СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ Российский патент 2006 года по МПК A23L1/30 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активной добавки для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний различной этиологии для всех видов сельскохозяйственных животных и птицы.

Известен способ получения пробиотика, заключающийся во внесении штаммов молочнокислых бактерий в питательную среду, культивировании, концентрировании бактериальной массы с последующей сушкой (см. RU 2063755 С1, 20.07.1996). Недостатком данного способа является сложность технологического процесса, высокие затраты.

За прототип выбран патент RU 2035184 С1, 20.05.1995, в котором описан способ получения бактериального препарата для производства кормовой добавки, предусматривающий приготовление питательной среды, внесение в нее культуры лактобактерий, бифидобактерий и мезофильного молочнокислого стрептококка, культивирование, отделение бактериальной массы центрифугированием, смешивание полученной бактериальной массы с защитной средой с последующей сублимационной сушкой.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового способа получения биологически активной добавки для стимуляции естественной резистентности и повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, экономичного и высокоэффективного при применении в хозяйствах. Технический результат заключается в получении дешевого препарата, удобного при хранении, транспортировке, применении, с высокими антагонистическими свойствами по отношению к патогенной микрофлоре, с высокой концентрацией жизнеспособных клеток, безвредным, не имеющим возрастных ограничений.

Технический результат достигается благодаря тому, что для получения биологически активной добавки в качестве культуры лактобактерий используют лиофильно высушенные штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ В-3488), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141), Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В-3961), депонированные во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Сначала культивированию подвергают штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ В-3488) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141) в равном соотношении по 3-4 мас.%, которые вносят в питательную среду, в качестве которой используют осветленную молочную сыворотку с добавлением 1,0 мас.% дрожжевого экстракта, сернокислого марганца - 160 мг/л, фосфорнокислого калия - 0,1 мас.%. Наращивают биомассу лактобактерий методом глубинного культивирования в течение 12-13 ч при температуре 44±1°С. В процессе культивирования рН среды корректируют газообразным аммиаком. Нейтрализацию проводят два раза до достижения рН 5,9-6,2. Затем через 2-3 ч от начала культивирования в среду вносят штамм Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В-3961) и по 1-му мас.% от объема питательной среды - обезжиренное молоко и 40%-ный раствор глюкозы и продолжают культивирование в течение 12-13 ч. Перед окончанием культивирования вносят 2 мас.% лимонно-кислого натрия и начинают охлаждение среды до температуры 15-18°С. Охлажденную биомассу подвергают центрифугированию при 16 000 об/мин. Концентрированную бактериальную массу смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой (10 мас.% сахарозы и 1 мас.% желатина) с добавлением 0,1-0,5 мас.% йодистого калия в соотношении 1:8 и фасуют по 5 мл в пенициллиновые флаконы. Сублимационную сушку проводят с предварительным замораживанием в течение 4-5 ч до температуры минус 40-45°С при вакууме не ниже 7 млВ и температуре испарителя минус 45-60°С, причем подогрев полок начинают с плюс 15-20°С. И с момента выхода продукта на плюсовую температуру досушивание продолжают в течение 10-12 ч при температуре не более 40°С, общая продолжительность сушки составляет 24-28 ч при остаточной влажности целевого продукта не более 3 мас.%.

Сущность предлагаемого способа заключается во внесении штаммов культур лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ В-3488) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141) в равном соотношении по 3-4 мас.% в питательную среду, в качестве которой используют осветленную молочную сыворотку с добавлением 1,0 мас.% дрожжевого экстракта, сернокислого марганца - 160 мг/л, фосфорнокислого калия - 0,1 мас.%. Наращивают биомассу методом глубинного культивирования в промышленных ферментерах в течение 12-13 ч при температуре 44±1°С. В процессе культивирования рН среды корректируют газообразным аммиаком. Нейтрализацию проводят два раза до достижения рН 5,9-6,2. Затем через 2-3 ч от начала культивирования в среду вносят Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В-3961) и по 1-му мас.% от объема питательной среды - обезжиренное молоко и 40%-ный раствор глюкозы. Затем продолжают культивирование в течение 12-13 ч. В питательную среду вносят 2 мас.% лимонно-кислого натрия и охлаждают до 15-18°С. Охлажденную биомассу подвергают цетрифугированию при 16000 об/мин. Полученную концентрированную бактериальную массу смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой (10 мас.% сахарозы и 1 мас.% желатина) с добавлением 0,1-0,5 мас.% йодистого калия в соотношении 1:8 и фасуют в пенициллиновые флаконы. Сублимационную сушку проводят по подобранному опытным путем режиму.

Пример 1. Готовят питательную среду, содержащую осветленную молочную сыворотку, освобожденную от белков термокислотным способом (осветленную), добавляют дрожжевой экстракт в количестве 1,0 мас.%, сернокислый марганец - 160 мг/л, сернокислый аммоний - 0,1 мас.%, фосфорнокислый калий - 0,1 мас.%. Доводят объем питательной среды осветленной сывороткой до 1 л. В полученную питательную среду вносят штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ В-3488) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141) в равных соотношениях в количестве по 3,0 мас.% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют глубинным методом при температуре 43°С в течение 12 ч. В процессе культивирования рН среды корректируют 40%-ным раствором едкого натрия. Проводят двукратную нейтрализацию до достижения рН среды 5,9. Затем через 2 ч от начала культивирования в среду вносят штамм Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В-3961) в количестве 3,0 мас.% и по 1-му мас.% от объема питательной среды - обезжиренное молоко и 40%-ный раствор глюкозы. Затем продолжают культивирование в течение 12 ч, а перед окончанием культивирования вносят 2 мас.% лимонно-кислого натрия и начинают охлаждение среды до 15°С. Охлажденную биомассу подвергают центрифугированию при 16000 об/мин. Полученную концентрированную бактериальную массу смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой, содержащей 10 мас.% сахарозы и 1 мас.% желатина с добавлением 0,1 мас.% йодистого калия в соотношении 1:8. Фасуют в пенициллиновые флаконы и подвергают сублимационной сушке. Общая продолжительность сушки составляет 24 ч.

Концентрация жизнеспособных клеток лактобактерий в полученной биологически активной добавке составляет 13×10⁹ KOE/г.

Пример 2. В 1 л осветленной молочной сыворотки добавляют дрожжевой экстракт в количестве 1,0 мас.%, сернокислый марганец - 160 мг/л, сернокислый аммоний - 0,1 мас.%, фосфорнокислый калий - 0,1 мас.%. В полученную питательную среду вносят штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ В-3488) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141) в равных соотношениях в количестве по 3,5 мас.% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют глубинным методом при температуре 43°С в течение 13 ч. В процессе культивирования рН среды корректируют газообразным аммиаком. Проводят двукратную нейтрализацию до достижения рН среды 6,0. Затем через 3 ч от начала культивирования в среду вносят штамм Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В-3961) в количестве 3,0 мас.% от объема питательной среды и по 1-му мас.% от объема питательной среды - обезжиренное молоко и 40%-ный раствор глюкозы. Продолжают культивирование в течение 12 ч. В питательную среду перед окончанием культивирования вносят 2 мас.% лимонно-кислого натрия и охлаждают среду до 15°С. Охлажденную биомассу подвергают центрифугированию при 16000 об/мин. Полученную концентрированную бактериальную массу смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой, содержащей 10 мас.% сахарозы и 1 мас.% желатина с добавлением 0,1 мас.% йодистого калия в соотношении 1:8. Фасуют в пенициллиновые флаконы и подвергают сублимационной сушке. Общая продолжительность сушки 27 ч.

Концентрация жизнеспособных клеток лактобактерий в полученной биологически активной добавке составляет 13×10⁹ KOE/г.

Пример 3. В 1 л осветленной молочной сыворотки добавляют дрожжевой экстракт в количестве 1,0 мас.%, сернокислый марганец - 160 мг/л, фосфорнокислый калий - 0,1 мас.%. В полученную питательную среду вносят штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ В-3488) и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141)в равных соотношениях в количестве по 4,0 мас.% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют глубинным методом при температуре 43°С в течение 13 ч. В процессе культивирования рН среды корректируют газообразным аммиаком. Проводят двукратную нейтрализацию до достижения рН среды 6,2. Затем через 2 ч от начала культивирования в среду вносят штамм Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В-3961) в количестве 3 мас.% от объема питательной среды и по 1-му мас.% от объема питательной среды - обезжиренное молоко и 40%-ный раствор глюкозы. Продолжают культивирование в течение 12 ч. Перед окончанием культивирования в питательную среду вносят 2 мас.% лимонно-кислого натрия и охлаждают до 15°С. Охлажденную биомассу подвергают центрифугированию при 16000 об/мин. Полученную концентрированную бактериальную массу смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой, содержащей 10 мас.% сахарозы и 1 мас.% желатина с добавлением 0,5 мас.% йодистого калия в соотношении 1:8. Фасуют в пенициллиновые флаконы и подвергают сублимационной сушке. Общая продолжительность сушки составляет 28 ч.

Концентрация жизнеспособных клеток лактобактерий в полученной биологически активной добавке составляет 6×10¹⁰КОЕ/г.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом имеет следующие преимущества:

- сокращенные сроки культивирования и сублимационной сушки, высокая концентрация лактобактерий и их сохранность в неизменном виде не менее 12 месяцев, низкая себестоимость и высокая окупаемость, удобство в транспортировке, хранении, простота применения. Способ позволяет получить биологически активную добавку экологически безопасную, входящие в ее состав бактерии - пробиотики отличаются повышенной осмотолерантностью, высокой колонизационной активностью и способностью к адгезии к эпителиальным клеткам, осуществляют синтез аминокислот, ферментов, участвуют в общем метаболизме, подавляют развитие патогенной микрофлоры, ускоряют процесс переваривания и усвоения кормов, способствуют формированию местного локального иммунитета на слизистой кишечника, устраняют иммунодефицит, развивающийся на фоне дисбактериозов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных добавок для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний различной этиологии для всех видов сельскохозяйственных животных и птиц. Способ предусматривает внесение культур лактобактерий Lactobacillus acidophilus Г-1 (ВКПМ-В 3488), Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus Л 20/2 (ВКПМ В-3141), взятых в равном соотношении в питательную среду, содержащую осветленную молочную сыворотку, дрожжевой экстракт, сернокислый марганец, фосфорнокислый калий. Биомассу лактобактерий наращивают методом глубинного культивирования при температуре 44±1°С. В процессе культивирования корректируют рН среды и проводят двукратную нейтрализацию. Затем через 2-3 ч от начала культивирования в питательную среду вносят Lactococcus lactis subsp. lactis III (ВКПМ В 3961), обезжиренное молоко, 40%-ный раствор глюкозы и продолжают культивирование. Перед окончанием культивирования вносят лимоннокислый натрий и охлаждают. Охлажденную биомассу отделяют центрифугированием. Концентрированную биомассу смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой с добавлением йодистого калия. Фасуют в пенициллиновые флаконы и подвергают сублимационной сушке. Изобретение позволяет получить дешевый безвредный препарат, удобный при хранении, транспортировке, применении, с высокими антагонистическими свойствами по отношению к патогенной микрофлоре, повысить концентрацию жизнеспособных клеток.

Способ получения биологически активной добавки, включающий внесение культуры лактобактерий в питательную среду, культивирование, концентрирование бактериальной массы центрифугированием, смешение полученной бактериальной массы с сахарозо-желатиновой защитной средой с последующей сублимационной сушкой, отличающийся тем, что в качестве культуры лактобактерий используют Lactococcus lactis subsp. lactis III, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2, Lactobacillus acidophilus Г-1, причем сначала вносят Lactobacillus acidophilus Г-1 и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Л 20/2 в равном соотношении в питательную среду, содержащую осветленную молочную сыворотку, дрожжевой экстракт в количестве 1,0 мас.%, сернокислый марганец - 160 мг/л, фосфорнокислый калий - 0,1 мас.%, культивирование проводят при температуре (44±1)°С, в процессе культивирования рН среды корректируют газообразным аммиаком, нейтрализацию проводят до достижения рН 5,9-6,2, причем через 2-3 ч от начала культивирования в среду вносят Lactococcus lactis subsp. lactis III и по 1% от объема питательной среды обезжиренное молоко и 40%-ный раствор глюкозы и продолжают культивирование в течение 12-13 ч, в защитную среду дополнительно вводят 0,1-0,5 мас.% йодистого калия, а сублимационную сушку ведут в течение 24-28 ч до остаточной влажности не более 3%.