание в тексте выше.

23 IV-04 больной проведено I введение МСК в дозе 100 млн клеток в/в струйно. Введение прошло без осложнений. На 2-й день усилились боли в правом плечевом, правом локтевом суставах без повышения температуры тела. Через 2,5 нед. от введения началось уменьшение болей в суставах, вначале в правом плечевом, проксимальных м/ф суставах правой кисти, затем в коленных. К 23/V-04 (1 мес от введения) купировались отеки пястно-фаланговых суставов правой кисти, правого голеностопного сустава, уменьшалась скованность в суставах. При субъективном улучшении состояния к 24/VI-04 (2 мес от введения) отмечались признаки объективного улучшения суставных (индексов).

1. общий счет болезненных суставов (всего 53 сустава) - 11 (?)

2. суставной индекс Ричи (53 сустава) - 23 (?)

3. общий счет припухших суставов (44 сустава) - 5

4. оценка общей активности заболевания (5-бальная шкала) врачом - 2 (?)

пациентом - 2 (?)

5. оценка боли пациентом (10-бальная шкала),

ВАШ - 2 (?)

6. опросник состояния здоровья (HAQ) (обслуживание себя и выполнение домашней работы)

счет группы - 11 (?)

В анализах крови отмечалось небольшое повышение показателей активности

7. Общий ан. крови от 7/VI-04

СОЭ - 15 мм/ч

Hb - 151 г/л

ЭР - 4,1

L - 10,8 (-)

П - 1

Сег - 73

Э - 3

Б - 1

М - 5

Лм - 18

8. Биохимия крови от 9/VI-04 Общ.

Белок - 87 г/л

Мочевая кислота - 0,260 ммоль/л

Билирубин общ. - 8,1 мкмоль/л

Сыв. Fe - 11 мкмоль/л

ACT - 15 ме

Алт - 13 ме

Щелочная фосфатаза - 204 ме

Серомукоид - 0,293 у.е. (-)

9. В иммунологическом ан. крови от 9/VI-04

СРВ - 12 мг/л (-)

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 20 ме/мл

по Ваалер-Роузе - отр.

ЦИК - 26 ед. оп. пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-А - 3,91 г/л

Ig-М - 2,74 г/л (-)

Ig-G - 14,0 г/л

10. Rg - кистей, стоп, костей таза см. описание в тексте выше.

Сохранялся умеренный "блуждающий" характер болей в суставах с 27/VI-04 был добавлен к терапии метипред 2 мг утром. К IX-04 была достигнута практически полная ремиссия заболевания, которая длилась до XII-04 (6 мес улучшения). С XII-04 рецидив артралгий, артритов, пястно-фаланговых суставов кистей.

В общем ан. крови от 14/XII-04

СОЭ - 11 мм/ч

Hb - 122 г/л

ЭР - 5,0

L - 17,25 (-)

П - 1

Сег - 79

Э - 2

Б - 1

М - 4

Лм - 13,6

Тр - 451 (-)

Микроцитоз

В биохим. и иммун. ан. крови от 13/XII-04 без сдвигов.

Больная продолжала получать метипред, доза увеличена до 4 мг/сутки, боли в суставах нарастали.

16/III - 05 больной проведено II введение МСК в той же дозе - 100 млн в/в капельно. Повторное введение также перенесла удовлетворительно. В анализе крови накануне введения: СОЭ - 22 мм/ч, Hb - 122 г/л, L - 11,4, Тр - 444 тыс., серомукоид - 0,224. Остальные показатели без изменений.

Как и в первый раз на вторые сутки у больной отмечалось обострение артрита, которое протекало более остро, чем в первый раз и потребовало введения дипроспана 7 мг - 1 мл в/м однократно на фоне базисного приема метипреда - 4 мг/сутки. В данном случае тенденция к ремиссии появилась через 3 мес от введения, когда отметила снижение болей на 60%, стала активнее и бодрее.

Суставные индексы от 28/VI-05

1. общий счет болезненных суставов (всего 53 сустава) - 22 (-)

2. суставной индекс Ричи (53 сустава) - 20 (?)

3. общий счет припухших суставов (44 сустава) - 8 (-)

4. оценка общей активности заболевания (5-бальная шкала)

врачом - 2

пациентом - 2

5. оценка боли пациентом (10-бальная шкала), ВАШ - 2

6. опросник состояния здоровья (HAQ) (обслуживание себя и выполнение домашней работы)

счет группы - 9 (?)

В анализах крови отмечалось небольшое повышение показателей активности

7. Общий ан. крови от 23/VI-05

СОЭ - 18 мм/ч

Hb - 125 г/л

ЭР - 5,0

L - 10,0 (-)

П - 1

Сег - 72

Э - 3

Б - 1

М - 6

Лм - 17

Тр - 383 (?)

Микроцитоз, анизоцитоз

8. Биохимия крови от 23/VI-05

Общ. Белок - 72,3 г/л

Мочевая кислота - 0,301 ммоль/л

Билирубин общ. - 9,0 мкмоль/л

Сыв. Fe - 6,8 мкмоль/л

Аст - 17 ме

Алт - 16 ме

Щелочная фосфатаза - 237 ме

9. В иммунологическом ан. крови от 23/VI-05

СРБ - 6 мг/л (?)

Асл-о - 200 ме/мл

РФ - по латекс-тесту - 20 ме/мл

по Ваалер-Роузе - отр.

ЦИК - 74 ед. оп. пл.

Криоглобулины - отр.

Ig-А - 2,87 г/л

Ig-M - 1,8 г/л (?)

Ig-G - 9,7 г/л

10. На контрольных рентгенограммах кистей и стоп от 28/VI-05 без отрицательной динамики за прошедший год.

Изобретение относится к биофармакологии и медицине и касается получения культуры генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток и способа лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний. Биотрансплантат для лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Способ лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн в 50-100 мл физиологического раствора или инфукола. Изобретение обеспечивает длительную ремиссию аутоиммунных и ревматических заболеваний по данным клинической картины, положительную динамику иммунологических показателей, в случае ревматоидного и псориатичсского артрита - улучшение двигательной активности пациента. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК) от 50 до 500 млн, полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.2. Биотрансплантат по п.1, в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.3. Биотрансплантат по п.1, в качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.4. Биотрансплантат по п.1, в качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.5. Биотрансплантат по п.1 предназначен для внутривенного введения.6. Способ лечения аутоиммунных и ревматических заболеваний, характеризующийся тем, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат по п.1, включающий от 50 до 500 млн, мезенхимальных стволовых клеток.