ШТАММ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ, И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ Российский патент 2014 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями, обладающего нитрогеназной (способностью к фиксации атмосферного азота) и ростстимулирующей активностью. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и повышения урожайности.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2] и Pseudomonas putida BKM B-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

Наиболее близкими к заявляемому является штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 [4, 5], обладающие способностью оказывать антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями. Недостатком штаммов является их сравнительно невысокая антагонистическая активность и неспособность к фиксации атмосферного азота и синтезу ростстимулирующих веществ, т.е. отсутствие комплексности воздействия на фитопатогены и растения.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, в том числе и твердой головни, обладающего нитрогеназной и ростстимулирующей активностью.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas sp. ИБ-4, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов с регистрационным номером ВКМ В - 2830D.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: KH₂PO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.

1.2. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; СаСО₃ - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; рН 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 48 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.

1.3. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·10¹⁰ кл/мл.

Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Для сравнения продуктивности нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 с известными штаммами Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 проводили выращивание в колбах на качалке при температуре 28-30°C в течение 48 ч в условиях аэрации на жидкой питательной среде LB следующего состава, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 10,0; вода водопроводная до 1 л. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о более высокой продуктивности предлагаемого штамма, чем у штаммов по прототипу. Высокое значение продуктивности предлагаемого штамма отмечено и при культивировании на других питательных средах (табл. 2).

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4.

На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas sp. ИБ-4. Чашки инкубируют при 28°C в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл. 3 и свидетельствуют о широком спектре и высокой величине антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5·10⁴ КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 1 кг семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.4.

Пример 4. Антагонистическое действие штамма против возбудителя твердой головни пшеницы испытывали на пшенице сорта "Жница", искусственно зараженной Tilletia caries, в условиях закрытого грунта в теплице. Заспорение спорами твердой головни осуществляли из расчета 1-2 г спор на 1 кг зерна. Семена пшеницы обрабатывали суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян и высаживали в вегетационные сосуды по 60 штук с учетом всхожести данного сорта пшеницы. В контрольных экспериментах обработку семян осуществляли водопроводной водой. Эксперименты выполняли в трехкратной повторности.

Эффективность штамма определяли при сопоставлении степени проявления заболевания растений твердой головней в опыте и контроле в период молочно-восковой спелости зерна. Результаты приведены в табл.5.

Как свидетельствуют результаты эксперимента, биологическая эффективность подавления твердой головни на пшенице у штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 составляет 60,0%, при 52,7% у выбранного аналога.

Пример 5. Определение ростстимулирующей активности заявляемого штамма.

Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие ростстимулирующей активности микроорганизма. Образование заявляемым штаммом цитокининов с концентрацией 300 нг/мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [6].

Пример 6. Штамм Pseudomonas sp. ИБ-4 обладает нитрогеназной активностью (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов рода Azotobacter (табл. 6), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [7-10].

Таким образом, выделен новый штамм Pseudomonas sp. ИБ-4 с широким спектром и величиной антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, в том числе против возбудителя твердой головни Tilletia caries, обладающий высокой продуктивностью, нитрогеназной и ростстимулирующей активностью, что в целом позволяет увеличить урожай в 1,84 раза.

Таблица 1 Продуктивность штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 на среде LB Штамм Время ферментации, ч Число жизнеспособных клеток (КОЕ), млрд/мл Pseudomonas sp. ИБ-4 48 10 ИБ 51 (по прототипу) 48 1 ИБ 17 (по прототипу) 48 1

Таблица 2 Титр микроорганизмов Pseudomonas sp. ИБ-4 при культивировании на различных питательных средах (КОЕ), млрд/мл Питательная среда Время ферментации, ч 24 36 48 КГА 0,1 2,2 21 Федорова 0,4 2,8 33 С-40 0,4 5,5 95

Таблица 3 Антагонистическое действие штаммов Pseudomonas sp. ИБ-4 и штаммов по прототипу на грибные фитопатогены Вид фитопатогенных грибов Диаметр зоны подавления роста гриба, мм Штаммы Pseudomonas sp. ИБ-4 ИБ 51 ИБ 17 Fusarium culmorum 29 9 14 Fusarium gibbosum 28 35 12 Fusarium graminesrum 28 7 26 Fusarium nivale 33 31 12 Fusarium semitectum 32 9 26 Fusarium solani 18 9 12 Bipolaris sorokiniana 49 55 22 Penicillium funiculosum 33 31 14 Fusarium oxysporum 32 29 - Alternaria altemata 48 19 18

Таблица 4 Эффективность нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 против корневых гнилей пшеницы Варианты опытов Развитие болезни проростков пшеницы, % Altemaria + Penicillium Bipolaris sorokiniana Fusarium oxysporum Контроль 28,0 6,3 2,2 ИБ 51 (Прототип) 16,0 4,3 0,0 ИБ 17 (Прототип) 16,0 4,8 0,7 Paenibacillus sp. ИБ-1 12,0 4,0 0,0

Таблица 5 Эффективность нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 против твердой головни пшеницы Варианты опытов Пораженность твердой головней, % Биологическая эффективность подавления болезни, % Вес валового урожая по отношению к контролю, % Контроль 55,0 - 100,00 ИБ 51 (Прототип) 26,0 52,7 173,5 Paenibacillus sp. ИБ-1 22,0 60,0 184,0

Таблица 6 Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 и свободноживущих азотфиксаторов Культура Нитрогеназная активность, мкг N₂/мл/час Pseudomonas sp. ИБ-4 0,68 Azotobacter chroococcum В 35 [8] 0,26 Azotobacter chroococcum Ш 25 [9] 0,45 Azotobacter chroococcum Ц 40 [10] 0,11 Azotobacter chroococcum Б 1 [11] 0,22

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.

3. Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993.

4. Патент RU №2203945, кл. C12N 1/20, 2003.

5. Патент RU №2213774, кл. C12N 1/20, 2003.

6. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.

7. Патент RU №2074159, кл. C05F 11/08, 1997.

8. Патент RU №2074158, кл. C05F 11/08, 1997.

9. Патент RU №2074157, кл. C05F 11/08, 1997.

10. Патент RU №2076088, кл. C05F 11/08, 1997.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Pseudomonas sp. ИБ-4 обладает высокой продуктивностью, нитрогеназной и ростстимулирующей активностями. Штамм бактерий Pseudomonas sp. депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2830D и может быть использован при получении биопрепарата для снижения заболеваемости растений, вызываемой фитопатогенными грибами, и повышения урожайности растений. Изобретение позволяет повысить урожай пшеницы., 6 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Pseudomonas sp., депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2830D, для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами, и повышения урожайности.