СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, СТИМУЛЯЦИИ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ И РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ И ДЕКОРАТИВНЫХ РАСТЕНИЙ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения экологически безопасных биологических средств борьбы с заболеваниями растений, стимулирования их роста и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Борьба с болезнями растений, вызываемыми различными микроорганизмами, относится к важнейшим мероприятиям по их защите и охране. Что же касается сельскохозяйственных растений, то их защита от действия фитопатогенов представляет собой одно из основных звеньев комплекса мероприятий по повышению их урожайности. Следует заметить, что заболевания микробного происхождения наносят значительный, а иногда катастрофический ущерб при выращивании как декоративных, так и сельскохозяйственных культур.

Главная цель применения регуляторов роста - повышение урожайности, устойчивости к полеганию и экстремальным факторам окружающей среды, стимулирование прорастания семян, особенно при пониженных температурах и других неблагоприятных условиях.

Большое значение в борьбе с болезнями растений и повышением урожайности сельскохозяйственных культур имеет выведение и возделывание устойчивых и высокопродуктивных сортов. Однако создание таких сортов требует длительного времени. Кроме того, в процессе эволюции в природе возникают все новые формы фитопатогенных организмов. Защита растений от болезней химическими методами и применение регуляторов роста химической природы в настоящее время вызывает большое беспокойство со стороны экологических служб, т.к. химические средства защиты растений эффективны далеко не против всех болезней. Помимо этого химические вещества накапливаются в почвах и загрязняют пищевые продукты и окружающую среду. Ко многим химическим препаратам вредители уже приобрели устойчивость. Эти средства защиты лишены избирательности действия и опасны для всей фауны наземных членистоногих - опылителей и хищников. Многие из химических препаратов высоко токсичны для теплокровных и человека (1-3 классы опасности).

В связи с этим значительный интерес представляют биологические методы борьбы с болезнями растений и стимуляции роста. Главное преимущество биологического метода защиты растений - высокая избирательность. Биологические средства позволяют регулировать численность одного вида или группы видов, не затрагивая природные комплексы полезных организмов. Особенно важно то, что они не оказывают неблагоприятного действия на здоровье человека.

В настоящее время известно достаточно большое количество биопрепаратов для защиты растений и стимуляции роста на основе микроорганизмов (патенты РФ №2019966, 2069953, 2084152, 2086128, 2104645, 2120775, 1792614). Предлагаются также комплексные биопрепараты на основе ассоциации микроорганизмов разного систематического положения (патенты РФ №2170510, 2149552). В основе действия всех известных биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенов лежат существующие в природе естественные явления паразитизма или антагонизма между микроорганизмами, обитающими на растениях и в почве.

Среди биопрепаратов особо выделяют препараты, полученные на основе бактерий р.Pseudomonas, особенно представителей флуоресцирующей группы Р.aeruginosa и P.fluorescens. Бактерии р.Pseudomonas являются постоянными обитателями ризосферы разнообразных растений. Для них давно известна способность к денитрификации, а недавно признана их способность проводить азотфиксацию. Данные виды псевдомонад относятся к наиболее активным видам миколитических бактерий, т.е. видам, оказывающим литическое действие на многие почвенные грибы, в т.ч. фитопатогенные. Антагонистические свойства данных бактерий обусловлены не только синтезом антибиотиков, они образуют сложный комплекс веществ, включающий антибиотические вещества, белковые соединения и пептиды группы бактериоцинов и микроцинов, литические ферменты, сидерофоры и другие биологически активные соединения. Установлено, что важную роль в защите растений от инфекции играют такие свойства псевдомонад, как способность к активной колонизации корневой системы и вытеснение тем самым из ризосферной зоны фитопатогенных микроорганизмов.

Известны биопрепараты на основе бактерий Pseudomonas для защиты растений от грибных фитопатогенов. Патенты РФ №2154943, 2104645 описывают препараты на основе бактерий Р.fluorescens. В патенте РФ №2121271 описан препарат на основе бактерий Р.lemoignei. В патентах №№2130261, 2130262, 2069953 - препараты на основе бактерий Р.species. Все вышеперечисленные биопрепараты активны против широкого спектра заболеваний растений (пероноспороз, антрокноз, черная ножка, серая и белая гниль, фузариоз), вызываемых фитопатогенными грибами Pythium, Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Phytophtora и др.

Помимо веществ антибиотической природы флюоресцирующие виды псевдомонад синтезируют вещества, стимулирующие прорастание семян и рост растений (патент РФ №2130261).

В патенте РФ №2051586 предлагается препарат для стимуляции роста растений на основе штамма бактерий Pseudomonas putida ВКПМ-4308. Стимулирующий эффект достигается путем замачивания семян растений в суспензии штамма в концентрации 1,5·10⁶-1,5·10⁷ клеток на 1 грамм семян. Штамм не снижает всхожести семян, хорошо сохраняется в почве и ризосфере растений, может размножаться в этих условиях. Стимулирующее действие штамма зарегистрировано в отношении 9-ти технических культур (люпина, сои, фасоли, вики, чумизы, тыквы, клевера и рапса), 7-ми зерновых (кукурузы, овса, пшеницы, ячменя, проса, ржи и гречихи), а также в отношении ряда овощных культур (томата, редиса, огурцов, салата, свеклы и картофеля). Штамм оказывает стимулирующее действие как на рост корневой системы, так и на рост надземной части растений.

Таким образом, в настоящее время создано достаточно много биологических препаратов для стимулирования роста растений и защиты их от различных заболеваний. Однако поиск новых высокоэффективных штаммов является актуальной задачей, т.к. позволяет не только получить новый биопрепарат с новыми свойствами, но и значительно снизить затраты на его производство.

Наиболее близким к заявленному изобретению является биопрепарат, описанный в Евразийском патенте №003389. Согласно данному изобретению биопрепарат разработан на основе штамма бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692 и предназначен для защиты растений от болезней и стимуляции роста. Препарат получают путем выращивания штамма бактерий на минеральной среде следующего состава: пептон - 20 г, глицерин - 8 мл, сульфат магния - 1,5 мг, фосфат калия двузамещенный - 1,5 мг, вода - 1 л. Культивирование ведут при температуре 30°С в течение 48 часов при перемешивании и аэрации. Полученная суспензия бактерий является концентрированным биопрепаратом, который далее используется для приготовления рабочего раствора, которым обрабатывают почву, семена и растения. Однако в состав данной среды входят такие компоненты как пептон и глицерин, что значительно повышает стоимость препарата.

Задачей изобретения является разработка способа получения нового биопрепарата, при использовании которого может быть достигнут технический результат, заключающийся в обеспечении снижения затрат на его производство.

Данный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе получения нового биопрепарата качестве питательной среды для культивирования штамма-продуцента используется отход крахмалопаточного производства (гидрол) и кукурузный экстракт, при этом время ферментации сокращается до 36 часов.

Сущность изобретения заключается в следующем: на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и микроэлементы, в условиях аэрации и перемешивания выращивают бактерии Pseudomonas putida штамм ВСБ-692. В качестве источника углерода используют отход крахмалопаточного производства (гидрол), в качестве источника азота используют кукурузный экстракт. Выращивание ведут при температуре 30°С в течение 30-36 часов. В результате получают концентрированный биопрепарат, который далее используется для приготовления рабочего раствора. Рабочий раствор используют для корневой и внекорневой обработки растений, обработки почвы и семян.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения:

Пример 1.

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692 выращивали в колбах на качалке на минеральной среде следующего состава: гидрол - 6 г/л, кукурузный экстракт 4 г/л, сульфат магния - 1,5 г, фосфат калия двузамещенный - 1,5 г, вода - 1,0 л. рН среды 7,0-7,2. Время выращивания 36 часов, температура 30°С. Далее в полученную суспензию добавляли бензоат натрия в количестве 0,6%. Данный раствор является концентрированным биопрепаратом.

Рабочий раствор готовили следующим образом: 10 мл концентрированного биопрепарата разводили в 1 л воды.

Ростстимулирующую активность препарата проверяли на огурцах сорта «Водолей». Обработка препаратом включала следующие этапы: обработку почвы перед посадкой семян, замачивание семян в рабочем растворе перед посадкой в течение 2-х часов, полив растений в период вегетации на стадии 2-х семидольных, 1-го настоящего и 2-х настоящих листьев. Стимулирующий эффект препарата определяли путем взвешивания корневой системы рассады через 25 суток от посева семян. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Влияние биопрепарата на корнеобразование огурца «Водолей»Варианты биопрепаратаВес корневой системы растений, гпрототип0,1025заявленный вариант0,2941

Пример 2.

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692 выращивали в колбах на качалке на минеральной среде следующего состава: гидрол - 4,0 г/л, кукурузный экстракт 6,5 г/л, сульфат магния - 1,5 г, фосфат калия двузамещенный - 1,5 г, вода - 1,0 л. рН среды 7,0-7,2. Время выращивания 30 часов, температура 30°С. Далее в полученную суспензию добавляли бензоат натрия в количестве 0,6%. Данный раствор является концентрированным биопрепаратом.

Рабочий раствор готовили следующим образом: 10 мл концентрированного биопрепарата разводили в 1 л воды.

Антоганистическую активность препарата проверяли в отношении тест-культуры Bacillus subtilis. Препарат наносили в лунки на твердую агаризованную среду, на которой предварительно была засеяна газоном тест-культура. После инкубирования засеянных чашек Петри в течение 48 часов при температуре 30°С измеряли величину зоны ингибирования роста тест-культуры. Размер зоны ингибирования роста бактерий Bacillus subtilis определяли от края "лунки" до начала роста тест-культуры. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2
Влияние биопрепарата на рост тест-культуры Bacillus subtilisВарианты биопрепаратаРазмер зоны ингибирования роста тест-культуры Bacillus subtilis, ммпрототип8,0-9,0заявленный вариант9,5-10,0

Время ферментации в предлагаемом изобретении составляет 30-36 часов, что обусловлено составом питательной среды для культивирования штамма бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692. При уменьшении времени ферментации отмечалось недостаточное накопление в среде антибиотических и ростстимулирующих растений веществ. При увеличении времени ферментации отмечались лизис культуры и разрушение данных биологически активных веществ.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения экологически безопасных биологических средств борьбы с заболеваниями растений, стимулирования их роста и повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Способ включает выращивание на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и микроэлементы, в условиях аэрации и перемешивания бактерий Pseudomonas putida штамм ВСБ-692. В качестве источника углерода используют гидрол, в качестве источника азота используют кукурузный экстракт. Выращивание ведут при температуре 30°С в течение 30-36 часов. В результате получают концентрированный биопрепарат, который далее используется для приготовления рабочего раствора. Рабочий раствор используют для корневой и внекорневой обработки растений, обработки почвы и семян. Способ позволяет повысить ростстимулирующую и антимикробную активность биопрепарата. 2 табл.

Способ получения биопрепарата для защиты растений от болезней, стимуляции корнеобразования и роста сельскохозяйственных и декоративных растений, включающий культивирование штамма бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и микроэлементов, в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что в питательную среду вводят в качестве источника углерода гидрол, а в качестве источника азота - кукурузный экстракт, при этом продолжительность ферментации составляет 30-36 ч.